העבודה שלנו היא נתמכת על ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה. ברצוננו להודות לפרופ &#39;Tamotsu Yoshimori לחביבות לספק לנו עם פלסמיד לביטוי של CFP-LC3.

1. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר מעבר הנמוך של תאי זרע HEK-293T להביע ביציבות ה-GFP-DFCP1 על 22 מ&quot;מ coverslips עגול, תאי תרבות לילה בבינוני של Dulbecco הנשרים שונים (DMEM), לconfluency של 30-40% (למטרת confluency של 80% לאחר 2 ימים - יום של הדמיה תא חי). </li></ol> 2. Transfection הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את התערובת המורכבת transfection לכל צלחת, המכיל OptiMEM μl 100 שהפחתי בינוני סרום, 3 מגיב Transfection DNA μl X-tremeGENE 9, ו0.5 מיקרוגרם של pECFP-LC3 פלסמיד דנ&quot;א. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה והדגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. [הערה: יש לנו שוב ושוב כי מצאנו ריאגנטים transfection אחרים, כגון Lipofectamine 2000, יש לי הרבה של רעילות, ובנוסף, הם מייצרים חלקיקי ניאון בעצמם שמפריעים לשיטות מיקרוסקופיה רבות.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מהצלחות ולהוסיף טרי DMEM מראש התחמם ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טראןsfection המורכב לתאים על ידי pipetting; תאי דגירה למשך 24 שעות. </li></ol> 3. דגירה סלולרי עם מרקר אברון (אופציונלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף MitoTracker / Lysotracker לDMEM בריכוז סופי של 75 ננומטר, ולשמור על קרח, בצינור פלקון מכוסה ברדיד אלומיניום, לאורך כל היום, ניסיוני, כדי להימנע מחשיפה לאור והקפאה חוזרת ומחזורי הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר aliquot של 2 מ&quot;ל של מדיום המכיל Lysotracker MitoTracker / ולהתחמם על 37 מעלות צלזיוס, לשאוב ממדיום תאי transfected ולהחליף עם MitoTracker / Lysotracker המכילים בינונית ותאי דגירה במשך 30 - 60 דקות. </li></ol> 4. הכנה של תא דגירה הדמיה תא חי (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי מתכת ופלסטיק O-טבעות עם אתנול 75% ולמרוח משחה סיליקון על שפת מתכת O-Ring. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להסיר coverslip מהצלחת ולייבש את העודפים של מדיום מהצד התחתון של coverslip,כדי להימנע מערבוב מדי בינונית עם השומן, כמו זה יגדיל את הסבירות לדליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את coverslip לנוח על האדן של O-טבעת הפלסטיק והמתכת תתאים טבעת O על גבי O-טבעת הפלסטיק, עם coverslip דחוקה שביניהם, על מנת ליצור תא סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא עליון עם המדיום מהצלחת; מנקודה זו והלאה, למנוע דגירה ממושכת של התאים במדיום DMEM ללא סוכן חציצה, כדי למנוע שינויים בחומציות להתרחש, שכן מערכת חיץ סודה לDMEM דורשת ריכוז CO 2 מלאכותי של 5-10% וריכוז CO 2 מאוויר הסביבה הוא הרבה יותר נמוך. </li></ol> 5. רעב של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את תא הדגירה על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום השלם ולשטוף עם 2 מ&quot;ל של מדיום רעב 3 פעמים, כדי לוודא ששום חומצות אמינו נותרו מDMEM, שסופו של דבר לעכב את תגובת autophagy; להגדירשעון עצר. </li></ol> 6. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת הדמיה מתאימה מוגדרת לתא חי רחב בתחום הקרינה עלית תידרש. זה יהיה בדרך כלל מהווה מסגרת מיקרוסקופ הפוכה מחקר בכיתה, אינטנסיביים ספקטרום רחב מקור אור, מראות ומסננים ספציפיות לחלבון פלואורסצנטי (ים) / הצבע (ים) של עניין, עדשה אובייקטיבית באיכות גבוהה, CCD / sCMOS רגיש מצלמה ותא דגירה. כל היצרנים הגדולים מציעים מערכות מיקרוסקופ שדה רחבות מלאות מתאימים להדמית תא חי, אבל זה אפשרי גם לבית לבנות מערכת תוך שימוש ברכיבים ממגוון רחב של יצרנים ולשלוט בו באמצעות תוכנות קוד פתוחות כגון מיקרו מנהל <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">(http: / / Valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki /).</a> ההיבט החשוב ביותר לדעתנו הוא להשתמש במערכת של רגישות גבוהה, כך שיכולות להיות כל הזמן את רמות הביטוי של כתבי הניאון למינימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סילecting התאים המתאימים לתמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים גדולים ושטוחים שיאפשר אירועי היווצרות autophagosome יותר להיות בשבי. כמו כן, לבחור עבור תאים שכבר התחילו לייצר מספר גדול יותר של omegasomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לכידת וידאו לאחר 30 דקות או גם לתוך תגובת autophagy, על מנת ללכוד את יחס גדול יותר של אירועי היווצרות autophagosome לוידאו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעדשת ההגדלה גבוהה (100x 1.4 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת אור עירור ל10-20% ממקסימום כדי למנוע הלבנת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המצלמה (Hamamatsu ORCA ER, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר) ל100-500 חשיפת אלפיות שנייה, binning 2x2 ו100 רווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר קצב רכישת תמונה למסגרת 1 בכל 10 שניות. </li></ol></li></ol> 7. יצירת מצרפי תמונות של אירועי גיבוש Autophagosome עם ImageJ [ניתן לעשות זאת בצורה שאינה שיטתית, פשוט על ידי סריקת וידאו הממוזג לדוארפתחי אוורור של עניין, אבל זה גם יכול להיות שיטתי כמפורט להלן.] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות תמונה פתוחות 3 (או 2) כבשו בערוצי ImageJ / פיג&#39;י. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל LUT ירוק, אדום והכחול (לוחות בדיקה) לערוץ המקביל; למזג 3 צבעים ולשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכרטיסיית ניתוח, בחר כלים&gt; ההחזר על ההשקעה של מנהל ... &gt; ציין, לאחר מכן בחר אזור אקראי של גודל מוגדר בתמונה הראשונה של הערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה התמונה, בחר לשכפל, כדי לשכפל את האזור שנבחר מתוך הערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה התמונה, בחר ערימות&gt; הפוך מונטאז&#39; ... כדי ליצור מונטאז&#39; מהוסס המכיל את כל המסגרות שנתפסו. לסרוק את כל המסגרות במונטאז&#39; לאירוע היווצרות autophagosome מלאה; לשמור על הערות של המסגרת הראשונה והאחרונה של האירוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכרטיסיית ניתוח, בחר כלים&gt; ההחזר על ההשקעה של מנהל ... בחר את אותו האזור בתמונה הראשונה של הערימה של 2 צבעים האחרים, כמו גם לתמונת הצבעים הממוזגת ולשכפל את הערימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאהוא קובץ כרטיסייה, בחר&gt; תמונה חדשה, ולהגדיר לרוחב בהתאם למספר הפיקסלים בתחילה נבחרו באמצעות מנהל ההחזר על ההשקעה, שנקבעו לגובה 4 פעמים את הגובה שנקבע בתוספת ההחזר על ההשקעה של המנהל 3 פיקסלים על שטח שבבין 3 צבעים ואת פרוסות מוזגו, וקבעו כמספר מסגרות בכל ערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה התמונה, בחר ערימות&gt; כלים&gt; הוספה ..., ואז להכניס כל תת ערימה אחת על גבי שני, ומשאיר מרווח של 1 פיקסל באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה התמונה, בחר ערימות&gt; הפוך מונטאז&#39; ... כדי ליצור מונטאז&#39; מתחיל ומסיים עם הפריים הראשון והאחרון של אירוע היווצרות autophagosome שנתפס. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה של הלוקליזציה של חלבון במהלך היווצרות autophagosome. יש לנו ניסינו שיטות שונות של לדמיין את האירועים מתוארים בי-סריקת נקודת confocal, ספינינג confocal דיסק וקרינת השתקפות הכל (TIRF) מיקרוסקופיה. מצאנו כי למטרות כלליות סטנדרטית עלית הקרינה רחבה בתחום מספקת את הפשרה הטובה ביותר בין רגישות ורזולוציה. הדבר מבטיח אות לרעש טובה, photo-bleaching/photo-toxicity מינימאלי ורכישה מהירה. חוסר חתך אופטי הוא לא בעיה אם האזורים המתאימים של התא נבחרים לתמונה כלומר בפריפריה שבו התא מתפשט ושטוחה. עם זאת, חשוב שמערכת ההדמיה משמשת מוגדרת כראוי (הן במונחים של החומרה המשמשת ואת הגדרות המערכת). לרזולוציה מרחבית הטובה ביותר, מומלץ להשתמש בהגדלה גבוהה, hעדשת igh מספרית צמצם שמן טבילה (עדשות טבילה במים לא תציע כל הדמיה יתרון בסמיכות לcoverslip). הוא הציע לאזן את עוצמת ההארה (למשל עם מסנני צפיפות ניטראליים), את הגדרות המצלמה (זמן חשיפה, binning ורווח) על מנת למקסם את האות לרעש ולמזער את הלבנת. זה צריך להיעשות באופן אמפירי, אבל כמדריך, בעת שימוש בעדשת NA 1.4 100x אנחנו בדרך כלל לצמצם את כוחו של אור העירור שלנו 10-20% ממקסימום ולהגדיר את המצלמה (Hamamatsu ORCA ER, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר) ל100-500 חשיפת אלפיות שנייה, binning 2x2 ו100 רווח. שיעור רכישת התמונה צריך להיות מוגדר בטווח של פריים 1 בכל שנייה 1-10. רכישת תמונות במסגרת שיעורים גבוהים יותר יהיה טובה יותר להבטיח המשכיות בין תמונות (רזולוציה של זמן טוב יותר), אבל יחשוף את התאים ליותר אור וכך להגדיל photo-bleaching/photo-toxicity. אם הדמיה יותר fluorescencערוצים אלקטרוניים, יש בו כדי להבטיח שהעיכוב בין לכידת ערוץ ממוזער (לצמצם את זמן חשיפה, תתאים חלפני סינון מהירים). זה יקטין את הסיכוי לממצא תנועה המופיע בתמונה המורכבת. אם ממצא תנועה מוכיח קשה להימנע מלשקול את השימוש במפצל תמונה (מכשיר כדי להקל על הרכישה בו זמנית של שני ערוצי הקרינה באמצעות מצלמה אחת) או מתאם מצלמה כפול. הדמיה כחולה ערוץ דורש בחירה של מסננים ומראות מתאימים כדי למנוע צולבת פליטה של ​​הקרינה הכחולה למסלול הירוק. אנחנו השתמשנו בהצלחה מיקרוסקופ CellR אולימפוס, אשר עושה שימוש בנורת ה-V עד צבעונית, המאפשר בחירה ספציפית של אורך גל, רוחב פס ועוצמתו וכך הוא מאוד גמיש. עם זאת, מקור האור הוא &quot;דולף&quot; עם קצת אור לבן מגיע דרך בנוסף לwavelengths.For נבחר מסיבה זו יש לנו מצוידת (רב) מסנני עירור bandpass בקוביות, כך שיש נוספות סינון של אור העירור. השילוב הבא של מראות / מסננים שימש (כל Semrock). לGFP &amp; mCherry: Exciter FF01-479-585, פולט FF02-525/40 (GFP) וFF01-607/36 (mCherry), Dichroic מירור FF505/606-Di01. לCFP: FF01-416/501 Exciter, פולט FF01-523/610, Dichroic מירור FF440/520-Di01. יש לנו גם השתמשנו במיקרוסקופ CellR שונה, אשר נתן תוצאות תת אופטימליות, עם צולבת פליטה של ​​הקרינה כחולה למסלול הירוק. מיקרוסקופ זה משתמש במקור אור לבן ויש לו גלגל מסנן מהיר כדי לבחור את wavelengths.This העירור אומר שבחירת אורך הגל מוגבלת ל8 המסננים בגלגל, אבל יש גלגל נפרד לווסת העצמה. השילוב הבא של מראות / מסננים היה בשימוש. עבור ה-GFP (Semrock): FF01-470/40 Exciter, פולט FF02-525/50, Dichroic מירור FF495-Di02. לCFP וmCherry: Exciter FF01-427/10 (CFP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), פולט FF01-472/30 (CFP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Dichroic מירור 89006bs (Chroma). משמעותה של טכניקה זו בהשוואה לשיטות הדמיה אחרות היא כפול: ראשית, הוא יכול ללכוד את הלוקליזציה של החלבון של עניין בתאים חיים, ושנית, היא יכולה להגדיל את המידע שחולץ הוספת הממד הרביעי של זמן. עם זאת, כמו חלבונים אקסוגניים תמיד יש את האפשרות של mislocalization, או בשל רמות ביטוי מוגברים או בשל תיוג, הדמיה תא חי ולכן צריכה להיות משולבת עם חיסוני מכתים של POI אנדוגני בתאים קבועים, על מנת לאשש את התוצאות . לבסוף, ראוי לציין כי הדמיה תא חי יכולה להיות משולבת עם EM חיסוני, על מנת להגדיל את הרזולוציה המרחבית של הניתוח.

Autophagy היא תהליך דינמי מאוד, שמצריך תיאום בין מספר רב של חלבונים לתוצאה הסופית של היווצרות autophagosome 1-3. מיקרוסקופית הוא כנראה הטכניקה מיושמת בדרך כלל ללימוד autophagy 4. הלוקליזציה של רוב חלבוני autophagy, נחקרה בהרחבה בתאים קבועים, הן על ידי חיסוני מכתים-החלבונים אנדוגניים ועל ידי ביטוי של חלבון אקסוגני מתויג fluorescently. בנוסף, מיקרוסקופית אלקטרונים (EM), לבד ובשילוב עם תיוג חיסוני זהב, תאר את הפרטים הקטנים של מבנים אלה 5,6. למרות העובדה שטכניקות אלה הקימו את ההבנה של היווצרות autophagosome ב 3 הממדים של החלל שלנו, הם לא הצליחו לספק כמות מספקת של מידע על ממד ה 4 - זמן. הדמיה תא חי מתגברת על המכשול הזה כפי שהוא מאפשר לאחר היווצרות autophagosome הקרוב ככל possi כble לזמן אמת 7. טכניקה זו הועסקה ראשונה ללמוד autophagy ידי Yoshimori ועמיתים 8, וכבר בשימוש יותר ויותר מעתה ואילך. מיקרוסקופיה זמן לשגות לוכדת את הלוקליזציה של נקודות עניין בתאים חיים ועל פני תקופה של זמן. על ידי השוואת מידע זה עם autophagy ו / או אברון סמן מאופיינים היטב, ניתוח הדמיה תא חי יכול לשים את נקודת העניין בהקשר המרחב ובזמן גדול יותר של היווצרות autophagosome. ניתוח הדמיה תא חי מבוסס על הלכידה החוזרת ונשנית של לוקליזציה POI לאורך כל השלבים של היווצרות autophagosome, תוך הדמיה של תאים קבועים מבוססת על לכידה אחת. לכן, הדמיה תא חי יכולה להוכיח את התרומה של נקודות עניין בשלבים מסוימים של היווצרות autophagosome, תוך הדמיה של תאים קבועים יכולה רק להניח את התפקיד של נקודות עניין, המבוסס על הלוקליזציה הממוצעת שלה בautophagosomes רבים שנתפסו בו זמנית בשלבים שונים שלהם lifecyCLE. למרות שהדמית תא חי היא שיטה של ​​כוח האנליטי גבוה, יש לו כמה מגבלות מובנות, שיש להביאם בחשבון. קודם כל, הדמיה תא חי דורשת את הביטוי של אחד או יותר מחלבונים שכותרתו fluorescently אקסוגניים. תגי ניאון נוטים להיות גדול בגודל ולפעמים הם יכולים לשנות את ההתנהגות של חלבון בשל סיבות סטריות. מצב זה מודגש לחלבונים בממברנה, כפי שהם צריכים כדי לתפקד במרחב המוגבל של 2 ממדים של ממברנות. ראוי לציין, autophagosomes הם מבנים קרומיים, ובהתאם להיווצרותם דורשת מספר רב של חלבוני קרום הקשורים. קבוצה נוספת של בעיות קשורה לרמות הביטוי של נקודות עניין. באופן עקרוני, צריך לבוא לידי ביטוי חלבון אקסוגני ברמות דומות לחלבון אנדוגני. הדבר מבטיח כי רגולטורים חשובים של לוקליזציה משנה הסלולר שלו לא רוויים, והניתוח דואר יהיה רלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, יש להימנע מביטוי יתר של חלבוני autophagy, כפי שהם באים לידי ביטוי כאשר מעל הרמות אנדוגניים, הם נוטים לדכא את תגובת autophagy 9. לעומת זאת, מאחר שרמות הביטוי של נקודת העניין צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר ביצוע הלוקליזציה שלה לתקופה טובה של זמן בלי תמונה הלבנת-, יש פשרה שהושגה. רמות הביטוי האופטימליות של חלבון בתאי אקסוגני mammalians השגת דורשת הרבה כוונון עדין, אבל זה אפשרי על ידי ההקמה וסינון שורות תאים ביציבות להביע רמות של נקודות עניין שונות. הרזולוציה מרחבית שניתן להשיג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי היא עוד גורם מגביל. ההחלטה עשויה להיות מוגבלת למספר הסיבות, אבל במקרה טוב, ברזולוציה רוחב תהיה סביב 250 ננומטר. משמעות דבר היא כי כל החפץ מופרד על ידי מרחק קטן יותר מזה יופיע מחובר (או כאחתאובייקט) ואובייקטים קטנים מ -250 ננומטר יהיו מיוצגים בתמונה הגדולה יותר ממה שהם באמת. לכן תמונות צריכים תמיד לפרש עם זה בחשבון וטכניקות משלימות כגון EM תידרש לפתור בפירוט אולטרה מבני בסדר. לבסוף, הדמיה תא חי מטבעו דורשת חשיפת תא לאור, שעלול להיות לתקופה ממושכת של זמן. זה עשוי לשנות את התגובות הפיזיולוגיות של תא, תופעה הידועה בצילום רעילות. אנחנו השתמשנו בהצלחה הדמיה תא חי של חלבון PI3P מחייב DFCP1 לתאר בפעם הראשונה שautophagosomes מקורן מבני PI3P עשירים דמויי טבעת omegasomes כינה, הנמצאים בקשר הדוק עם חדר מיון גדילים 10,11. באופן ברור יש לנו הראינו כי מבני LC3 חיוביים להתחיל להרכיב בשיתוף הדוק עם omegasomes. אנחנו כאן מצביעים על כך שהעסקת שורת תאים להביע GFP-DFCP1 יציבות לתא החיהדמיה של החלבון של עניין, קובעת מסגרת מרחב ובזמן חזקה לאפיון של תפקידה בהיווצרות autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy היא תגובה תאית מופעלת על ידי חוסר של חומרים מזינים, במיוחד היעדרות של חומצות אמינו. Autophagy מוגדרת על ידי היווצרות של מבני קרום כפולים, שנקראה autophagosomes, שלעקל חלבוני ציטופלסמה, חיים ארוכים ואגרגטים חלבון, אברונים פגומים, ואפילו וירוסים או חיידקים. Autophagosomes סופו של דבר להתמזג עם lysosomes המוביל לזילות עיקר התוכן שלהם, עם החומרים המזינים המיוצרים להיות ממוחזרים חזרה לציטופלסמה. לכן, autophagy היא חיונית לאיזון תא, וdysregulation של autophagy יכול להוביל למחלות, בעיקר ניוון מוחיים, הזדקנות וסרטן. היווצרות Autophagosome היא תהליך מאוד מורכב, שבו תאים להקצו לקבוצה מסוימת של חלבונים, הנקראת מכונות autophagy ליבה. מכונות autophagy הליבה היא השלימה תפקודית על ידי חלבונים נוספים הכרוכות בתהליכים תאיים שונים, למשל בmembranסחר בדואר, בביולוגיה של המיטוכונדריה וlysosomal. תיאום של החלבונים הללו ליצירת והשפלה של autophagosomes מהווה תגובה הדינמית והמתוחכמת ביותר של autophagy. הדמיה תא חי מאפשרת לעקוב אחר התרומה המולקולרית של כל חלבון הקשור לautophagy עד לרמה של אירוע היווצרות autophagosome אחת ובזמן אמת, ולכן טכניקה זו מציעה רזולוציה גבוהה של זמן ומרחב. כאן אנו משתמשים שורת תאים ביציבות להביע GFP-DFCP1, להקים הקשר מרחב ובזמן לניתוח שלנו. DFCP1 omegasomes סימנים, שהם מבנים מבשר מובילים להיווצרות autophagosomes. חלבון של עניין (POI) יכול להיות מסומן עם או אדום או תג ניאון ציאן. אברונים שונים, כמו ER, מיטוכונדריה וlysosomes, כולם מעורבים בשלבים של היווצרות autophagosome שונים, ויכולים להיות מסומן באמצעות צבע גשש ספציפי. מיקרוסקופיה זמן לשגות של autophagy בסט את הניסוי הזה, מאפשר למידע להיות מופק על הממד הרביעי, כלומר הזמן. מכאן אנו יכולים לעקוב אחר התרומה של POI לautophagy במרחב ובזמן.

בפרוטוקול מתואר, השתמשנו מיקרוסקופיה זמן לשגות לעקוב הלוקליזציה של LC3 CFP מתויג בשורת תאים ביציבות להביע DFCP1 GFP-tagged, בתנאים ישכנעו autophagy. התוצאה של ניסוי זה היא לכידתו של 2 סדרה או ערימות של תמונות, אחד מירוק ואחת מהערוץ הכחול, מתאימות לGFP-DFCP1 וCFP-LC3. יש לנו עוד ניתחו את סרטי הווידאו האלה באמצעות ImageJ, על מנת ליצור מצרפי מתאימים לאירועי היווצרות autophagosome אחת, כפי שתוארו בסעיף הפרוטוקול. ניתוח זה מאפשר לנו להוכיח שautophagosome LC3 חיובי נובע מomegasome DFCP1-חיובי. במונטאז&#39; שמוצג באיור 2, היווצרות של omegasome מתבררת מהמסגרת השנייה, בצורה של נקודה קטנה. Omegasome מתחיל הרחבת על מנת ליצור מבנה דמוי טבעת האופיינית, ומגיע לקוטר המרבי שלו לאחר 6 דקות. בשלב הבא, מתחיל omegasome גollapsing וסופו של דבר הוא נעלם, לאחר כ 10 דקות. עכשיו לשים את היווצרות מבנה LC3-החיובי או autophagosome בהקשר של היווצרות omegasome, אנו צופים כי autophagosome מופיע לאחר omegasome, והופך להיות גלוי לעין לאחר כ -1.5 דקות. Autophagosome מתחיל להרחיב בשיתוף הדוק עם נקודת omegasome, הראשונה ולאחר מכן טבעת, וכאשר מתחיל omegasome קורסת את ניצני autophagosome. סופו של דבר autophagosome נשאר מאחור, כנראה למזג עם lysosomes, לאחר omegasome נעלם. ניתוח זה מספק אינדיקציה ברורה על הקשר הפונקציונלי בין 2 המבנים, לפיו LC3 autophagosomes חיובי מקורן omegasomes המקביל. בדוגמה נוספת, הוסיפו גשש יזוזום על מנת ללכוד את הקשר של הזמן ומרחב של autophagosome להרכיב עם lysosomes (איור 3 </strong&gt;). ואכן, כמה דקות לאחר התמוטטות omegasome, autophagosome המתהווה מתחיל להתרועע עם lysosomes וסופו של דבר הוא מתאחה עם הליזוזום אחד. שילוב של autophagosome עם יזוזום מידה רב מרווה את הקרינה CFP-LC3, ככל הנראה עקב החשיפה של תג CFP בסביבת החומצית של יזוזום. עם זאת, אותו הסוג של ניתוח יכול להניב תוצאות uninterpretable, בשל מגוון רחב של סיבות. בדוגמא שמוצגת באיור 4, התוצאות הפכו uninterpretable בשל להיסחף בפוקוס. וידאו מתחיל ללכוד את היווצרות autophagosome בהצלחה, עם זאת להיסחף בפוקוס מתרחש לאחר סימן 3 דקות. לכידת הווידאו ממשיכה מחוץ לפוקוס ל6 דקות הבאים, אבל בסופו של המוקד הוא תיקן באופן ידני אחרי סימן דקות 9 עד 10. ניתוח זה אם כי, עושה אי אפשר להפלות בין אם אירוע היווצרות autophagosome נתפס כאשר המוקד הוא תיקן הואאירוע ראשוני שבו כמעט הושלם, או אחד חדש שהחל לאחר להיסחף בפוקוס. ניתן לייחס לבעיות נוספות confluency של התאים בתרבית. למשל, כאשר תאים גדלים בconfluency גבוה מהאופטימלי, הם נאלצים להרחיב על החלק העליון של תא סמוך, מה שהופך את ההתמקדות מאתגרת למדי. יתר על כן, תאים, כי הם גדלו בconfluency הגבוה נוטים להיות לחוצים, להגדיל את רמות פעילות autophagy רקע לפני תחילתו של הרעב. לבסוף, נושאים הקשורים לקרינה הם נפוצים למדי. יש CFP פעילות הקרינה חלשה יותר בהשוואה לGFP, ולעתים קרובות מקבל תמונה-מולבן בשלבים מאוחר יותר של לכידת וידאו. ניתוח של קטעי וידאו מסוג זה יכול להוביל למסקנות שליליות כוזבות על עמותת מרחבי של POI עם autophagosomes יוצרים. עם זאת, ניתן להתגבר על בעיות אלה על ידי שימוש באחת מהגרסות כגון mTurquise2. עוד phenomeno המשותףn נובע מכך שהקרינה של תגים אדומים היא לא תרווה ב-pH נמוך יותר של lysosomes. חלבוני autophagy רבים מבחינה פיזיולוגית לסיים את מחזור החיים שלהם לתוך lysosomes, בעוד autophagosomes סופו של דבר להתמזג עם lysosomes. יתר על כן, חלבונים שאינם פונקציונליים לעתים קרובות מטרה להשפלה בlysosomes. לכן, עלול בסופו בעקבות העמותה שאינה קשורה לautophagosomes עם lysosomes, במקום עמותה פיזית ממשית של בין נקודות עניין וomegasomes האדומים מתויגים. <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. תא דגירה. O-טבעת הפלסטיק מתאימה סביב השפה של O-טבעת המתכת ויש לו בתחתית מעקה צר המשתרע פנימה. Coverslip מונחת על המדף של O-טבעת הפלסטיק, ולאחר מכן O-טבעת הפלסטיק מצוידת בתחתית מתכת O-Ring. בדרך זו, היא coverslip חולwiched בין 2 הטבעות האטימות, יצירת תא סגור. <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50484/50484fig2highres.jpg" /> איור 2. תאים להביע GFP-DFCP1 וCFP-LC3 הורעבו למשך 30 דקות וצלמו בשיעור של פריים 1 בכל 10 שניות. מונטאז&#39; של אירוע היווצרות autophagosome נציג מוצג. אותות מערוצי ירוק וכחול ירוקים ואדום בהתאמה פסאודו בצבע. חצים מצביעים omegasome ניכר הראשון וautophagosome. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50484/50484fig3highres.jpg"/> Figure 3. תאים להביע GFP-DFCP1 וCFP-LC3, הודגרו עם Lysotracker אדום, הורעבו למשך 30 דקות וצלמו בשיעור של פריים 1 בכל 15 שניות. מונטאז&#39; של אירוע היווצרות autophagosome נציג מוצג. אותות מערוצים ירוקים, אדום וכחול הם פסאודו בצבע ירוק, כחולה ואדום בהתאמה. חצים מצביעים omegasome ניכר הראשון וautophagosome. ראש חץ מצביע על לכידתו הראשונה של היתוך autophagosome עם יזוזום. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50484/50484fig4.jpg" alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50484/50484fig4highres.jpg"/> איור 4. תאים להביע GFP-DFCP1 וCFP-LC3 הורעבו למשך 30 דקות וצלמו בשיעור של פריים 1 בכל 10 שניות. מונטאז&#39; של דוגמה של תת-O<html> לכידת ptimal מוצגת. אותות מערוצי ירוק וכחול ירוקים ואדום בהתאמה פסאודו בצבע. חצים מצביעים omegasome ניכר הראשון וautophagosome. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> וידאו 1. וידאו של אירוע היווצרות autophagosome מוצג באיור 2. שיעור ההשמעה הוא 4 פריימים לשנייה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> וידאו 2. וידאו של אירוע היווצרות autophagosome מוצג באיור 3. מצביע החץ ראשון, היווצרות של omegasome, ושנית, שילוב של autophagosome עם יזוזום. שיעור ההשמעה הוא 4 פריימים לשנייה.&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בסרט. וידאו 3. וידאו של אירוע היווצרות autophagosome מוצג באיור 4. שיעור ההשמעה הוא 4 פריימים לשנייה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50484/50484movie3.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> טבלת מס &#39;1. רשימה של חומרים כימיים ספציפיים וציוד הנדרשים לפרוטוקול, יחד עם ספק המקביל ומספר קטלוגים. חוצצים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width=".5in"> חוצץ </td><td fo:width="1.5in"> הרכב </td><td fo:width=".5in"> שלב משומש </td></tr><tr><td> בינוני רעב </td><td> 20 מ&quot;מ 7.4 pH HEPES </td><td> 5.2 </td></tr><tr><td></td><td> 140 מ&quot;מ NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;מ CaCl 2 </td><tד&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 1 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז 5 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BSA 1% </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 2. רשימה של מאגרי שימוש בפרוטוקול זה. מאגרי המשמשים, הרכבם והצעד הראשון שבו הם נמצאים בשימוש בפרוטוקול מפורטים.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond at JoVE.com

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

live-cell-imaging-of-early-autophagy-events-omegasomes-and-beyond

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K Views.  The Babraham Institute. מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

Video: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...