Gostaríamos de agradecer a Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar para assistência técnica especializada sobre os protocolos descritos neste trabalho. Além disso, gostaríamos de reconhecer a orientação de Christopher B. Newgard na Duke University e Alan D. Attie na Universidade de Wisconsin-Madison, juntamente com o apoio de seus membros de laboratório, o que nos permitiu a tempo e apoio necessários para otimizar o protocolos descritos. Em particular, agradecemos Hans Hohmeier, Danhong Lu, e Helena Winfield no Laboratório Newgard e Maria Rabaglia no Laboratório Attie para discussões produtivas e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo NIH DK080845 concessão e diabetes juvenil 594 Fundação de Pesquisa de concessão 17-2011-608 (a MEK)

<ol>
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Autores têm nada a revelar.

Com a prevalência de diabetes projetados para afetar 7,7% da população do mundo, a exigência de novas técnicas de pesquisa é fundamental para entender e tratar a diabetes 18. O presente isolamento de ilhotas é um protocolo bem estabelecido utilizado para experimentação in vitro e tem sido apresentado anteriormente, com ligeiras modificações 11,14,16. Embora a secreção de insulina é uma aplicação comum para a jusante ilhotas isoladas, com foco em componentes a montante, tais como cAMP, podem ajudar a delinear os mecanismos potenciadores da produção e secreção de insulina. A escolha da eutanásia deve ser feita cuidadosamente para assegurar tanto a tratamento humano de animais de laboratório, bem como a integridade das medições experimentais. Para o isolamento dos ilhéus, exsanguinação sob anestesia é nosso método preferido para a eutanásia, pois permite ilhota perfusão com sangue oxigenado para a quantidade máxima de tempo antes do pâncreasinflação. Inalação de CO 2 é uma má escolha para a eutanásia, como se ela é realizada de acordo com protocolos humanas, ele expõe as ilhotas de sangue mal oxigenado, pelo menos, 5-6 min antes do procedimento pode começar. Deslocamento cervical, sem anestesia poderia ser um método aceitável, com fundamentação científica, mas isso exigiria uma experiência significativa tanto com o método de eutanásia ea dissecação do mouse e procedimento inflação pâncreas, a fim de garantir a morte humana e preservação da função da ilhota. Na escolha de sangria sob anestesia, Avertin é o anestésico preferido neste protocolo. A escolha particular de Avertin é que é uma acção rápida e anestesia profunda com muitas vantagens em relação a outros anestésicos comumente usadas. Em primeiro lugar, não se dilatam Avertin vasculatura e induzir a libertação de óxido nítrico, tal como o isoflurano 19. Ilhotas pancreáticas são altamente vascularizado e, portanto, sua biologia podem ser negativamente afetados por exposur isofluranoe. Em segundo lugar, não é excessivamente Avertin elevar os níveis de glicose no sangue, na ausência de injecção de glicose, como pode cetamina / xilazina, a qual foi mostrada para aumentar a glucose no sangue de 167% até uma hora após a injecção 20. Finalmente, a faixa terapêutica para pentobarbital é muito estreito em camundongos 21, aumentando a chance de dano hipóxico para as ilhotas. Neste protocolo, o uso de fio de sutura para ligar o ducto biliar comum perto do esfíncter de Oddi é utilizada como uma alternativa a uma pinça hemostática. O método fio permite uma maior capacidade de manobra do ducto biliar comum e ajuda a posicionar a agulha para punção. No entanto, o uso do fio durante esta etapa requer segurando dois objetos (fios e seringas), enquanto a pinça hemostática permite que uma mão livre para ajudar a posicionar o ducto biliar. Ambas as técnicas de isolamento de produzir um número semelhante de e ilhotas viáveis ​​como mostrados com trabalho anterior no nosso laboratório e outros 10,22. Além disso, nee canulaçãodle tamanho, posição e ângulo dependerá da preferência do usuário. Especificamente, uma agulha G 30, é usado no presente protocolo, mas outros tamanhos podem ser necessários com base na tensão ou fundo genético. Por exemplo, os ratos BTBR ter um ducto biliar comum muito friável e um calibre maior pode fornecer um selo maior em torno da ponta da agulha (MEK, observações pessoais). Assim, recomenda-se ter anulado agulhas cânula de diferentes tamanhos na mão durante a cirurgia, pronto para mudar para fora, se necessário. A posição da agulha no ducto biliar comum também será de grande impacto no rendimento de ilhotas. Se a agulha é colocada em frente da bifurcação do ducto biliar comum, a solução de colagenase entrará no fígado e resultar em uma inflação pobre. No entanto, se a agulha está colocada muito perto do esfíncter de Oddi, uma inflação de pâncreas parcial irá ocorrer, diminuindo o número de ilhéus isolados. Inflações pancreáticas teste com vários tamanhos de agulha e locais no ducto biliar comum será requivermelho para personalizar o presente processo e maximizar o rendimento de ilhotas. Outro componente importante do presente processo para aumentar o número de ilhotas viáveis ​​é para preparar todos os reagentes de acordo com as instruções de protocolos. Gaseamento os tampões com 95% de O2 / 5% de CO 2 para aumentar a oxigenação pode um factor de sobrevivência dos ilhéus em todo o protocolo. Trabalho anterior demonstra que a concentração do oxigénio diminui em direcção ao interior da ilhota, potencialmente, reduzir o teor de energia de células β 23. Isto pode ser evidente depois de uma incubação durante a noite a uma obscuridade, centro necrótico aparece em ilhotas cultivadas, correlacionando-se com uma diminuição da capacidade de resposta in vitro. Assim, fornecendo oxigênio suficiente irá ajudar a aumentar o número de ilhotas e viabilidade durante o isolamento e para a, processo de incubação normóxicas durante a noite. Além disso, a preparação adequada da solução de colagenase irá melhorar a digestão do tecido pancreático e libertar tele ilhotas de tecido circundante. Se a concentração de colagenase é muito baixa, não só o rendimento de ilhotas ser baixo, mas o tecido exócrino acinar pode permanecer ligado para as ilhotas, afetando negativamente aplicações a jusante. Por outro lado, demasiado elevada de uma concentração de colagenase pode destruir as ilhotas. Portanto, medidas de controle de qualidade apropriados para garantir a eficiência da digestão colagenase sem a destruição das ilhotas vai promover maiores rendimentos. Colagenase isolada a partir de Clostridium histolyticum é a enzima utilizada para libertar ilhotas de tecido pancreático neste protocolo. O irreproducibility de actividade enzimática entre diferentes lotes de colagenase tem o potencial de prejudicar a quantidade e / ou qualidade de ilhéus isolados. No presente protocolo, cada novo lote de enzima colagenase passa por uma verificação de controlo de qualidade interno para determinar quantidade e funcionalidade de ilhotas antes que eles estão sujeitos a estudar. Portanto, downstream aplicações e variações muito precisam ser considerados quando se escolhe uma enzima para o isolamento das ilhotas. Liberase ® (Roche), de uma mistura de colagenase purificada, é uma outra alternativa de enzimas digestivas que tem tido sucesso em muitos casos; em particular, a obtenção de quantidades mais elevadas de ilhéus isolados 24,25. No entanto, o uso de Liberase pode não ser benéfica para o isolamento de ilhotas funcionais, uma vez que pode dificultar a função in vitro 26. Muitas limitações existem nos procedimentos de isolamento de ilhotas e de determinação de cAMP presentes que podem dificultar aplicações a jusante. Como afirmado anteriormente, os ratinhos BTBR ter um ducto biliar comum muito frágil, o que aumenta a dificuldade de inflação do pâncreas e subsequente isolamento de ilhotas. Portanto, pode ser necessária uma associação de preparações de ilhéus de vários ratinhos, como muitos ensaios in vitro, incluindo o ensaio de cAMP descrita, requerem muitas ilhotas por repetição. Além disso, o uso de IBMX no bloco de ensaio de cAMPatividade s fosfodiesterase, dando um limite de ler a produção de AMPc. A adição de IBMX pode não ser aconselhável nos casos em que o ciclo de produção de AMPc e degradação é importante para a sinalização celular. No entanto, a remoção de IBMX deste protocolo reduz significativamente o conteúdo de AMPc final dos ilhéus, que exige a adição de muitos mais ilhéus por repetição a fim de obter valores de AMPc significativas no EIA. O presente protocolo é uma ferramenta essencial para um laboratório de biologia ilhota ou aqueles interessados ​​no pâncreas endócrino. O componente de cAMP para este protocolo é apenas um dos muitos experimentos in vitro para entender como manipulação ilhota através de vários tratamentos podem aumentar a secreção de insulina ou sem corte. Embora a maioria das pesquisas utilizando ilhotas se concentra principalmente na secreção de insulina das células β, outros tipos de células pode ser avaliada por suas relações dinâmicas dentro da ilhota 4. Em combinação com a outra in vitro e in vivo modelos, experimentação ilhota vai lançar luz sobre mecanismos subjacentes devastadoras doenças pancreáticas relacionados, tais como diabetes e insulinomas. Mais importante ainda, a compreensão de como agentes farmacêuticos impactar diretamente ilhotas irá melhorar a eficácia do tratamento e ajuda na tradução de um modelo vivo em.

A manutenção rigorosa de euglicemia é imperativo para evitar morbidades, tais como neuropatia, nefropatia e retinopatia, que são todas as características da patologia da descontrolada tipo 1 e 2 diabetes 1. Função das células-β e de massa em ambos tipo 1 e diabetes 2 perturbar as concentrações de glicose no sangue 2. Considerando tipo imune mediada por uma diabetes resulta de uma perda devastadora de células-β produtoras de insulina, a secreção de insulina das células β prejudicada e sinalização da insulina periférica na diabetes tipo 2 em conjunto promover hiperglicemia, dislipidemia e aumento da produção hepática de glicose, o que acaba por resultar em tanto a perda da capacidade de destruição de células β e secreção de insulina a partir de células individuais β-3. Compreender os mecanismos de células-β subjacentes a progressão da diabetes tipo 1 e 2, esperamos dar origem a novas terapias para prevenir e tratar estas doenças. In vitro timodelos de cultura ssue, tais como o INS-1 e MIN6 linhas de células imortalizadas β, podem ser ferramentas úteis para a compreensão da função das células β específicos. No entanto, as interações entre os diferentes tipos de células dentro da ilhota-se pode regular a função das células β. Por exemplo, a influência parácrina de glucagon (libertado a partir de células-α) e somatostatina (libertado a partir de células-δ) em aumentar e diminuir a secreção de insulina, respectivamente, demonstra a importância da proximidade de células de células na resposta endócrina 4. Além disso, junções entre as células-β potencializar a liberação de insulina 5. Além disso, embora tenham sido feitos progressos na geração de linhas de insulinoma que melhor replicados a resposta fisiológica de ilhéus isolados de glicose (por exemplo, o INS-1 derivado de 832/13 e 832/3 linhas de células), a sua capacidade de resposta de glucose ainda difere do normal de rato ilhotas 6,7. Além disso, a resposta destas linhas celulares de insulinoma clonaisa peptide-1 (GLP-1) agonistas de glucagon-like pode variar drasticamente de uma outra, bem como a partir de ilhéus normais 6. Portanto, as linhas de células imortalizadas podem não representar o melhor modelo para os agentes de ensaio que o impacto sobre a produção de cAMP. Em contraste com as linhas de células derivadas de insulinoma, estudar a função das células β exclusivamente em modelos animais completos oferece o seu próprio conjunto de complicações. Um dos maiores desafios no trabalho com tecido endócrino está medindo a concentração precisa de hormônio liberado. Especificamente, o fígado desempenha um papel importante metabolizar a insulina, e o fluxo de sangue pâncreas vai directamente para o fígado. Assim, uma medição de insulina no plasma podem não descrever com precisão a quantidade de insulina a ser segregadas a partir da própria pâncreas ou o impacto de diferentes tratamentos sobre a taxa de secreção de insulina 8. Além disso, o metabolismo renal do glucagon pode limitar a confiabilidade da produção de glucagon a partir de células dos ilhéus α-9. Portanto, isolar ilhotas principal do mouse para a experimentação in vitro proporciona uma compreensão mais precisa de como a ilhota está respondendo a estímulos específicos para complementar as medições feitas in vivo. O presente protocolo para o isolamento de ilhotas de rato é um protocolo bem estabelecido usado por um número de grupos (com pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso) 10,11. Além disso, a determinação da produção de cAMP permite uma leitura directa da capacidade de resposta das células incretina-β. Em conjunção com a medição de cAMP, teor de proteína e a secreção de insulina pode também ser quantificada a partir da mesma preparação de amostras de cAMP, ajudando a determinar se um defeito na função das células-β reside proximal ou distal em AMPc 10. O conteúdo cAMP final e aplicação da secreção de insulina neste protocolo pode ser uma ferramenta muito poderosa para a compreensão da influência de componentes farmacêuticos e dietéticos, entre outross, em cAMP e secreção de insulina. Além disso a estimulação da glucose sozinha, outros compostos podem ser utilizados para medir as alterações do cAMP e secreção de insulina 10,11. Finalmente, embora a insulina é a hormona primária que ensaiar a partir de ilhotas isoladas, outras hormonas, como o glucagon e somatostatina, assim como citoquinas, e eicosanóides, o monofosfato cíclico de adenosina, pode também ser medida, quer por um ensaio de estimulação transitória ou por quantificação de os seus níveis no meio de cultura 12. Finalmente, embora fora do âmbito deste manuscrito, isolamento de ilhotas com o método de isolamento da colagenase descrita permite a preservação da ilhota de forma que muitas outras aplicações a jusante, pode ser exercida, tal como o transplante de ilhotas, para isolamento de RNA por PCR quantitativo em tempo real ou de microarray análises de proteínas isolamento por Western blot, dos ilhéus incorporação e imagiologia de imunofluorescência, e incorporação de [3H]-timidina como medida de repli antiilhotascação, alguns dos quais têm sido descritas em artigos anteriores JoVE 13-16. No geral, seguindo o procedimento de isolamento das ilhotas descritos no protocolo pode fornecer um pesquisador com informações importantes e úteis para o desenvolvimento de terapias e promover a descoberta de medicamentos destinado a melhorar a função das células β.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C7657</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9378</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hanks Balanced Salt Solution 10X</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>14065-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hepes</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">RPMI 1640 (powder)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">31800-022</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3/0 Silk Suture Thread</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>18020-30</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">0.8 mm Forceps&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11050-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14061-10</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15003-08</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14002-14</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">5ml BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309646</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">1ml BD syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309628</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305106</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">27 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sharpening Stone</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">29008-01</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-2-2 tribromoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T48402-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486-100mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:235px;">Monopotassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P0662</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">Sodium Bicarbonate (NaCHO3)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">CaCl2 *2H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C3881</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">MgSO4 *7H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M9397</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:235px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30088.03HI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">5879-100MG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular camp determination

Glicemia descontrolada é uma característica da diabetes mellitus e promove morbidades como neuropatia, nefropatia e retinopatia. Com o aumento da prevalência de diabetes, tanto imunomediada tipo 1 e ligado à obesidade do tipo 2, estudos que visam delinear fisiopatologia diabetes e mecanismos terapêuticos são de importância crítica. As células-β dos ilhéus pancreáticos de Langerhans são responsáveis ​​pela apropriadamente secretoras de insulina, em resposta a concentrações elevadas de glicose no sangue. Em adição à glucose e outros nutrientes, as células-β também são estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que são secretadas a partir do intestino em resposta a uma refeição e agem em receptores de células β que aumentam a produção intracelular de monofosfato de adenosina cíclico ( cAMP). Diminuição da função das células-β, massa e capacidade de resposta incretina são bem compreendidos a contribuir para a fisiopatologia do diabetes tipo 2, e também estão sendo cada vez mais ligada wiª diabetes tipo 1. O presente rato isolamento ilhéu e protocolo determinação cAMP pode ser uma ferramenta para ajudar a delinear os mecanismos que promovem a progressão da doença e intervenções terapêuticas, particularmente aquelas que são mediadas pelos receptores de incretinas ou receptores que atuam através da modulação da produção de cAMP intracelular relacionados. Embora apenas as medições de cAMP será descrito, o protocolo de isolamento de ilhotas descrito cria uma preparação limpa, que permite também a muitas outras aplicações a jusante, incluindo a glicose estimulou a secreção de insulina, [3 H]-timidina, a abundância de proteínas, e a expressão do mRNA.

Para garantir um alto rendimento ilhota durante o isolamento, as técnicas cirúrgicas descritas no protocolo deve ser seguido de perto. Embora as técnicas apresentadas aqui vai ser adaptado para cada laboratório, existem alguns passos críticos que levarão a um isolamento bem sucedido. A fim de tornar o canal biliar comum de fácil acesso, recomenda-se que os órgãos de ser deslocado para o lado direito do rato (Figura 1). Além disso, isto irá permitir que o pâncreas são accionados com uma quantidade menor de resistência uma vez que haverá menor peso restringir a expansão. Outro passo fundamental para maximizar o rendimento de ilhotas é a ligadura de ducto biliar comum perto do esfíncter de Oddi (Figuras 2A-C). Ligando mais longe do esfíncter de Oddi pode resultar em uma inflação parcial, reduzindo a quantidade de solução de colagenase que entra no canal pancreático principal. Além disso, um nó esticada vai impedir que a solução de colagenase de entrar no intestino. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A incisão adequada para o ducto biliar comum deve estar localizado suficientemente longe da bifurcação do fígado, mas perto o suficiente para a inflação de pâncreas máxima (Figura 3). Uma incisão feita muito próxima da bifurcação pode conduzir ao fluxo de solução de colagenase para o fígado. Quando solução de colagenase entra no fígado, ele vai perder a sua cor vermelho-escuro e começam a girar esbranquiçada. Se isso ocorrer, retire a agulha e tente outra punção mais longe do fígado. Além disso, o ducto biliar comum incisão deve ser apenas a meio do duto (cerca de 50%). Completamente corte da conduta vai torná-la difícil de vedar a conduta em torno da ponta da agulha. Uma incisão adequada irá resultar em fechamento completo da conduta em torno da agulha, produzir pressão suficiente para encher a ambos biliar e ductos pancreáticos (Figura 4A). É também importante assegurar que a agulha tenha entrado no canal biliar comum e não a bainha envolvente.Uma vez que a agulha tenha sido inserido correctamente, 5 ml da solução de colagenase deve preencher os pâncreas, criando um tecido marbleized. O processo de remoção do pâncreas deve ser realizada delicadamente para promover o rendimento máximo dos ilhéus (Fig. 5). Perfurar o pâncreas pode resultar num esvaziamento e perda de solução de colagenase, reduzindo o rendimento da ilhota. Cortar o pâncreas próximo do tecido conjuntivo e de outros órgãos irá impedir a deflação. Além disso, outro tecido de colheita, tal como o tecido conjuntivo, juntamente com o pâncreas não é um problema, uma vez que irá ser removido nos passos subsequentes. Um pâncreas adequadamente removidos permanecerão inflado depois de excisão prévio para a digestão de colagenase (Figura 6). Camadas distintas em gradiente de Ficoll conduzirá a uma preparação ilhota limpo e criar um ambiente mais fácil para a colheita ilhotas (Figura 7). A inclinação assegura a separação das ilhotas deos detritos celulares e de tecido conjuntivo que permanece após a filtragem de digestão e tela de malha. Além disso, esta etapa é crucial para a seleção, ilhotas limpas saudáveis ​​para aplicações a jusante. Especificamente, ilhotas saudáveis ​​será esférica e ter um marrom dourado para centro do marrom escuro (Figura 8). Nota: Os ilhéus de ratos diabéticos será muito mais pálida na cor correspondente a uma diminuição do conteúdo de insulina, e pode ser melhor distinguidos de tecido acinar, pela sua forma, brilho, e a sua rede de capilares visível. Quaisquer ilhotas ligados ao tecido acinar não deve ser usado e deverá ser descartado. Além disso, ilhotas maiores que desenvolvem um escuro, centro necrosado após uma incubação durante a noite deve ser descartada, pois não funcionar corretamente. Como descrito na introdução, a produção de cAMP é um componente importante da função das células-β; em particular, no que diz respeito à acção da incretina. Uma vantagem com o protocolo descrito na presente met<html> hod é que pode-se obter simultaneamente a produção de cAMP e de dados da secreção de insulina estimulada por glicose. Tipicamente, o impacto de um agente na produção de cAMP directamente correlacionada com o seu impacto sobre a secreção de insulina 17. Para experiências simples, essa regra se aplica muito bem (veja a Figura 9, por exemplo). No presente protocolo, usamos IBMX (um inibidor da fosfodiesterase) em nossos tratamentos para evitar o catabolismo de cAMP, dando à produção total do acampamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig1.jpg" /> Figura 1. Deslocando órgãos internos. Posicionando os órgãos internos para o lado direito do rato cria um ambiente de trabalho mais fácil e permite que a sala de pâncreas para se expandir durante a inflação. <html> Figura 2 &quot;fo: Content-width =&quot; 5 polegadas &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Amarrar fora do esfíncter de Oddi (AC). Descrita aqui é a entrada do ducto biliar comum para o intestino delgado no esfíncter de Oddi. Amarrar fora do ducto biliar comum no esfíncter de Oddi impede solução de colagenase de entrar nos intestinos. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig3.jpg" /> Figura 3. Incisão do ducto biliar comum. É melhor fazer um corte no ducto biliar comum ligeiramente afastada para a bifurcação para o fígado para impedir o fluxo da solução de colagenase para o fígado. 0374/50374fig4highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50374/50374fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Canulação do ducto biliar comum por um embotada 30 G agulha ea inflação pâncreas. A) A agulha G 30, é inserido no canal biliar comum, a criação de uma vedação em torno da ponta da agulha. É importante verificar e observar a agulha foi inserida no canal biliar comum e não a bainha envolvente. Uma agulha inserida corretamente terá uma aparência opaca. B) A inflação pâncreas adequada irá preencher com cerca de 3-5 ml de solução de colagenase e têm uma aparência marmorizada. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig5.jpg" /> Figura 5. A remoção do pâncreas. A) A primeira incisão feita com um par de tesouras curvo ocorre perto do esfíncter de Oddi. O rem inicialoval começa na direcção do estômago tendo o cuidado de não perfurar o pâncreas. B) O passo final é a remoção do pâncreas do tecido conjuntivo sobre o intestino delgado e as últimas poucas ligações para a cavidade peritoneal. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig6.jpg" /> Figura 6. Os pâncreas inflacionados. Uma remoção pâncreas sucesso trará um pâncreas perfusão com a solução de colagenase. Pobre excisão vai deixar um menor, pâncreas esvaziado. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig7.jpg" /> Figura 7. Quatro camadas do gradiente de Ficoll. As quatro camadas distintas representar uma diferendensidade Ficoll t de 25% na parte inferior a 11% na parte superior. A disposição em camadas distintas é imperativo para remover detritos e exócrina desuso a partir das ilhotas. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig8.jpg" /> Seleção Figura 8. Ilhéu. Ilhotas saudáveis ​​tendem a ter um marrom dourado com a cor marrom escuro com uma forma esférica redonda e não estão ligados a acinar tecido. Após uma incubação durante a noite (16-20 horas) de um centro necrótico desenvolve em ilhotas maiores, que devem ser excluídos a partir de experimentos. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig9.jpg" /> Figura 9. Alta qualidade resultados de produção cAMP representativa, demonstrando que insul secretadano pode ser medido a partir do meio da estimulação do AMPc. A) ilhéus isolados de tipo selvagem ou do gene knockout mice foram estimuladas com 11,1 mM de glucose e produção de cAMP intracelular foi medida e normalizada para a proteína total celular. B) insulina secretada foi medido usando um padrão de ELISA de insulina, e também normalizada para celular total proteína. Em muitos casos, a mudança da produção de cAMP directamente correlacionada com o aumento da glucose no estimulou a secreção de insulina. n = 3 para cada grupo; *, P &lt;0,05. Esta figura foi adaptada a partir de uma pesquisa publicada em Kimple et al 10.

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A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

65.1K visualizações.  University of Wisconsin-Madison.  Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β. 

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Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolamento Islet murino de pâncreas

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and exercise. However, these approaches do not address the underlying causes of balance decline. Using mice, the impact of near infrared light (NIr) on the metabolism of cells in the vestibular sensory epithelium was assessed. Data collected shows that this simple and safe intervention may protect these vulnerable cells from the deleterious effects of natural aging. mRNA was extracted from the isolated peripheral vestibular sensory epithelium (crista ampullaris and utricular macula) and subsequently transcribed into a cDNA library. This library was then probed for the expression of ubiquitous antioxidant (SOD-1). Antioxidant gene expression was then used to quantify cellular metabolism. Using transcranial delivery of NIr in young (4 weeks) and older (8 - 9 months) mice, and a brief treatment regime (90 sec/day for 5 days), this work suggests NIr alone may be sufficient to improve mitochondrial function in the vestibular sensory epithelium. Since there are currently no available, affordable, non-invasive methods of therapy to improve vestibular hair cell function, the application of external NIr radiation provides a potential strategy to counteract the impact of aging on cellular metabolism inthe vestibular sensory epithelium.

Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Mitochondrial dysfunction is a hallmark of cellular senescence. This paper uses non-invasive near-infrared (NIr) treatment to improve mitochondrial function in the aging mouse vestibular sensory epithelium.

Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...