Este trabalho foi suportado pelo financiamento do National Institutes of Health (R21 NS45037 subsídios e R01 ES014901).

1. Preparação de meio de cultura (meio de C2) <ol><li> Adicionar o seguinte, na ordem listada, para um estéril, 500 ml descartável Erlenmeyer: <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidade </td><td> Componente </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (glicose baixa) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> de ácido gordo livre de BSA (20mg/ml em DMEM) </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-Glutamina </td><td> 1,4 mM </td></tr><tr><td> 4 ml </td><td> insulina / transferrina / selénio (100x) </td><td> 10 ug / ml de insulina 5,5 ug / ml de transferrina 38,7 nM de selénio </td></tr><tr><td> 0,4 ml </td><td> NGF (125 ug / ml) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> Ham F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> Agite suavemente to mix e alíquota de 10 ml por tubo de 17 x 100 tubos estéreis tampa de pressão. </li><li> Armazenar a -80 ° C </li><li> Notas importantes: <ul type="disc"><li> Descongele NGF imediatamente antes do uso. </li><li> Antes de alíquotas da solução de estoque de NGF, pré-revestimento das paredes interiores do pipeta de plástico de cultura de tecidos serológica com a proteína para minimizar aderência de NGF para o plástico. Abordagem mais fácil é a Pipetar a mistura DMEM contendo os tempos de BSA vários. Lavar o tubo de NGF por várias vezes com a mistura de DMEM. </li><li> Adicionar F-12 passado porque cisteína livre pode desestabilizar ligações dissulfureto na insulina. </li><li> Não congelar em volumes superiores a 10 ml por CaPO4 cristais podem formar </li><li> Não congelar e descongelar C2 médio mais de 2 vezes. </li></ul></li></ol> 2. Preparação de lamínulas <ol><li> Descobrimos que só finas lamínulas alemães trabalhar de forma consistente neste protocolo (ver Tabela 1 para fonte recomendada e número de catálogo). </li><li> Adicionar 75-100 ml de 70% de ácido nítrico a 300 ml de garrafas de vidro de amostras de politetrafluoroetileno (PTFE forros ou Teflon) da tampa (Fisher # catálogo 09-911-765). </li><li> O uso de luvas, gota lamelas uma por uma, para a solução de ácido nítrico. Adicionar lamelas suficientes para fazer uma camada de não mais do que 2-3 lamelas de espessura no fundo do frasco. </li><li> Agitar suavemente os recipientes com as lamelas durante 6-8 horas à temperatura ambiente em um conjunto agitador orbital durante não mais do que 185 rpm. </li><li> Trabalhando em um exaustor, decantar cuidadosamente o ácido e eliminar de acordo com os regulamentos locais. Lavar as lamínulas uma vez com ultra-pura cultura de tecidos de água-grade, em seguida, adicionar 75-100 ml de água para o recipiente. Lamelas podem ser lavados várias vezes se a água ficar turva. Agitar suavemente à temperatura ambiente durante a noite sobre um conjunto agitador orbital durante não mais de 185 rpm. </li><li> Repita a sequência acima de ácido nítrico / água de grau de cultura de tecido por dia para um total de 3 dias. </li><li> Decantar a finalgrau de cultura de tecido de água e adicionar acetona o suficiente para conseguir cobrir as lamelas. </li><li> Decantar este acetona e dispor adequadamente. </li><li> Transferir para um lamelas 150 milímetros prato de vidro de Petri. Adicionar acetona o suficiente para conseguir cobrir as lamelas. Garantir as lamelas são em uma única camada no prato. </li><li> Permitir que a acetona evapore durante a noite em um exaustor. </li><li> Lamelas assar em um forno de secagem a 180 ° C durante 1,5 horas para esterilizar. </li></ol> 3. Preparação de Lamelas para a Cultura <ol><li> Um dia antes da dissecção, adicionar uma vidro lamela (preparado tal como descrito acima) a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido usando uma técnica estéril. Adicionar 200 uL de solução de poli-D-lisina estéril (100 mg / ml em 0,5 M de tampão Tris, pH 8) a cada poço e armazenar a placa a 4 ° C durante a noite. </li><li> O dia da dissecção, e idealmente, antes de iniciar a dissecção, aspirar a solução de poli-D-lisina de cada poço e lavar cada cavidade 5 vezescom água de grau estéril de cultura de tecidos. </li><li> Adicionar 200 uL de glucose-baixo DMEM a cada placa e armazenar em 37 ° C incubadora. Aproximadamente 1 hora antes de as células em placas, remover-glucose baixo DMEM e adicionar 250 meio C2 uL por poço. Placas de armazenar a 37 ° C sob 5% de CO 2 até que as células estão prontas para ser revestido. </li></ol> 4. Dissecção e isolamento do gânglio cervical superior <ol><li> Culturas dissociadas de neurónios simpáticos são geralmente preparadas por dissociação de gânglios cervicais superiores (SCG), colhidas a partir de pré-natal (dia embrionário 19-21) crias de rato, porque há menos células gliais. No entanto, este mesmo protocolo pode ser utilizado com sucesso com iniciais pós-natais filhotes (1 a 3 dias de idade) de ratos ou crias de rato perinatal. </li><li> Euthanize rato grávida via inalação de CO 2. Raspar o abdômen e lavar a pele com etanol 70%. Remover os cornos uterinos sob condições estéreis e colocar os cornos uterinos em 150 milímetros uma placa de Petri estéril. Evitardanificar os intestinos ou outros órgãos internos da barragem durante a dissecção. </li><li> Coloque a placa de Petri com os filhotes em uma bandeja de gelo para anestesiar os filhotes embrionárias. Dissecar os embriões livres do corno uterino e da membrana amniótica. Cortar o cordão espinhal de cada filhote ao longo da linha média sob o ombro para sacrificá os filhotes. Isto também corta a veia cava, o que reduz o sangramento da artéria carótida durante a dissecção do SCG. Uma vez dissecada livre da trompa uterina, os embriões colocar num estéril de Leibovitz meio L-15 (ou qualquer meio de ar tamponada) suplementado com penicilina e estreptomicina. </li><li> Colocar os embriões de costas sobre uma placa de Petri 150 milímetros meio-cheio com Sylgard. Usando estéreis 20 agulhas de calibre, prender o tórax ea cabeça, delicadamente a hiperextensão do pescoço, o que facilita a dissecção da SCG. </li><li> Faça uma incisão na linha média ao longo do pescoço ao nível das clavículas para revelar as glândulas submandibulares. Remover as glândulas utilizando fórceps finos (nó. 4 ou não. 5 Dumont) para expor a camada muscular. </li><li> Use a pinça fina para cortar o músculo esternocleidomastóideo perto da clavícula. Em seguida, levante com cuidado e incisão no músculo omo-hióideo ao lado da traquéia. Este músculo é muito fina, por isso evite cortar demasiado profundamente para evitar rasgar a artéria carótida subjacente e SCG. Uma vez que estas camadas musculares são removidos, a artéria carótida e no nervo vago deve ser claramente visíveis. </li><li> A SCG fica logo abaixo da bifurcação da artéria carótida. Usando fórceps finos (No. 4 ou não. 5), sem corte dissecar tecido afastado de ambos os lados da artéria carótida para expor o gânglio. Usando 2 fórceps finos, agarrar a artéria carótida logo acima e abaixo das extremidades rostral e caudal da SCG, respectivamente, para remover a secção da artéria carótida deitado acima do SCG, bem como a SCG si. É provável que o gânglio nodoso, que se encontra ao lado da SCG, nesta fase do desenvolvimento, também irá ser removido neste passo. Os gânglios nodosos pode ser identified pela sua forma redonda e do nervo vagai grande projecta a partir dele. Este encontra-se junto a um dos ramos da artéria carótida. Em contraste, a SCG é amendoada e encontra-se directamente sob a bifurcação da artéria carótida. Colocar o tecido dissecado em um prato de cultura estéril 35 milímetros contendo L-15 de médio e antibióticos. Retire a SCG de todos os filhotes antes de avançar para as próximas etapas. </li><li> Usando fórceps finos, suavemente separar o SCG a partir da artéria carótida e quaisquer outros tecidos removidos durante a dissecção (particularmente o nervo vago e gânglio nodoso). Use fórceps finos para remover a cápsula a partir de gânglios. Isto reduz grandemente o número de células não neuronais em cultura. Transferir a gânglios para outro prato milímetros estéril contendo 35 L-15 médio. </li><li> Para dissociar a SCG, remover o meio de L-15 e substituir com 2 ml de colagenase (concentração final 1 mg / ml) / dispase (concentração final de 5 mg / ml) em cálcio e magnésio livre de Hank solução de sal equilibrada. Incubaçãote a 37 ° C durante 40 minutos. </li><li> Transferir a SCG para um tubo de 15 ml estéril centrífuga cónica e levar o volume até 10 ml com L-15 suplementado com BSA (concentração final de 1-2 mg / ml). Centrifugar a 200 X g à temperatura ambiente durante 5 minutos. Descartar o sobrenadante e lava-se mais uma vez com L-15 suplementado com BSA. </li><li> Após a segunda lavagem, remover toda a L-15 e ressuspender o gânglios em ~ 2 ml de meio de C2. Tritura-se as células utilizando um incêndio-polido pipeta dobrado ponta, certificar-se a pipeta é revestida com BSA/L15 antes trituração para minimizar aderência de células para o vidro. Tritura-se suavemente vezes 3-4. Deixe as grandes aglomerações repousar cerca de 1 minuto e transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml. Adicionar mais mídia C2 para o restante SCG e triturar. Depois de deixar assentar os aglomerados, transferir a suspensão de células a partir da trituração segundo para que recolhidas após a trituração em primeiro lugar. Repetir este processo várias vezes até que o são na maior parte dos gânglios dissociados. Discard quaisquer aglomerados restantes após a trituração quarto. </li><li> Para as células dissociadas de uma ninhada de crias de rato (tipicamente 12-16 filhotes) e levar o volume total do meio no suspensão de células para 8-10 ml por adição de meio C2 adicional. Suavemente ressuspender as células utilizando uma pipeta e remover uma pequena alíquota para determinar a densidade de células. Ajustar o volume da suspensão de células para conseguir 2X a densidade celular desejada na cultura e, em seguida, sendo certo para manter as células em suspensão, alíquota de 250 ml de suspensão de células por poço. Para estudos morfométricos do crescimento dendrítico, nós, células tipicamente em placas a baixa densidade (~ 5 x 10 células por poço 4) em placas de 24 poços. </li><li> Nosso laboratório incuba culturas Scg em dessecadores de vidro ao invés de diretamente em uma incubadora de CO 2. Fazemos isso porque neurónios simpáticos cultivadas em meio livre de soro um melhor desempenho com um pouco maior concentração de CO 2 (cerca de 6,5%). Além disso, não usamos antibióticos em omeios ur, uma vez que inibe o crescimento de neurites e culturas mantendo no dessecadores parece minimizar a propagação da contaminação se desenvolve em um subconjunto das culturas. Usando este sistema, é rotineiramente manter culturas SCG até 8 semanas. Uma vez revestidos, culturas SCG são colocados sobre a placa de porcelana exsicador em dessecadores de vidro que contêm água estéril no fundo. Aproximadamente 120 ml de CO 2 é injectada no exsicador antes da selagem-la fechada e colocando o exsicador inteiro em um conjunto incubadora para 35,5 ° C. </li></ol> 5. Alimentação e manutenção de culturas <ol><li> As culturas são geralmente alimentados 3 vezes por semana, com a troca meios primeira ocorrendo 24 horas após o plaqueamento. Usando uma pipeta de ponta dobrada estéril, suavemente retirar cerca de metade dos meios de comunicação por poço. Usando uma pipeta limpa dobrada ponta estéril, substituir o volume do meio removido com C2 fresco. </li><li> Para eliminar células não-neuronais a partir da cultura, o agente anti-mitótico cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentração final 1-2 uM) é tipicamente adicionada ao meio de cultura no primeiro meios de troca (eg, 24 horas após o plaqueamento) durante 48 horas. Esta concentração de ARA-C é geralmente suficiente para remover todas as células não neuronais. Se o tratamento ARA-C adicional é necessária, recomenda-se que estes ser feito a cada alimentação outro para minimizar os efeitos tóxicos sobre os neurónios. </li></ol> 6. Induzir o crescimento dendrítico com Matrigel ou BMP-7 <ol><li> Para induzir o crescimento dendrítico, Matrigel ou BMP-7 é adicionada às culturas após células não-neuronais foram eliminados e os níveis de ARA-C nas culturas são significativamente reduzidos. Tipicamente, adiciona Matrigel ou BMP-7 para o meio no dia 5, in vitro, mas o crescimento dendrítica pode ser induzida por Matrigel ou BMP-7 adicionado em qualquer ponto de tempo in vitro. Matrigel ou BMP-7 é adicionado ao meio de C2 e as culturas são alimentados como descrito acima. </li><li> Matrigel e BMP-induzida crescimento dendrítico é o tempoe dependente da concentração. Para os efeitos máximos, Matrigel é adicionado a C2 a uma concentração final de 50-75 ug / ml; BMP-7 é adicionado ao meio de C2 a uma concentração final de 50 ng / ml. As concentrações de Matrigel maior do que 100 ug / ml ou BMP-7 concentrações superiores a 100 ng / ml foram anotados para causar toxicidade neuronal. Processos dendríticas (como determinada por critérios morfológicos) tornar-se aparente de aproximadamente 48 horas após a exposição inicial de Matrigel ou BMP-7 em concentrações maximamente eficazes. Para induzir o crescimento dendrítico robusto, as culturas são alimentados com BMP-7 contendo o meio em cada alimentação. Resultados equivalentes foram obtidos utilizando BMPs 2, 4, 5 e 6 em concentrações comparáveis ​​20,21. </li></ol> 7. Análise imunocitoquímica da BMP-7-induzida crescimento dendrítico <ol><li> Quando o grau desejado de arborização dendrítica tenha sido alcançado, as culturas são fixadas usando paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M. A melhor fixação é umchieved substituindo metade do meio a no poço com paraformaldeído a 4% e repetindo este passo 3-5 vezes ao longo de 10-15 minutos. </li><li> Enxaguar as culturas, substituindo meia paraformaldeído a 4% com tampão fosfato salino (PBS) e repetindo este passo três vezes ao longo de 10 - 15 minutos. </li><li> Remover todo o PBS e adicionar 200 uL de Triton 0,1% X-100 em PBS a cada poço, durante 5 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as células. </li><li> Remover solução de Triton por aspiração e adicionar 200 uL por poço de solução tampão de bloqueio (PBS suplementado com BSA a 3-5% e soro de cabra a 1%). Incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remover o tampão de bloqueio e adicionar o anticorpo primário, microtúbulo proteína associada-2 (MAP2) diluído a 1:2000 - 1:5000 em tampão de bloqueio. Incubar as culturas durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário, lavar as culturas com PBS três vezes ao longo de 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li>Incubar as culturas com o anticorpo secundário diluído em PBS suplementado com BSA a 1% durante 1-2 horas à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as culturas com PBS três vezes ao longo de 10-15 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lamelas de montagem sobre lâminas lado das células para baixo em uma gota de meio de montagem aquoso com o pH apropriado para o fluorocromo marcado para o anticorpo secundário. Manter as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o meio de montagem seco. Lâminas Armazenar a 4 ° C até de imagem. </li><li> Permitir que os slides para equilibrar a temperatura ambiente antes de imagem. Aquisição de imagens fluorescentes, usando um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Tipicamente, o mandril dendrítica inteira de um único neurónio pode ser capturada utilizando uma objectiva 20X e filtros adequados. </li></ol> 8. Os resultados representativos Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de ra perinatalts e cultivadas na ausência de soro e as células gliais ganglionar falhar para estender MAP2 processos imunopositivas (Figura 1), mas sim, tipicamente se estendem apenas um único processo axonal 14,15. A exposição a BMP-7 (Figura 1) ou Matrigel induz a formação de numerosos processos que satisfazem os critérios morfológicos, bioquímicos e funcionais de dendrites 17,18. A atividade dendrite de promoção de qualquer Matrigel ou BMP-7 é a concentração e tempo-dependente 17,18,20. Crescimento dendrítico máxima é observada utilizando concentrações de Matrigel entre 50 e 75 ug / ml ou BMP-7 entre 30 e 100 ng / ml, e uma meia-máximas efeitos são tipicamente observadas em BMP-7 concentrações de ~ 2 ng / ml. No entanto, alterações significativas no crescimento dendrítica pode ser detectada com BMP-7 concentrações tão baixas como 300 pg / ml. A resposta a qualquer dendrítica Matrigel ou BMP-7 é relativamente lento, com &lt;50% dos neurónios formando um segundo processo dentro de 24 horas após a exposição a qualquer dendrite-p<html> romover agente. No entanto, no prazo de 3 dias após a inicial BMP-7 exposição, praticamente todos os neurónios responder a Matrigel maximamente eficaz ou BMP-7 concentrações. O número de neurónios por dendritos continua a aumentar com a exposição contínua a BMP-7, com a maioria das alterações que ocorrem durante os primeiros 10 dias de tratamento. Após 4 semanas, BMP-7-tratados neurónios têm tipicamente 6-8 dendritos primários que exibem secundária, terciária e quaternária, mesmo ramos dendríticas 17. Este aumento na mandril dendrítica ocorre na ausência de qualquer alteração significativa no crescimento axonal, e respostas dendríticas comparáveis ​​podem ser atingida utilizando concentrações semelhantes de BMPs 2, 4, 5 ou 6 20,21. Crescimento dendrítico também pode ser provocada por co-cultura de neurónios simpáticos com endógenos ganglionares células gliais 15,22, no entanto, a resposta dendrítica é significativamente mais lenta sob estas condições. . Jpg &quot;/&gt; Figura 1. BMP-7 promove o crescimento dendrítico nas culturas de neurônios simpáticos. Células não-neuronais foram eliminados do SCG culturas por tratamento com anti-mitótico durante 48 hr início no dia 2 in vitro. Começando no dia 5, in vitro, as culturas foram tratadas com meio de controlo (A) ou meio suplementado com BMP-7, 50 ng / ml (B). No dia 11, in vitro (após 5 dias de tratamento BMP), as culturas foram imunocoradas com mAb contra MAP2, uma proteína que se encontra principalmente no dendritos e somata neuronal. Como mostrado na representativos fotomicrografias de fluorescência, os neurónios cultivados sob condições de controlo não têm dendritos como evidenciado pela falta de MAP-2 dendritos imunopositivas processos (A), em contraste, os neurónios expostos a BMP-7 (B) têm tipicamente vários afunilada MAP-2 imunopositivas dendritos.

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	<li>Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons.">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).</li><li>Miller, J. P., Jacobs, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+neuronal+structure+and+function.">Relationships between neuronal structure and function.</a> J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).</li><li>Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+specificity+and+long-term+information+storage.">Synapse specificity and long-term information storage.</a> Neuron. 18, 339-342 (1997).</li><li>Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+year+of+the+dendrite.">The year of the dendrite.</a> Science. 275, 178-179 (1997).</li><li>Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+consequences+of+abnormal+cortical+development:+insights+into+developmental+disabilities.">Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities.</a> Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).</li><li>Connors, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+mechanisms+in+neurodevelopmental+disorders.">Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders.</a> Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).</li><li>Pardo, C. A., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+autism.">The neurobiology of autism.</a> Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).</li><li>Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+neurodevelopmental+disorders:+meeting+at+the+synapse.">Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse.</a> Science. 302, 826-830 (2003).</li><li>de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia.">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li><li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer's+disease.">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li><li>Jagadha, V., Becker, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology:+an+overview+of+Golgi+studies+in+man.">Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man.</a> Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+I.+Conditions+under+which+neurons+form+axons+but+not+dendrites.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites.</a> Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).</li><li>Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li><li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li><li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li><li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).</li><li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As vantagens deste modelo incluem: (a) as culturas são compostos de uma população homogénea de neurónios simpáticos desprovidas de outros tipos de células 17,23; (b) os requisitos do factor de crescimento de neurónios simpáticos estão bem estabelecidos, o que permite o uso de meio definido, e uma variedade de meios definidos, e substratos funcionar bem para crescimento e manutenção de neurónios simpáticos 23, (c) neurónios nestas culturas responder uniformemente para a actividade promotora de dendrite-Matrigel, BMP-7 e BMPs outros do dpp e 60A subfamílias 17,18,20,21, e (d) Matrigel ou BMP-induzida dendrite formação ocorre na ausência de alterações na sobrevivência das células ou do crescimento axonal 17,18. Este modelo permite o controlo experimental de quando o crescimento dendrítica é accionado, o que torna possível a obtenção de populações de neurónios sincronizados em fases distintas de crescimento dendrítico, por exemplo, que precede imediatamente a formação de dendrites, durante dendr primárioitogenesis (a formação inicial de dendritos primários) e durante as fases posteriores do maturação dendrítica. As limitações mais significativos do modelo incluem as quantidades limitadas de RNA e de proteínas disponível a partir de uma dissecção típico de uma ninhada única, que pode restringir estudos bioquímicos, e alguma dificuldade em manipular a expressão do gene. Recentes avanços em técnicas para expressar cDNA em culturas primárias de células neuronais são rapidamente superar esta desvantagem deste último. Há publicações que relatam a aplicação bem sucedida de sistemas à base de lipídeos de entrega, nucleofection e vetores adenovirais para cultura neurônios simpáticos. As eficiências de transfecção relatados são relativamente baixo (tipicamente variando de 10-20% com lipofecção ou nucleofection e até 30-50% com infecções virais), que é adequado para terminais com base em análises de células individuais, tais como as alterações morfológicas, mas pode ser problemático para muitos pontos de extremidade bioquímicos. Fatores that pode interferir com BMP-induzida crescimento dendrítico em culturas de neurónios simpáticos incluem os neurónios de cultura a uma densidade celular elevada, e incluindo soro no meio de cultura. Embora a razão que a densidade celular elevada atenua a actividade dendrite-promoção de BMPs não é conhecida, é provável que o soro atenua esta actividade, devido BMPs ligar avidamente às proteínas séricas. Curiosamente, o soro em si tem actividade de promoção da dendrite fraco em culturas de neurónios simpáticos 24, e os nossos dados preliminares sugerem que esta actividade é mediada por BMPs, que estão presentes na maioria, se não todos os soros comercial. BMPs também estão presentes em Matrigel, e provavelmente mediar a sua actividade dendrite-promoção. Um terceiro fator que pode impactar a atividade dendrito-promotora de BMPs é manipulação incorreta e armazenamento de BMPs. Não armazenar soluções de reserva de BMP a uma concentração de menos de 0,1 mg / ml. É importante não deixar BMP ações ou soluções de trabalho para tornar-se muito básico e recomendamos que bufferências utilizados para diluir as soluções de reserva têm um pH de 4,5 ± 0,05. Misture todas as soluções vigorosamente antes de alíquotas, mas não tão vigorosamente que as soluções de espuma, e só usar tubos de polipropileno, porque BMPs tendem a ficar com outros plásticos. Não armazenar alíquotas no congelador que têm uma característica de descongelação automática porque o ciclo de temperaturas é suficiente para destruir a actividade de BMP-7. Recomenda-se fortemente que a BMP soluções ser armazenada a -80 ° C e que congelamento-descongelamento ser minimizado (não congelar e descongelar mais de 2-3 vezes). Precauções semelhantes devem ser usados ​​no tratamento de Matrigel. Além disso, recomenda-se que Matrigel ser lentamente descongeladas a 4 ° C. Matrigel não irá induzir o crescimento dendrítica quando usado para pré-revestimento de substratos de revestimento antes de neurónios, é apenas eficaz quando adicionado ao meio de cultura de estabelecidas culturas de células neuronais 18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Bélico </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 Coverslip Rodada mm # Espessura 1, vidro alemão </td></tr><tr><td> Bent ponta pipetas </td><td> Bélico </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P0899-100mg </td><td> Banco de solução a 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Água destilada </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Multa fórceps Dumont n. 4 e 5 </td><td> Belas Ferramentas Ciência (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 20 agulhas </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 de Leibovitz médio </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hank (-Ca,-Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM baixa glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Insulina / Transferrina / Selenium </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> De ácidos gordos livre de BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Bioproducts Harlan </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham meio nutriente F-12 (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Citosina arabinósido </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Evite a repetição de ciclos de congelamento e descongelamento </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP BMP7-07h </td><td> BMPs 4, 5 e 6 funcionam igualmente bem como BMP-7 e por vezes são mais fáceis de obter comercialmente </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescador </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Rato anti-rato MAP2 anticorpo </td><td> Sternberg monoclonais Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anti-rato </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Meios de montagem </td><td> Prolongar Sondas kit Antifade Molecular </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

A forma do mandril dendrítica determina a entrada total sináptica um neurónio pode receber 1-3, e influencia os tipos e distribuição destes 4-6 entradas. Padrões alterados de crescimento dendrítica e plasticidade estão associados com a função neurocomportamental prejudicada em modelos experimentais 7, e são pensados ​​para contribuir para os sintomas clínicos observados em ambas as 8-10 neurodesenvolvimento distúrbios e doenças neurodegenerativas 11-13. Tais observações ressaltam a importância funcional da regulação precisamente morfologia dendrítica, e sugerem que a identificação de mecanismos que controlam o crescimento dendrítico não só avançar na compreensão de como a conectividade neuronal é regulado durante o desenvolvimento normal, mas também pode fornecer informações sobre novas estratégias terapêuticas para diversas doenças neurológicas. Estudos sobre os mecanismos de crescimento dendrítico seria grandemente facilitada pela disponibilidade ofa sistema modelo que permite que os neurónios a ser experimentalmente comutada a partir de um estado em que não se estendem para uma dendritos em que elaborar um mandril dendrítica comparável à do seu em homólogos in vivo. Culturas primárias de neurônios simpáticos dissociados do gânglio cervical superior (GCS) de roedores perinatais fornecer tal modelo. Quando cultivados em meio definido na ausência de soro e ganglionar células gliais, neurónios simpáticos estender um único processo que é axonal, e este estado unipolar persiste durante semanas a meses em cultura 14,15. No entanto, a adição de qualquer proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou 16,17 Matrigel 18 ao meio de cultura desencadeia estes neurónios para estender vários processos que satisfaçam os critérios morfológicos e bioquímicos e funcional para dendrites. Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de roedores perinatais e cultivadas sob condições definidas são uma população homogênea de neurônios 19que respondem de forma uniforme para a actividade promotora de dendrite-Matrigel, BMP-7 e BMPs outros do decapentaplegic (DPP) e subfamílias 60A 17,18,20,21. Importante, Matrigel e BMP-induzida dendrite formação ocorre na ausência de alterações na sobrevivência das células ou do crescimento axonal 17,18. Aqui, nós descrevemos como configurar culturas dissociadas de neurónios simpáticos SCG derivados da de ratos perinatais de modo que eles são responsivos à actividade dendrite-promoção selectiva de Matrigel ou BMPs.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K visualizações.  University of California, Davis. Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

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Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Neurociência

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide sympathetic innervations for the head and neck regions and they constitute a well-characterized and relatively homogeneous population (4).  Sympathetic neurons are dependent on nerve growth factor (NGF) for survival, differentiation and axonal growth and the wide-spread availability of NGF facilitates their culture and experimental manipulation (2, 3, 6).  For these reasons, cultured sympathetic neurons have been used in a wide variety of studies including neuronal development and differentiation, mechanisms of programmed and pathological cell death, and signal transduction (1, 2, 5, and 6).  Dissecting out the SCG from newborn rats and culturing sympathetic neurons is not very complicated and can be mastered fairly quickly.  In this article, we will describe in detail how to dissect out the SCG from newborn rat pups and to use them to establish cultures of sympathetic neurons.  The article will also describe the preparatory steps and the various reagents and equipment that are needed to achieve this.

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

This is a protocol describing how to isolate and culture primary sympathetic neurons from superior cervical ganglia (SCG) of newborn rat pups.

Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

Biologia

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Biologia do Desenvolvimento

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously presented a differentiation protocol for the derivation of autonomic neurons with sympathetic character that has been applied to patients with autonomic neuropathy. However, the protocol was built on Knock Out Serum Replacement (KSR) and feeder-based culture conditions, and to ensure high differentiation efficiency, cell sorting was necessary. These factors cause high variability, high cost, and low reproducibility. Moreover, mature sympathetic properties, including electrical activity, have not been verified. Here, we present an optimized protocol where PSC culture and differentiation are performed in feeder-free and chemically defined culture conditions. Genetic markers identifying trunk neural crest are identified. Further differentiation into postganglionic sympathetic neurons is achieved after 20 days without the need for cell sorting. Electrophysiological recording further shows the functional neuron identity. Firing detected from our differentiated neurons can be enhanced by nicotine and suppressed by the adrenergic receptor antagonist propranolol. Intermediate sympathetic neural progenitors in this protocol can be maintained as neural spheroids for up to 2 weeks, which allows expansion of the cultures. In sum, our updated sympathetic neuron differentiation protocol shows high differentiation efficiency, better reproducibility, more flexibility, and better neural maturation compared to the previous version. This protocol will provide researchers with the cells necessary to study human disorders that affect the autonomic nervous system.

In this protocol, we describe a stable, highly efficient differentiation strategy for the generation of postganglionic sympathetic neurons from human pluripotent stem cells. This model will make neurons available for the use of studies of multiple autonomic disorders.

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which macrophages are induced to produce conditioned medium (CM) that promotes neurite outgrowth. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are acutely dissociated and plated. After the neurons are stably attached, peritoneal macrophages are co-cultured on a cell culture insert overlaid on the same well. Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) is applied to the co-cultures for 24 h, after which the cell culture insert containing the macrophages is moved to another well to collect CM for 72 h. The CM from the co-cultures treated with db-cAMP, when applied to a separate adult DRG neuron culture, exhibits robust neurite outgrowth activity. The CM obtained from the db-cAMP-treated cultures consisting of single cell type alone, either DRG neuron or peritoneal macrophage, did not exhibit neurite outgrowth activity. This indicates that the interaction between neurons and macrophages is indispensable for the activation of macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity into CM. Thus, our co-culture paradigm will also be useful to study intercellular signaling in the neuron-macrophage interaction to stimulate the macrophages to be endowed with a pro-regenerative phenotype.

The current protocol presents experimental procedures to stimulate cultured macrophages to be endowed with capacity to release molecular factors that promote neurite outgrowth. Treatment of cAMP to the neuron-macrophage co-cultures induces the macrophages to produce conditioned medium that possesses strong neurite outgrowth activity.

Neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Using a Macrophage Conditioned Medium to Promote Neuron Extensions

Source: Yun, H. J., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56920">Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay for promoting the growth of neuron projections known as neurite outgrowth using the macrophage-conditioned medium. Co-culture neurons and macrophages with cAMP and harvest the macrophage-derived conditioned medium. Growing the neurons with the conditioned medium promotes neurite outgrowths. These outgrowths are fluorescently labeled and visualized using a fluorescence microscope.

Usando um meio condicionado por macrófagos para promover extensões de neurônios

1. Treatment of Db-Camp and Collection of Macrophage Conditioned Medium
NOTE: Start db-cAMP treatment 4 h after the neuron-macrophage co-cultures.

	Add 2 ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Co-Culture of Schwann Cells with DRG Neurons on a Pre-Stretched Membrane

Source: Liu, C., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54085">An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the co-culturing of dorsal root ganglion (DRG) neurons with Schwann cells. DRG neurons are first grown on a pre-stretched membrane for aligned axon growth. Schwann cells are then introduced, which attach to the axons, insulating them and promoting neural cell survival and function.

Co-cultura de células de Schwann com neurônios DRG em uma membrana pré-esticada

1. Culture of dorsal root ganglion (DRG) on Pre-stretched Surface

	Preparation of Pre-stretched Anisotropic Surface
	
		Mix a 10:1 solution of base and ...

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

Source: Blusch, A. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64768">In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells.</a> J. Vis. Exp. (2023)
This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Schwann cell culture

	...

Stimulation of Dorsal Root Ganglion Sensory Neurons Using a Neuropeptide Receptor Agonist

Source: Lin, Y., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57569">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the use of transfected dorsal root ganglion cells to study neurotransmitter release by stimulating them with a neuropeptide receptor agonist.

Source: Lin, Y., et al., Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates ...