Vorremmo ringraziare Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar per l&#39;assistenza tecnica di esperti sui protocolli descritti in questo lavoro. Inoltre, vorremmo riconoscere il mentoring di Christopher B. Newgard alla Duke University e Alan D. Attie presso l&#39;Università del Wisconsin-Madison, con il supporto dei loro membri di laboratorio, che ci ha permesso il tempo e il supporto necessario per ottimizzare l&#39; protocolli descritti. In particolare, ringraziamo Hans HOHMEIER, Danhong Lu, e Helena Winfield nel Laboratorio Newgard e Maria Rabaglia nel Laboratorio Attie per le discussioni produttive e consigli. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DK080845 sovvenzione e Juvenile Diabetes 594 Research Foundation concessione 17-2011-608 (a MEK)

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con la prevalenza di diabete proiettate a pregiudicare il 7,7% della popolazione mondiale, l&#39;esigenza di nuove tecniche di ricerca è fondamentale sia per capire e curare il diabete 18. L&#39;attuale isolamento delle isole è un protocollo ben consolidata utilizzati per la sperimentazione in vitro ed è stato presentato in precedenza con lievi modifiche 11,14,16. Anche se la secrezione di insulina è un&#39;applicazione a valle comune di isole isolate, concentrandosi su componenti a monte, come ad esempio cAMP, può aiutare a delineare meccanismi potenzia la produzione di insulina e la secrezione. La scelta dell&#39;eutanasia deve essere fatta minuziosamente per assicurare sia il trattamento umano degli animali da laboratorio, nonché l&#39;integrità delle misure sperimentali. Per l&#39;isolamento delle isole, dissanguamento sotto anestesia è il nostro metodo preferito per l&#39;eutanasia in quanto permette isolotto perfusione di sangue ossigenato per la quantità massima di tempo prima del pancreasinflazione. CO 2 inalazione è una scelta sbagliata per l&#39;eutanasia, come se essa è stata eseguita secondo protocolli umane, espone gli isolotti al sangue scarsamente ossigenato per almeno 5-6 minuti prima della procedura può iniziare. Dislocazione cervicale senza anestesia potrebbe essere un metodo accettabile con giustificazione scientifica, ma ciò richiederebbe una notevole esperienza sia con il metodo di eutanasia e la dissezione mouse e gonfiaggio pancreas, al fine di assicurare la morte umana e conservazione della funzione isolotto. Nella scelta dissanguamento sotto anestesia, Avertin è l&#39;anestetico preferito in questo protocollo. La scelta particolare di Avertin è che è una azione rapida e profonda anestesia con molti vantaggi rispetto ad altri anestetici comunemente usati. In primo luogo, Avertin non si dilata vascolare e induce il rilascio di ossido di azoto, come fa isoflurane 19. Isole pancreatiche sono altamente vascolarizzati, e quindi la loro biologia possono essere influenzati negativamente da exposur isofluranoe. In secondo luogo, Avertin non eccessivamente aumentare i livelli di glucosio nel sangue in assenza di iniezione glucosio, come ketamina / xilazina, che ha dimostrato di aumentare il glucosio nel sangue 167% fino a un&#39;ora dopo l&#39;iniezione 20. Infine, l&#39;intervallo terapeutico per pentobarbital è molto stretta in topi 21, aumentando la probabilità di danno ipossico alle isolette. Nel presente protocollo, l&#39;uso di filo di sutura per legare il dotto biliare comune vicino sfintere di Oddi è utilizzata come alternativa a una pinza emostatica. Il metodo del filo consente una maggiore manovrabilità del dotto biliare comune e aiuta la posizione dell&#39;ago per cateterismo. Tuttavia, l&#39;uso di filo durante questa fase richiede possesso di due oggetti (Discussione e siringhe), mentre il emostato permette una mano libera per contribuire a posizionare il dotto biliare. Entrambe le tecniche di isolamento producono un numero simile di isolotti e vitali come mostrato con il lavoro precedente, nel nostro laboratorio e altri 10,22. Inoltre, incannulamento needimensione dle, la posizione e angolo dipende dalle preferenze dell&#39;utente. In particolare, un ago G 30 è utilizzato in questo protocollo, ma in altre dimensioni può essere richiesto sulla base di sforzo o background genetico. Ad esempio, i topi BTBR hanno un dotto biliare comune molto friabile e un calibro più grande può fornire una maggiore tenuta attorno alla punta dell&#39;ago (MEK, osservazioni personali). Pertanto, si raccomanda di avere gli angoli aghi cannula di dimensioni diverse su mano durante l&#39;intervento chirurgico, pronti a passare se necessario. La posizione dell&#39;ago nel dotto biliare comune avrà anche un impatto notevolmente la resa isolotto. Se l&#39;ago è posizionato di fronte alla biforcazione del dotto biliare comune, soluzione di collagenasi entrerà nel fegato e causare una scarsa inflazione. Tuttavia, se l&#39;ago è posizionato troppo vicino alla sfintere di Oddi, si verificherà un inflazione pancreatico parziale, diminuendo il numero di isole isolate. Inflazioni pancreatiche di prova con i vari formati dell&#39;ago e posizioni sul dotto biliare comune saranno requirosso per personalizzare la presente procedura e massimizzare la resa isolotto. Un altro componente importante di questa procedura per aumentare il numero di isolotti vitali è quello di preparare tutti i reagenti secondo le istruzioni protocolli. Gasare i buffer con il 95% O 2/5% di CO 2 per aumentare l&#39;ossigenazione può un fattore di sopravvivenza isolotto in tutto il protocollo. Lavoro precedente dimostra che la concentrazione di ossigeno diminuisce verso l&#39;interno del isolotto, riducendo potenzialmente il contenuto energetico del β-cellule 23. Questo può essere evidente dopo una notte di incubazione come scuro, centro necrotico apparirà in isolotti coltivate, che correla con una diminuzione della reattività in vitro. Così, fornendo abbastanza ossigeno contribuirà ad aumentare il numero di isole e vitalità durante l&#39;isolamento e nella notte, processo di incubazione normossico. Inoltre, il corretto preparazione della soluzione di collagenasi migliorerà la digestione del tessuto pancreatico e liberare tegli isolotti dal tessuto circostante. Se la concentrazione di collagenasi è troppo bassa, non solo la resa isolotto essere bassa, ma il tessuto esocrino acinoso può rimanere attaccato alle isole, influenzando negativamente applicazioni a valle. D&#39;altra parte, troppo alto di una concentrazione collagenasi può distruggere gli isolotti. Pertanto, misure adeguate di controllo della qualità per garantire l&#39;efficienza collagenasi digestione senza la distruzione di isolotti promuoveranno maggiori rendimenti. Collagenase isolato dal Clostridium histolyticum è l&#39;enzima utilizzato per liberare le isole dal tessuto pancreatico in questo protocollo. Il irriproducibilità dell&#39;attività enzimatica tra diversi lotti di collagenasi ha il potenziale per ostacolare la quantità e / o qualità di isole isolate. Nel presente protocollo, ogni nuovo lotto di collagenasi enzima passa attraverso un controllo di qualità interno per determinare sia la quantità e la funzionalità delle isole prima che siano soggette a studiare. Pertanto, downstrapplicazioni EAM e molto di variazione devono essere considerati quando si sceglie un enzima per l&#39;isolamento delle isole. Liberase ® (Roche), una miscela collagenasi purificata, è un&#39;altra alternativa enzima digestivo che ha avuto successo in molti casi; in particolare, per ottenere elevate quantità di isolette isolate 24,25. Tuttavia, l&#39;uso di Liberase non può essere utile per isolare isolotti funzionali, come può ostacolare in funzione vitro 26. Esistono molte limitazioni nelle attuali procedure di isolamento delle isole e determinazione cAMP che possono ostacolare applicazioni a valle. Come precedentemente affermato, topi BTBR hanno un condotto molto fragile biliare comune, che aumenta la difficoltà di inflazione pancreatica e successivo isolamento isolotto. Pertanto, miscelazione di preparazioni isolotto di diversi topi possono essere richiesti, come molti in vitro, tra cui il saggio cAMP descritto, richiedono molte isolette per replica. Inoltre, utilizzando IBMX nel blocco saggio cAMPattività s fosfodiesterasi, dando una lettura-out della produzione di cAMP. L&#39;aggiunta di IBMX potrebbe non essere consigliabile nei casi in cui la ciclistica della produzione di cAMP e degrado è importante per la segnalazione cellulare. Tuttavia, la rimozione IBMX da questo protocollo riduce significativamente il contenuto finale cAMP degli isolotti, che richieda l&#39;aggiunta di molti altri isolotti per replica al fine di ottenere valori significativi cAMP nella VIA. Il presente protocollo è uno strumento essenziale per un laboratorio isolotto di biologia o di coloro che sono interessati nel pancreas endocrino. Il componente cAMP a questo protocollo è solo uno dei molti esperimenti in vitro per capire come manipolazione isolotto attraverso vari trattamenti possono migliorare o secrezione di insulina smussato. Sebbene la maggior parte delle ricerche utilizzando isolotti si concentra principalmente sulla β-cellule di secrezione di insulina, altri tipi di cellule possono essere valutati per i loro rapporti dinamici all&#39;interno dell&#39;isolotto 4. In combinazione con altri in vitro ed in vivo modelli, isolotto sperimentazione farà luce sui meccanismi alla base delle malattie pancreatiche legate devastanti come il diabete e insulinoma. Ancora più importante, capire come gli agenti farmaceutici impatto diretto isolotti migliorerà l&#39;efficacia del trattamento e l&#39;aiuto nella traduzione di un modello in vivo.

La rigorosa manutenzione di euglicemia è indispensabile per evitare morbosità come la neuropatia, nefropatia e retinopatia, che sono tutte caratteristiche della patologia di incontrollata di tipo 1 e 2 il diabete 1. Funzione β-cellulare ridotto e di massa sia di tipo 1 e diabete 2 perturbano le concentrazioni di glucosio nel sangue 2. Considerando che tipo immuno-mediata 1 diabete risultati da una perdita devastante di β-cellule che producono insulina, alterata secrezione di insulina β-cellulare e la segnalazione periferica all&#39;insulina nel diabete di tipo 2 insieme promuovono iperglicemia, dislipidemia, e aumento della produzione epatica di glucosio, che alla fine si traduce in sia la perdita della massa β-cellulare e la secrezione di insulina capacità da singoli β-cellule 3. La comprensione dei meccanismi alla base β-cellule nella progressione di tipo 1 e diabete 2 si spera, darà luogo a nuove terapie per prevenire e curare queste malattie. In vitro timodelli di coltura SSUE, come l&#39;INS-1 e MIN6 immortalati linee di β-cellule, possono essere strumenti utili per la comprensione delle funzioni β-cellulari specifici. Tuttavia, le interazioni tra i diversi tipi cellulari all&#39;interno isolotto si possono regolare la funzione β-cellulare. Ad esempio, l&#39;influenza paracrina di glucagone (rilasciato da α-cellule) e somatostatina (rilasciato da δ-cellule) in aumentando e diminuendo la secrezione di insulina, rispettivamente, dimostra l&#39;importanza della prossimità cella cella nella risposta endocrina 4. Inoltre, giunzioni gap tra β-cellule potenziano il rilascio di insulina 5. Inoltre, sebbene progressi sono stati fatti nel generare linee insulinoma che meglio replicato la risposta fisiologica di isole isolate al glucosio (ad esempio, l&#39;INS-1-derivato 832/13 e 832/3 linee cellulari), la rispondenza glucosio differenti rispetto ratto normale isolotti 6,7. Inoltre, la risposta di queste linee cellulari clonali insulinomaal peptide-1 (GLP-1) agonisti glucagone-simile possono differire notevolmente l&#39;uno dall&#39;altro, così come da isolotti normali 6. Pertanto, le linee cellulari immortalizzate non possono rappresentare il modello migliore per saggiare gli agenti che hanno un impatto sulla produzione di cAMP. In contrasto con le linee cellulari derivate insulinoma, studiando funzione β-cellula esclusivamente in modelli animali interi offre una propria serie di complicazioni. Una delle maggiori sfide nel lavoro con tessuto endocrino sta misurando la concentrazione precisa di ormone rilasciato. In particolare, il fegato gioca un ruolo importante metabolizzare insulina, e il pancreas flusso sanguigno va direttamente al fegato. Così, una misura insulinemia non può ritrarre con precisione le quantità di insulina essere secreti dal pancreas stesso o l&#39;impatto di trattamenti diversi sul tasso di secrezione insulinica 8. Inoltre, il metabolismo renale di glucagone può limitare l&#39;affidabilità di uscita glucagone dall&#39;Islet α-cellule 9. Pertanto, isolando isole primari di topo per la sperimentazione in vitro fornisce una comprensione più precisa di come l&#39;isolotto sta rispondendo a stimoli specifici per integrare le misurazioni effettuate in vivo. Il presente protocollo per l&#39;isolamento di isole di topo è un protocollo ben consolidata utilizzato da un certo numero di gruppi (con lievi modifiche che possono contribuire ad aumentare il successo) 10,11. Inoltre, la determinazione della produzione di cAMP consente una lettura diretta della reattività incretin delle β-cellule. In combinazione con la misurazione cAMP, contenuto proteico e la secrezione di insulina possono anche essere quantificato dal medesimo preparazione del campione cAMP, contribuendo a determinare se un difetto nella funzione β-cellula si trova prossimale o distale di cAMP 10. Il contenuto di cAMP e l&#39;applicazione finale secrezione insulinica in questo protocollo può essere uno strumento molto potente per comprendere l&#39;influenza delle componenti farmaceutici, alimentari, tra l&#39;altros, in cAMP e la secrezione di insulina. Oltre alla stimolazione da solo glucosio, altri composti possono essere utilizzati per misurare le variazioni di cAMP e secrezione insulinica 10,11. Infine, anche se l&#39;insulina è il principale ormone che saggio da isole isolate, altri ormoni, quali il glucagone e la somatostatina, così come le citochine, eicosanoidi e adenosina monofosfato ciclico, può anche essere misurata, mediante un saggio stimolazione transiente o quantificazione di ai livelli del terreno di coltura 12. Infine, anche se al di fuori del campo di applicazione di questo manoscritto, isolamento delle isole con il metodo di isolamento collagenasi descritto consente per la conservazione isolotto in modo che molte altre applicazioni a valle possono essere perseguiti, come il trapianto di isole, l&#39;isolamento di RNA per quantitativa in tempo reale PCR o microarray analisi, proteine isolamento per Western blotting, isolotto incorporamento e di imaging immunofluorescenza, e l&#39;incorporazione di [3H]-timidina come misura di replicazione delle cellule insularizione, alcuni dei quali sono stati descritti in precedenti articoli JoVE 13-16. Nel complesso, seguendo la procedura di isolamento delle isole descritta nel protocollo può fornire un ricercatore con informazioni importanti e utili per lo sviluppo di terapie e promuovere la scoperta di farmaci volti a migliorare la funzione β-cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Collagenase: Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C7657</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9378</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hanks Balanced Salt Solution 10X</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>14065-056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Hepes</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">RPMI 1640 (powder)</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">31800-022</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3/0 Silk Suture Thread</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>18020-30</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">0.8 mm Forceps&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11050-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14061-10</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:235px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15003-08</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td style="width:136px;">14002-14</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">5ml BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309646</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">1ml BD syringe</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">309628</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">30 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305106</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">27 G BD Needle 1/2&#34; Length</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sharpening Stone</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">29008-01</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-2-2 tribromoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T48402-25G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486-100mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:235px;">Monopotassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P0662</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">Sodium Bicarbonate (NaCHO3)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">CaCl2 *2H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C3881</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">MgSO4 *7H2O</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M9397</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:235px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30088.03HI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:235px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">5879-100MG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular camp determination

La glicemia incontrollata è una caratteristica del diabete mellito e promuove patologie come la neuropatia, nefropatia e retinopatia. Con la crescente prevalenza del diabete, sia immuno-mediata di tipo 1 e obesità legati tipo 2, gli studi volti a delineare fisiopatologia del diabete e dei meccanismi terapeutici sono di importanza critica. I β-cellule delle isole pancreatiche di Langerhans sono responsabili opportunamente secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio nel sangue. Oltre al glucosio e altri nutrienti, i β-cellule sono stimolate dagli ormoni specifici, incretins, che sono secreti dall&#39;intestino in risposta ai pasti e agire sui recettori β-cellule che aumentano la produzione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (definito cAMP). Diminuzione della funzione β-cellulare, massa, e la reattività incretine sono ben compresi, per contribuire alla fisiopatologia del diabete di tipo 2, e sono anche sempre più collegate with diabete di tipo 1. L&#39;attuale topo isolamento delle isole e il protocollo determinazione cAMP possono essere uno strumento per aiutare a delineare i meccanismi che promuovono la progressione della malattia e gli interventi terapeutici, in particolare quelli che sono mediate dai recettori incretine o recettori che agiscono attraverso la modulazione della produzione di cAMP intracellulare legato. Mentre saranno descritte soltanto misurazioni cAMP, il protocollo di isolamento isolotto descritto crea un preparato pulito che consente anche per molte altre applicazioni a valle, come il glucosio stimolata la secrezione di insulina, [3 H]-timidina, proteine ​​abbondanza, e l&#39;espressione di mRNA.

Per garantire un alto rendimento isolotto durante l&#39;isolamento, tecniche chirurgiche descritte nel protocollo devono essere seguiti attentamente. Sebbene le tecniche qui presentate saranno su misura per ogni laboratorio, ci sono alcuni passaggi critici che porterà ad un isolamento di successo. Al fine di rendere il dotto biliare comune facilmente accessibile, si raccomanda che gli organi spostati a destra del mouse (Figura 1). Inoltre, questo permetterà il pancreas a gonfiare con una quantità inferiore di resistenza poiché ci sarà minore espansione peso limitazione. Un altro passo fondamentale per massimizzare la resa isolotto è la legatura del dotto biliare comune vicino alla sfintere di Oddi (figure 2A-C). Legando più lontano dallo sfintere di Oddi può provocare una parziale inflazione riducendo la quantità di soluzione di collagenasi entrare nel dotto pancreatico principale. Inoltre, un nodo teso impedirà soluzione di collagenasi di entrare nell&#39;intestino. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Una corretta incisione nel dotto biliare comune deve essere posizionato lontano dalla biforcazione dal fegato ma abbastanza vicino per gonfiaggio pancreatica massima (Figura 3). Un&#39;incisione fatta troppo vicino alla biforcazione può portare al flusso di soluzione di collagenasi nel fegato. Quando la soluzione collagenasi entra nel fegato, perderà il suo colore rosso scuro e cominciare a girare biancastra. In questo caso, rimuovere l&#39;ago e provare un altro incannulamento ulteriormente dal fegato. Inoltre, il dotto biliare comune incisione dovrebbe essere solo in parte attraverso il condotto (circa 50%). Completamente troncatura del condotto renderà difficile per sigillare il condotto intorno alla punta dell&#39;ago. Una corretta incisione provocherà la chiusura completa del condotto intorno all&#39;ago, producendo una pressione sufficiente a riempire la bile sia comune e pancreatiche (Figura 4A). E &#39;inoltre importante garantire l&#39;ago è entrato il dotto biliare comune e non la guaina circostante.Una volta che l&#39;ago è stato inserito correttamente, 5 ml della soluzione di collagenasi devono riempire il pancreas, creando un tessuto marmorizzato. Il processo di rimozione pancreas deve essere eseguita delicatamente per promuovere la massima resa isolotto (Figura 5). Piercing pancreas può comportare una deflazione e perdita della soluzione di collagenasi, riducendo la resa isolotto. Tagliare il pancreas vicino al tessuto connettivo e altri organi impedirà sgonfiaggio. Inoltre, la raccolta di altri tessuti, come tessuto connettivo, insieme con il pancreas non è un problema, come verrà rimosso nei passaggi successivi. A pancreas completamente rimosso rimane gonfio dopo escissione prima ulteriore digestione con collagenasi (Figura 6). Strati distinti nel gradiente Ficoll porterà ad una preparazione isolotto pulita e creare un ambiente più facile per scegliere isolotti (Figura 7). La pendenza assicura la separazione di isolotti dadetriti cellulari e del tessuto connettivo che rimane dopo la digestione e schermo maglia filtrante. Inoltre, questo passaggio è cruciale per la selezione puliti, isolotti sani per successivi utilizzi. In particolare, isolotti sani saranno di forma sferica e hanno un colore marrone dorato al centro marrone scuro (Figura 8). Nota: Le isole di topi diabetici saranno molto più pallido di colore, corrispondente alla riduzione del contenuto di insulina, e possono essere meglio distinto dal tessuto acinare per la loro forma, la lucentezza e la loro rete di capillari visibili. Eventuali isolotti collegati al tessuto acinare non devono essere utilizzati e devono essere eliminati. Inoltre, isolotti più grandi che sviluppano un buio, un centro necrotico dopo una notte di incubazione devono essere eliminati in quanto non funzionano correttamente. Come descritto in premessa, la produzione di cAMP è una componente importante della funzione β-cellulare; in particolare, per quanto riguarda l&#39;azione incretine. Un vantaggio per il protocollo descritto in questo riunito<html> hod è che si può avere contemporaneamente la produzione di cAMP e dati secrezione di insulina glucosio-stimolata. In genere, l&#39;impatto di un agente sulla produzione di cAMP correla direttamente con il suo impatto sulla secrezione di insulina 17. Per gli esperimenti semplici, questa regola vale abbastanza bene (vedi Figura 9 per un esempio). Nel presente protocollo, utilizziamo IBMX (un inibitore della fosfodiesterasi) nei nostri trattamenti per prevenire il catabolismo del cAMP, dando la produzione totale di cAMP. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig1.jpg" /> Figura 1. Cilindrata di organi interni. Posizionando gli organi interni al lato destro del mouse crea un ambiente di lavoro più facile e permette la camera pancreas di espandersi durante il gonfiaggio. <html> Figura 2 &quot;fo: content-width =&quot; 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Legare fuori la sfintere di Oddi (AC). Raffigurato ecco l&#39;ingresso del dotto biliare comune al piccolo intestino al sfintere di Oddi. Legatura del dotto biliare comune al sfintere di Oddi impedisce soluzione di collagenasi di entrare intestini. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig3.jpg" /> Figura 3. Comune incisione dotto biliare. E &#39;meglio fare un taglio nel dotto biliare comune, leggermente distale alla biforcazione nel fegato per impedire il flusso della soluzione di collagenasi nel fegato. 0374/50374fig4highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50374/50374fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Incannulazione del dotto biliare comune da una smussata 30 ago G e l&#39;inflazione pancreas. A) L&#39;ago G 30 è inserito nel dotto biliare comune, creando una tenuta intorno alla punta dell&#39;ago. È importante controllare e da notare che l&#39;ago è stato inserito nel dotto biliare comune e non la guaina circostante. Un ago inserito correttamente avrà un aspetto opaco. B) Una corretta inflazione pancreas si riempirà di circa 3-5 ml di soluzione di collagenasi e hanno un aspetto marmorizzato. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig5.jpg" /> Figura 5. La rimozione del pancreas. A) L&#39;incisione iniziale effettuata con un paio di forbici curve si verifica vicino alla sfintere di Oddi. Il rem inizialeovale inizia nella direzione dello stomaco facendo attenzione a non forare il pancreas. B) Il passo finale è la rimozione del pancreas dal tessuto connettivo sul piccolo intestino e ultimi connessioni alla cavità peritoneale. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig6.jpg" /> Figura 6. Il pancreas gonfiati. Una rimozione pancreas successo produrrà un pancreas perfuso con soluzione di collagenasi. Scarso escissione lascerà un piccolo, pancreas sgonfiato. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig7.jpg" /> Figura 7. Quattro strati del gradiente Ficoll. I quattro strati distinti rappresentano un differenzialedensità t Ficoll dal 25% al ​​fondo per l&#39;11% al top. La stratificazione distinto è indispensabile per rimuovere i detriti e esocrine disuso dagli isolotti. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig8.jpg" /> Figura 8. Selezione Islet. Isolotti sani tendono ad avere un colore marrone dorato al marrone scuro con una forma sferica rotonda e non sono collegati a acinar tessuto. Dopo una notte di incubazione (16-20 ore), un centro necrotico si sviluppa nelle isole più grandi, che dovrebbero essere esclusi da esperimenti. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50374/50374fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50374/50374fig9.jpg" /> Figura 9. Rappresentante di alta qualità, risultati di produzione di cAMP, dimostrando che isol secretoin può essere misurata dal mezzo di stimolazione cAMP. A) Isolato isolotti da wild-type o gene topi knockout sono state stimolate con glucosio 11,1 mM e produzione di cAMP intracellulare è stato misurato e normalizzato alla proteina cellulare totale. B) Secernuto insulina è stata misurata utilizzando un insulina ELISA standard, e normalizzata alla totale cellulare proteina. In molti casi, la variazione della produzione di cAMP correla direttamente con l&#39;aumento in glucosio stimolata la secrezione di insulina. n = 3 per ogni gruppo; *, P &lt;0,05. Questa cifra è stata adattata da una ricerca pubblicata nel Kimple et al 10.

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A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

65.1K Views.  University of Wisconsin-Madison.  Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare. 

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Murine Pancreatic Islet Isolation

Murino pancreatica isolamento Islet

Ricerca

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and exercise. However, these approaches do not address the underlying causes of balance decline. Using mice, the impact of near infrared light (NIr) on the metabolism of cells in the vestibular sensory epithelium was assessed. Data collected shows that this simple and safe intervention may protect these vulnerable cells from the deleterious effects of natural aging. mRNA was extracted from the isolated peripheral vestibular sensory epithelium (crista ampullaris and utricular macula) and subsequently transcribed into a cDNA library. This library was then probed for the expression of ubiquitous antioxidant (SOD-1). Antioxidant gene expression was then used to quantify cellular metabolism. Using transcranial delivery of NIr in young (4 weeks) and older (8 - 9 months) mice, and a brief treatment regime (90 sec/day for 5 days), this work suggests NIr alone may be sufficient to improve mitochondrial function in the vestibular sensory epithelium. Since there are currently no available, affordable, non-invasive methods of therapy to improve vestibular hair cell function, the application of external NIr radiation provides a potential strategy to counteract the impact of aging on cellular metabolism inthe vestibular sensory epithelium.

Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Mitochondrial dysfunction is a hallmark of cellular senescence. This paper uses non-invasive near-infrared (NIr) treatment to improve mitochondrial function in the aging mouse vestibular sensory epithelium.

Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l&#39;espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...