이 작품은 국립 보건원 (보조금 R21 NS45037와 R01 ES014901)에서 기금에 의해 지원되었다.

1. 문화 매체의 준비 (C2 매체) <ol><li> 멸균, 일회용 500 ML Erlenmeyer 플라스크에 나열된 순서대로 다음을 추가 : <table border="1"><tbody><tr><td> 양 </td><td> 구성 요소 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 190 ML </td><td> DMEM (낮은 혈당) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ML </td><td> 지방산 무료 BSA (DMEM에 20mg/ml) </td><td> 50 μg / ML </td></tr><tr><td> 2.8 ML </td><td> L-글루타민 </td><td> 1.4 MM </td></tr><tr><td> 네 ML </td><td> 인슐린 / 트랜스페린 / 셀레늄 (100x) </td><td> 10 μg / ML 인슐린 5.5 μg / ML 트랜스페린 38.7 nm의 셀레늄 </td></tr><tr><td> 0.4 ML </td><td> NGF (125 μg / ml) 쇼핑 </td><td> 100 NG / ML </td></tr><tr><td> 200 ML </td><td> 햄 F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> 부드럽게 t 소용돌이17 X 100 멸균 스냅 캡 튜브의 튜브마다 O 믹스와 나누어지는 10 ML. </li><li> -80에서 보관 ° C </li><li> 중요 사항 : <ul type="disc"><li> 사용법은 즉시 이전 NGF를 녹여. </li><li> NGF 주식 솔루션을 aliquoting 전에 precoat는 단백질과 조직 배양 플라스틱 serological pipet의 내부 벽은 플라스틱으로 NGF의 고집 최소화합니다. 가장 쉬운 접근 방법은 BSA 여러 번 포함된 DMEM 혼합물을 피펫하는 것입니다. DMEM 혼합물로 NGF 튜브를 여러 번 씻어. </li><li> 무료 시스테인은 인슐린에 이황화 채권을 불안정하게 만들지 수 있기 때문에 F-12 마지막에 추가합니다. </li><li> 카포 네 결정이 형성 수 있기 때문에 볼륨이 큰 10 ML을 동결하지 마십시오 </li><li> 2 배 이상의 C2 미디어를 동결 - 해동하지 마십시오. </li></ul></li></ol> 2. 유리 Coverslips의 작성 <ol><li> 우리는 훌륭한 독일어 유리 coverslips가 (추천 소스 및 카탈로그 번호를 표 1 참조)이 프로토콜에서 일관되게 작동 것으로 나타났습니다. </li><li> polytetrafluoroethylene (PTFE 또는 테플론) 뚜껑 라이너 (피셔 카탈로그 # 09-911-765) 300 ML 유리 표본 병 70 % 질산의 75-100 ML을 추가합니다. </li><li> 장갑을 끼고, 드롭 질산 용액에 하나씩 coverslips. 항아리의 바닥 더이상의 2-3보다 coverslips 두꺼운 레이어를 만들기 위해 충분한 coverslips를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 더 이상 185 이상의 RPM에 궤도 흔드는 세트 상온에서 6-8시간 대한 coverslips과 용기를 흔들. </li><li> 퓸 배출 후드에 근무하는 것은 신중하게 산성을 가만히 따르다 및 지역 규정에 따라 폐기. 극도로 순수한 조직 문화 등급 물로 한번 coverslips을 씻어 다음 컨테이너에 75-100 ML 물을 추가합니다. 물이 뿌옇게되는 경우 Coverslips는 여러 번 씻어서 수 있습니다. 부드럽게 이하 185 RPM에 궤도 흔드는 세트에서 하룻밤 실온에서 흔들어. </li><li> 삼일 중 총 질산 / 일상 조직 문화-등급 물 위의 순서를 반복합니다. </li><li> 마지막을 가만히 따르다조직 배양-등급 물 간신히 coverslips을 가릴 정도로 아세톤을 추가합니다. </li><li> 이 아세톤을 가만히 따르다하고 적절하게 처리해라. </li><li> 150mm 유리 페트리 접시에 coverslips를 전송합니다. 간신히 coverslips을 가릴 정도로 아세톤을 추가합니다. coverslips가 접시에 하나의 레이어에 있는지 확인하십시오. </li><li> 아세톤은 퓸 후드에서 하룻밤 증발하도록 허용합니다. </li><li> 멸균을 위해 1.5 시간 180 ° C에서 건조 오븐에 베이킹 coverslips. </li></ol> 3. 문화 Coverslips의 작성 <ol><li> 해부하기 전에 하루, 무균 기술을 사용하여 24도 조직 배양 플레이트의 각도 1 유리 coverslip을 (위에서 설명한대로 준비) 추가합니다. 각도에 멸균 폴리-D-라이신 용액 (0.5 M 트리스 버퍼, 산도 8의 100 밀리그램 / ML) 200 μl를 추가, 4 ° C에서 하룻밤 사이에 접시를 저장합니다. </li><li> 해부의 날, 그리고 이상적으로 절개를 시작하기 전에, 각 우물에서 폴리-D-라이신 솔루션을 대기음하고 각도 5 회 씻어멸균 조직 문화의 등급 물. </li><li> ° C 배양기 37의 각 플레이트 및 매장 200 μl 낮은 포도당 DMEM을 추가합니다. 도금 전지 이전 약 1 시간은 낮은 포도당 DMEM를 제거하고 250 μl C2 미디어를 당 잘 추가하십시오. 37 스토어 번호판 ° C % CO 2 5하에 세포는 도금이 될 준비가 될 때까지. </li></ol> 4. 해부와 뛰어난 자궁암 신경절의 분리 <ol><li> 적은 glial 세포가 있기 때문에 교감 신경의 Dissociated 문화는 일반적으로 태아에서 수확한 우수한 경추 신경의 분열 (SCG) (배아 일 19-21) 쥐의 새끼들이 준비가되어 있습니다. 그러나이 같은 프로토콜은 초기 출생 후의 (1-3일 오래된) 쥐 새끼 또는 perinatal 마우스 새끼와 함께 성공적으로 사용될 수 있습니다. </li><li> CO 2 흡입을 통해 임신 쥐를 안락사. 복부를 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 씻는다. 무균 조건 하에서 자궁 뿔을를 제거하고 살균 150mm 배양 접시에있는 자궁 뿔을를 놓습니다. 피하해부 동안 내장이나 댐의 다른 내부 장기의 손상. </li><li> 배아 새끼를 마취하기 위해 얼음 냄비 진입 새끼와 페트리 접시를 놓습니다. 자궁 나팔과 amniotic 세포막 무료 배아 해부. 새끼를 안락사시키려는 어깨 아래 중간선에 따라 각 강아지의 척수를 자르고. 이것은 또한 SCG의 해부 동안 경동맥에서 출혈을 감소 대정 맥을, severs. 일단 페니실린과 스트렙토 마이신과 보완 멸균 Leibovitz의 L-15 배지 (또는 공기 버퍼 매체)의 장소 배아는 자궁 경적 무료 해부 했어요. </li><li> 150mm 배양 접시 Sylgard로 절반 채워진 그들의 실려 배아를 놓습니다. 멸균 20 게이지 바늘을 사용하여 부드럽게 SCG의 절개를 용이 목, hyperextending, 흉부와 머리 핀. </li><li> 턱밑 땀샘을 표시하는 방법으로 쇄골 수준에서 목을 따라 중간선 절개를합니다. 좋은 포셉을 (를 사용하여 땀샘을 제거 NO. 네, 말. 5 뒤몽)는 근육 레이어를 노출합니다. </li><li> 쇄골 근처 sternocleidomastoid 근육을 잘라 미세 집게를 사용하십시오. 그런 다음 부드럽게 리프트와 호흡 관 옆에 omohyoid 근육을 절개. 이 근육은 매우 얇은이므로 기본 경동맥을 찢어하고 SCG 피하기 위해 너무 깊게 절단하지 마십시오. 이러한 근육의 레이어가 제거되면, 경동맥과 미주 신경 명확하게 표시합니다. </li><li> SCG는 경동맥의 분기점 아래 자리잡고 있습니다. 미세 포셉 (제 4 아냐. 5) 사용 신경절을 노출 경동맥 양쪽에서 떨어져 조직을 해부 무딘. 이 미세 집게를 사용하여 SCG 위에 누워있는 경동맥의 섹션뿐만 아니라 자체 SCG를 제거하려면, 각각 위의 경동맥을 파악하고 아래 SCG의 주동이의와 꼬리 끝을. 그것은 개발이 단계에서 SCG와 함께 놓여 nodose 신경절은, 또한이 단계에서 제거됩니다 가능성이 높습니다. nodose 신경이 identifie 수그 둥근 모양과 그것으로부터 돌출 큰 vagal 신경에 의해 개발. 이것은 경동맥의 지점 중 하나를 택해 자리잡고 있습니다. 반대로, SCG는 모양의 아몬드되고 경동맥의 분기점 아래에 직접적으로 자리잡고 있습니다. L-15 배지와 항생제를 포함하는 무균 35mm 배양 접시에 해부하는 조직을 놓습니다. 다음 단계로 진행하기 전에 모든 새끼에서 SCG를 제거합니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여, 부드럽게 해부 (특히 미주 신경 및 nodose의 신경절) 동안 경동맥과 제거된 다른 조직에서 SCG를 구분합니다. 신경 구에서 캡슐을 제거하는 미세 집게를 사용하십시오. 이것은 크게 문화에 nonneuronal 세포의 숫자를 줄일 수 있습니다. L-15 배지를 포함하는 다른 멸균 35mm 요리에 신경을 전송합니다. </li><li> SCG을 떼어 놓다하려면 L-15 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이없는 행크의 균형 식염수 2 ML의 Collagenase (최종 농도 1 밀리그램 / ML) / Dispase (최종 농도 5 밀리그램 / ML)로 바꿉니다. Incuba40 분 동안 37 ° C에서 테. </li><li> 멸균 15 ML 원추형 원심 관에 SCG를 전송하고 BSA (최종 농도 1-2 밀리그램 / ML)로 보완 L-15을 갖춘 10 ML에 볼륨을 제기하셨습니다. 5 분 상온에서 200 X g에서 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 BSA와 보충 L-15로 한 번 더 씻는다. </li><li> 두 번째 세척 후, 모든 L-15을 제거하고 C2 매체 ~ 2 ML에서 가장 신경을 resuspend. 불타는 광택 구부러진-팁 피펫을 사용하여 세포를 씹다, 가루약은 유리 세포 고집 최소화하기 전에 피펫은 BSA/L15로 코팅되어 있는지 확인하십시오. 부드럽게 3-4 회를 씹다. 대형 대단히 짧은 시간은 약 1 분 동안 정착 및 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송하자. 나머지 SCG에 더 많은 C2 미디어를 넣고 씹다. 대단히 짧은 정착시키는 후에 두 번째 가루약에서 최초로 분쇄 후 채취한에 세포 현탁액을 전송. 신경이 대부분 dissociated 때까지이 과정을 여러 번 반복합니다. 디네번째 분쇄 후 남아있는 대단히 짧은 시간을 iscard. </li><li> 쥐 새끼 (일반적으로 12-16 새끼) 중 하나에 쓰레기에서 dissociated 세포의 경우, 추가 C2 매체를 추가하여 8-10 ML에 세포 현탁액에서 매체의 전체 볼륨을 가지고. 부드럽게 피펫을 사용하여 세포를 resuspend와 세포 밀도를 결정하는 작은 나누어지는를 제거합니다. 서스펜션에 세포 현탁액의 나누어지는 250 ML은 당 잘 세포를 유지해야되고, 그때 문화에 원하는 셀 밀도를 2X를 달성하고있는 세포 현탁액의 볼륨을 조정합니다. 돌기 성장 morphometric 연구를 위해, 24도 접시에 저밀도에서 우리가 일반적으로 플레이트 세포 (사람마다 잘 ~ 5 X 10 4 세포). </li><li> 저희 실험실은 유리 desiccators에서보다는 직접 CO 2 배양기에서 SCG 문화 incubates. 혈청이없는 배지에서 자란 교감 신경이 약간 높은 CO 2 농도 (약 6.5 %)로 더 잘 수행하기 때문에 우리는 이것을 수행합니다. 또한 우리는 O의 항생제를 사용하지 마십시오UR 미디어 그것이 neurite 가지와 desiccators에서 유지하는 문화를 억제 때문에 그것이 문화의 일부로 개발하는 경우에는 오염의 확산 최소화하는 것 같습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 정기적으로 최대 8 주 동안 SCG 문화를 유지합니다. 일단 도금, SCG 문화는 바닥에 멸균 물을 포함한 유리 desiccators의 도자기 건조기 플레이트에 표시됩니다. CO 2의 약 120 ML는 35.5 ° C. 위해 감고 씰링 및 보육 세트로 전체 건조기를 삽입하기 전에 건조기로 주입된다 </li></ol> 5. 수유와 문화의 유지 보수 <ol><li> 문화는 일반적으로 첫 번째 미디어 교환 도금 후 24 시간 발생으로 3 회 주 먹이로하고 있습니다. 멸균 구부린-팁 피펫 사용하여 부드럽게 잘 당 미디어의 절반에 대해 철회. 깨끗한 무균 구부러진-팁 피펫을 사용하여 신선한 C2로 제거 매체의 볼륨을 교체하십시오. </li><li> 문화 이외의 연결을 세포를 제거하려면 백신 mitotic 요원 cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, 최종 농도 1-2 μm의)는 일반적으로 48 시간 동안 첫 번째 미디어 교류의 문화 매체 (예, 24 시간 도금 이후)에 추가됩니다. ARA-C의 농도는 일반적으로 모든 비의 연결 세포를 제거하는 데 충분합니다. 추가 ARA-C 치료가 필요한 경우, 그것은 이들이 신경 세포에 독성 효과를 최소화하기 위해 다른 모든 수유를 할 것을 권장합니다. </li></ol> 6. Matrigel 또는 BMP-7과 돌기 성장을 유도 <ol><li> 돌기 성장을 유도하기 위해 비의 연결 세포가 제거되고 난 후에 Matrigel 또는 BMP-7은 문화에 추가되고 문화의 ARA-C 수준이 크게 감소된다. 일반적으로, 우리는 체외에서 5 일째 매체 Matrigel 또는 BMP-7을 추가하지만, 돌기 성장은 체외의 어떤 시점에 추가 Matrigel 또는 BMP-7에 의해 유도된 수 있습니다. Matrigel 또는 BMP-7은 C2 매체에 추가되고 위에서 설명한 문화가 싫증이됩니다. </li><li> Matrigel 및 BMP 유발 돌기 성장은 시간이다및 농도 의존. 최대한의 효과를 보려면 Matrigel은 50-75 μg / ML의 최종 농도에서 C2에 추가됩니다, BMP-7은 50 NG / ML의 최종 농도에서 C2 매체에 추가됩니다. 큰 약 100 μg / ML 또는 100 이상의 BMP-7 농도의 Matrigel 농도는 NG / ML의 연결 독성을 일으키는 것으로 알려져있다. 돌기 프로세스는 (같은 형태학의 기준에 의해 결정) 약 48 시간 maximally 효과적인 농도에서 Matrigel 또는 BMP-7에 초기 노출 후 겉보기된다. 강력한 돌기의 성장을 유도하기 위해, 문화는 BMP-7은 모든 먹이에 매체를 포함하는으로 먹이 있습니다. 상응하는 결과를 비교 농도 20,21에 BMPs 2, 4, 5와 6을 사용하여 얻은되었습니다. </li></ol> 7. BMP-7-유도 돌기 성장의 Immunocytochemical 분석 <ol><li> 돌기 arborization의 원하는 정도가 달성되면, 문화는 0.1 M 인산 완충액에 4 % paraformaldehyde를 사용하여 해결됩니다. 최고의 고정은4 % paraformaldehyde로 잘 절반 매체를 교체하고 10~15분 동안이 단계에게 3-5 회 반복하여 chieved. </li><li> 십오분 - 인산 버퍼 식염수 (PBS)으로 절반이 4 % paraformaldehyde를 대체 10 이상이 단계를 세 번 반복하여 문화를 씻어. </li><li> 모든 PBS를 제거하고 세포를 permeabilize 위해 상온에서 5 분마다 잘 200 μl 0.1 % Triton은 PBS의 X-100를 추가합니다. </li><li> 흡인에 의해 트리톤 솔루션을 제거하고 200 μl 당 우물 차단 완충 용액을 (PBS가 3~5%의 BSA와 1 % 염소 혈청과 보충) 추가합니다. 상온에서 20-30분 동안 품어. </li><li> 차단 버퍼를 제거하고 1:2000으로 희석 일차 항체, 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2) 추가 - 버퍼를 차단에 1:5000합니다. 4에 실온 또는 특급 ° C.에서 1 시간 동안 문화를 품다 </li><li> 일차 항체 용액을 제거, 실온에 15 분 정도 PBS 세번과 문화를 씻는다. </li><li>PBS에 희석 이차 항체와 문화를 품어은 어둠 속에서 실온에서 1~2시간에 대한 1 % BSA와 함께 보충. </li><li> 이차 항체 용액을 제거하고 어둠 속에서 실온에서 10-15분여 PBS 세번과 문화를 씻는다. </li><li> 유리에 마운트 coverslips는 이차 항체에 태그를 fluorochrome에 적절한 산도에서 수성 장착 매체의 방울에 셀 측면 아래로 내려간다. 장착 매체가 건조하도록 하룻밤 실온에서 슬라이드를 유지. 4에 저장 슬라이드 영상까지 ° C에서. </li><li> 슬라이드 이미징하기 전에 적당한 온도로 평형하도록 허용합니다. epifluorescence 위해 장착된 위상 콘트라스트 현미경을 사용하여 형광 이미지를 습득. 일반적으로 단일 신경 세포의 전체 돌기의 아버는 20X 객관적이고 적절한 필터를 사용하여 캡처 할 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 perinatal RA의 SCG에서 dissociated 교감 신경TS와 혈청 및 ganglionic glial 세포의 부재로 성장이 MAP2 immunopositive 프로세스 (그림 1)을 연장하지 않는 것이 아니라, 일반적으로 단 하나의 axonal 프로세스 14,15을 확장. BMP-7 (그림 1) 또는 Matrigel에 노출 dendrites 17,18의, 형태학의 생화 학적 및 기능적 기준에 부합하는 수많은 프로세스의 형성을 유도합니다. Matrigel 또는 BMP-7 중의 dendrite-촉진 활동은 농도와 시간 의존 17,18,20입니다. 최대한의 돌기의 성장은 50 및 75 μg / ML 또는 BMP-7 30 100 사이 NG / ML 및 반 최대한의 효과는 일반적으로 ~ 2 NG / ML의 BMP-7 농도에서 관찰되는 사이 Matrigel의 농도를 사용하여 관찰한다. 그러나 돌기의 성장에 큰 변화 300 PG / ML과 같은 낮은 BMP-7의 농도로 검출 할 수 있습니다. Matrigel 또는 BMP-7 중으로 돌기 응답은 &lt;뉴런의 50 %가 dendrite-P 중 하나에 노출된 후 24 시간 이내에 두 번째 프로세스를 형성과 함께, 상대적으로 느린<html> 에이전트를 romoting. 그러나, 초기 BMP-7 노출 후 3 일 이내에, 거의 모든 뉴런은 maximally 효과 Matrigel 또는 BMP-7의 농도에 대응. 뉴런 당 dendrites의 수는 치료 최초 10 일 동안 발생하는 변화의 대부분과 함께, BMP-7에 대한 지속적인 노출과 함께 증가하고 있습니다. 4 주밖에, BMP-7-대우 뉴런은 일반적으로 17 이차, 삼차, 심지어 제사기 돌기 가지를 전시 6-8 주 dendrites 있습니다. 모수 석의 아버에있는이 증가는 axonal 성장에 중요한 변화의 부재에서 발생하고, 비교 돌기 응답 BMPs 2, 4, 5 또는 6 20,21 비슷한 농도를 사용 elicited 수 있습니다. 돌기 성장도 내생 ganglionic glial 세포 15,22과 공동 culturing 교감 신경에 의해 elicited 수 있으나, 모수 석의 반응은 이러한 조건 하에서 상당히 느립니다. . JPG &quot;/&gt; 그림 1. BMP-7은 교양 공감 뉴런에서 돌기의 성장을 촉진합니다. 이외의 연결을 세포가 체외에서 제 2 일 48 시간의 시작을위한 안티 mitotic과 치료에 의한 문화 SCG에서 탈락했다. 체외에서 5 일째부터, 문화 50 NG / ML (B)에서 BMP-7으로 보충하거나 조절 매체 () 또는 매체로 치료되었다. 체외 (BMP 처리로부터 5 일 이후)에서 일 11에, 문화는 MAP2 대한 mAb와 immunostained 있었는데, 단백질은 주로 dendrites과의 연결을 somata에서 발견. 마찬가지로 대표적인 형광 photomicrographs 같이 제어 조건 하에서 재배 뉴런은 MAP-2 immunopositive 처리 dendrites의 부족 ()에 의해 입증으로 dendrites 부족, 대조적으로, 뉴런은 (B) 일반적으로 여러 개의 테이퍼 MAP-2 immunopositive가 BMP-7에 노출 dendrites.

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I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).</li><li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 모델의 장점은 다음과 같습니다 () 문화가 다른 세포 유형 17,23의 찾아볼 수없는 교감 신경의 동질적인 인구로 구성되며, (b)는 교감 신경의 성장 인자 요구 사항의 사용을 허용하는, 잘 설립 있습니다 정의 매체 및 정의된 다양한 미디어와 기판이 23 증가하고 교감 신경을 유지하기 위해 잘 작동, (다) 이러한 문화의 뉴런은 Matrigel, BMP-7 dpp의 다른 BMPs의 dendrite-증진 활동에 균일하게 응답하고 60A는 17,18,20,21을 subfamilies하며, (d)에 Matrigel 또는 BMP 유발 dendrite 형성은 세포 생존 또는 axonal 성장 17,18의 변화의 부재에서 발생합니다. 이 모델은 바로 기본 dendr 동안 dendrites의 형성 이전, 돌기 성장, 예,의 독특한 단계에서 뉴런의 동조 인구를 얻는 것이 가능하게 돌기의 성장을 촉발하는 경우의 실험적인 제어를 수itogenesis (주 dendrites의 초기 형성)과 돌기 성숙의 나중 단계 동안. 모델의 가장 중요한 한계는 RNA 및 생화 학적 연구를 제한할 수 있습니다 하나의 쓰레기, 그리고 유전자 발현을 조작하는데 약간의 문제의 전형적인 해부에서 제공하는 단백질의 제한된 금액을 포함합니다. 기본의 연결을 세포 배양의 cDNA 표현하는 기술의 최근 발전은 급속이 후자의 단점을 극복하고 있습니다. 지질 기반의 전송 시스템, nucleofection 및 교양 공감 뉴런으로 adenoviral 벡터의 성공적인 응용 프로그램을보고 출판물이있다. 보고된 transfection 효율은 형태학의 분석은 개별 세포 분석에 기반 끝점에 적합한지, (일반적으로 10~20%에서 바이러스성 감염 lipofection 또는 nucleofection 및 최대 30~50%로까지) 상대적으로 낮은 있지만, 수 많은 생화 학적 끝점에 대한 문제. 요인 THA하진 교양 공감 뉴런의 BMP 유발 돌기의 성장을 방해할 수있는 것은 culturing 매우 높은 세포 밀도에서 뉴런과 문화 미디어 혈청을 포함하여이 포함됩니다. 높은 세포 밀도가 BMPs는 알려지지 않았습니다의 dendrite-촉진 활동을 attenuates 것이 이유지만, 그것은 BMPs는 avidly 혈청 단백질에 바인딩하기 때문에 혈청이 활동을 attenuates 가능성이 높습니다. 흥미롭게도, 자체 혈청 교양 공감 뉴런 24에 약한 dendrite-증진 활동을 가지고 있으며, 우리의 예비 데이터는이 활동은 대부분의 경우 모든 상업용 세라 존재 BMPs에 의해 매개되는 것이 좋습니다. BMPs는 Matrigel에도 존재이며, 가능성의 dendrite-증진 활동을 중재. BMPs의 dendrite-촉진 활동에 영향을 미칠 수있는 세 번째 요인은 BMPs의 부적 절한 취급 및 저장이다. 미만 0.1 밀리그램 / ML의 농도에서 BMP 주식 솔루션을 보관하지 마십시오. 그것은 BMP 주식 또는 근무 솔루션은 매우 기본이 될 못하게하는 것이 중요하며 우리는 그 buf 추천주식 솔루션을 희석하기 위해 사용 fers 4.5의 산도 ± 0.05 있습니다. aliquoting 전에 적극적으로 모든 솔루션을 섞어서 아니지만 아주 노골적인 해당 솔루션 폼 및 BMPs 다른 플라스틱에 집착하는 경향이 있기 때문에 전용 폴리 프로필렌 튜브를 사용합니다. 온도 사이클링 BMP-7의 활동을 파괴하기에 충분하기 때문에 자동 서리를 없애다 기능이 냉동고에서 aliquots를 보관하지 마십시오. 이는 강력하게 BMP 솔루션은 -80에서 보관하는 것이 좋습니다 ° C와 그 냉동 해동 (우리는 이상의 3 배를 동결 - 해동하지 않음)을 최소화한다. 비슷한 조치는 Matrigel 처리에 사용해야합니다. 또한, 그것은 Matrigel 천천히 4에서 해동하는 것이 좋습니다 ° C. 이전 도금 뉴런에 precoat 기판으로 사용할 경우 Matrigel이 돌기의 성장을 유발하지 않습니다, 그것은 기존의 연결을 세포 문화 18 문화 매체에 추가하는 경우에만 유효합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12mm의 라운드 Coverslip # 1 두께, 독일어 유리 </td></tr><tr><td> 벤트 팁 pipets </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P0899-100MG </td><td> 주식 해결 방법 1 MG / ML </td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> Gibco </td><td> 15,230 </td><td></td></tr><tr><td> 더 좋은 포셉 뒤몽 없습니다. 4와 5 </td><td> 파인 과학 도구 (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 게이지 바늘 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 305,176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz의 L-15 배지 </td><td> Invitrogen </tD&gt; <td> 11,415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 워딩턴 </td><td> 4176 </td><td> 1 MG / ML </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 로슈 </td><td> 04942078001 </td><td> 5 MG / ML </td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 용액 (-CA,-MG) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 낮은 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,030 </td><td> 20 MM </td></tr><tr><td> 인슐린 / 트랜스페린 / 셀레늄 </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 지방산 - 초산 무료 BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126,609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> 할란의 Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> 햄 F-12 영양소 매체 (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,765 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> 사이 토신 arabinoside </td><td> 시그마 </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356,234 </td><td> 반복 냉동 해동 사이클을 피하십시오 </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D 시스템 Curis 주식 회사 </td><td> 345-BP BMP7-07H </td><td> BMPs 4, 5와 6은 동일뿐만 아니라 B​​MP-7과 같은 일을하고 상업적으로 얻기 위해 때로는 쉽게 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 어부 </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 쥐 MAP2 항체 </td><td> Sternberg Monoclonals 주식 회사 </td><td> SMI52 </td><td> 5천분의 1 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 546 염소 - 안티 마우스 </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1만분의 1 </td></tr><tr><td> 마운트 미디어 </td><td> Antifade 키트 분자 프로브을 연장 </td> &lt;TD&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

모수 석의 아버의 형태는 신경 세포가 1-3받을 수 총 시냅스 입력을 결정하고, 종류와 이들 입력 4-6의 분포에 영향을 미칩니다. 돌기 성장과 소성의 변경된 패턴은 실험적인 모델 7의 장애 neurobehavioral 기능과 관련되며, neurodevelopmental 장애의 8-10과 neurodegenerative 질병 11-13 모두에서 관찰 임상 증상에 기여할 것으로 생각됩니다. 이러한 관찰은 정확하게 돌기 형태와 규제의 기능적 중요성을 강조하고, 돌기 성장을 제어하는​​ 메커니즘을 파악하는 것은 오직 정상적인 발달 기간 동안 규제하는 방법의 연결을 연결의 이해를 향상하지 않을뿐만 아니라, 다양한 신경 질환에 대한 새로운 치료 전략에 대한 통찰력을 제공할 수도 것이 좋습니다. 돌기 성장 기계론의 연구는 크게 가용성 O에 의해 용이하게됩니다뉴런은 실험적으로 그들이 그들의 생체내의 대응에의 비교 돌기 아버을 자세히 설명하는 하나 dendrites을 연장되지 않는 상태에서 전환 수 있습니다 FA 모델 시스템입니다. perinatal 설치류의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 dissociated 교감 신경의 차 문화는 이러한 모델을 제공합니다. 혈청 및 ganglionic glial 세포의 부재에서 정의된 중간에 배양해 때 교감 신경은 axonal은 단일 프로세스를 확장,이 unipolar 국가는 문화 14,15의 개월 주 동안 지속. 그러나 문화 매체 중 뼈 morphogenetic 단백질 7 (BMP-7) 16,17 혹은 Matrigel 18 또한이 dendrites 위해 morphologic, 생화 학적 및 기능적 기준에 부합하는 여러 프로세스를 확장하려면 다음 뉴런을 트리거합니다. 공감 perinatal 설치류의 SCG에서 dissociated 뉴런과 정의된 조건 하에서 재배는 뉴런 19 동질적인 인구이다Matrigel, BMP-7 decapentaplegic (dpp)과 60A subfamilies 17,18,20,21의 다른 BMPs의 dendrite-증진 활동에 균일하게 반응니다. 중요한 것은, Matrigel 및 BMP 유발 dendrite 형성은 세포 생존 또는 axonal 성장 17,18의 변화의 부재에서 발생합니다. 여기, 우리는 그들이 Matrigel 또는 BMPs의 선택적 dendrite-촉진 활동으로 반응하도록 perinatal 쥐의 SCG에서 파생된 동정 뉴런의 dissociated 문화를 설정하는 방법에 대해 설명합니다.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

우리는 선택적으로 perinatal 쥐의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 dissociated 주요 동정 뉴런의 돌기 성장을 유도하는 뼈 morphogenetic 단백질 7 (BMP-7) 또는 Matrigel을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 선택적으로 perinatal 쥐의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 dissociated 주요 동정 뉴런의 돌기 성장을 유도하는 뼈 morphogenetic 단백질 7 (BMP-7) 또는 Matrigel을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.