우리는 아낌없이 수정된 난자를 제공 타이슨 식품 주식 회사를 인식 싶어요. 샨나 아놀드는이 프로토콜을 찍는 동안 계기되었다. Trenis 팔머는 루스 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (F31 국립 암 연구소)에서 국립 보건원에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 CCSRI 부여 # 700537 JDL 및 NIH / NCI 부여 # CA120711 - 01A1 및 AZ로 CA120711 - 01A1에 의해 지원되었다.

1. xenografting 위해 달걀 (자발적인 전이)를 준비 <ol><li> 갓 수정된 닭고기 달걀은 10 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다. </li><li> 발달 10 일째에 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다. </li><li> chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 이 정맥은 그것이 몇 가지 큰 혈관의 교차점입​​니다 달걀 껍질의 상단에 위치하고 있습니다. 이 지점 시점에서 혈관은 CAM 멀리 아래로 방울 및 배아에 연결됩니다. 1cm 사각형 상자가 정맥의 분기점에서 약 1cm 떨어진 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다. </li><li> 실리콘 카바이드 숫돌 (Dremel 부분 # 84922) 구멍이 공기 색으로 계란의 뭉툭한 끝 통해 뚫고있다가 장착되어 회전 절삭 도구 (Dremel)를 사용합니다. 이 같은 도구를 사용하여 구멍은 달걀 껍질 막의 짧은 중지, 계란 위에 이전에 그려진 사각형 안에 뚫고있다. 끝에 훌륭한 버와 25 게이지 주사 바늘은 기본 CAM 찢어하지 않도록주의되는 달걀 껍질 막의 작은 구멍을 만드는 데 사용됩니다. CAM은 이후 airsac에있는 구멍에 대한 위치 ¼ &quot;tygon 튜빙의 일부로 장착되어 자동 피펫 에이드로 만든 부드러운 흡입을 사용하여 사각형의 영역에 달걀 껍질 막의 분리이다. 흡입을 적용시, 공기 주머니는 광장에 구멍 아래 CAM이 성공적으로 달걀 껍질에서 멀리 떨어되었음을 나타내는 것입니다. CAM을 떨어뜨린 후, 공기 색과 chorioallantoic 정맥 근처 광장에있는 구멍에 구멍이 테이프 실험실 테이프 조각으로 봉인합니다. 달걀은 이후에 종양 세포를 접목의 기대에 100 ° F 60 %의 습도에서 고정 인큐베이터에 게재됩니다. 연속 묘사를 위해 그림 1을 참조하십시오. </li></ol> 2. 정맥 주사에​​ 대한 계란을 준비하는 것은 (실험 전이) <ol><li> 갓 수정된 닭고기 달걀은 12 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다. </li><li> 발달 일 12 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다. </li><li> chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 0.5 cm의 사각형으로 1cm 직접 정맥 위에 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다. </li><li> 작은 창이 Dremmel 드릴 비트를 (# 118)를 사용하여 그려진 위치에 달걀 껍질에 만들어집니다. 창이 이후 미네랄 오일 드롭과 투명 렌더링되는 기본 달걀 껍질 막을 폭로 제거됩니다. 그래픽 묘사에 대한 그림 5A를 참조하십시오. </li><li> 이 시점에서 공기 색과 chorioallantoic 정맥 근처 광장에있는 구멍에 구멍이 테이프 실험실 테이프 조각으로 봉인합니다. 달걀은 이후에 종양 세포를 주사의 기대에 100 ° F 60 %의 습도에서 고정 인큐베이터에 게재됩니다. </li></ol> 3. 접목이나 사출에 대한 종양 세포를 준비. <ol><li> 잔여 미디어, 트립신, 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 제거하기 위해 xenografting 들어, 종양 세포는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 그들의 문화 요리로부터 분리되며 인산염의 10 볼륨 세탁 (PBS) 살린 버퍼. </li><li> IV 주입 들어, 교양 세포는 nonenzymatic 셀 분리 솔루션을 사용하여 분리되며, 혈청이없는 DMEM로 세탁. 이상) </li><li> 세포는 hemacytometer로 집계와 접목을 위해 10-40000000 세포 / ML에서 PBS에 resuspended하거나, 또는 IV 주입을위한 1,000,000 세포 / ML에서 혈청없는 DMEM에 resuspended 있습니다. </li></ol> 4. 새로 노출된 CAM (자연 전이)에 종양 세포를 접목 <ol><li> 달걀은 인큐베이터에서 제거하고 작은 창이 새 공기 주머니가 형성되었습니다 이전에 그려진 사각형의 위치에서 절단합니다. 이것은 가장 쉽게 절단 휠 (# 409 원형 절단 휠과 Dremel 도구)이 장착된 회전 도구를 사용하여 이루어집니다. 바늘 코 포셉의 두 사람은 달걀 껍질의 작은 부분을 제거하고 기본 CAM을 폭로하는 데 사용됩니다. </li><li> 목화 - 스쳐 작은 주걱을 (피셔 브랜드 # 23-400-001)를 사용하여 CAM은 5 번 abraded입니다. 약간의 피가 목화에 분명해야합니다. 즉시 CAM을 손상 후 세포 현탁액의 25μl가 손상된 영역에 배치됩니다. 세포의 최적의 숫자가 결정됩니다 Empirically하지만 0.5X10 5 1X10 6 범위하실 수 있습니다. 난자에 창문이 테이프로 단단히 밀봉하고 새끼는 세포가 정착 수 있도록 10~15분에 대해 서 남아 있습니다. 십오분 후 달걀이 정지 인큐베이터에 반환됩니다. </li><li> 종양은 특정 응용 프로그램과 사용하는 종양 세포주의 특성에 따라 5-8일에 대한 성장을 사용할 수 있습니다. 연속 묘사를 위해 그림 1을 참조하십시오. </li></ol> 5. 종양 세포의 정맥 주사 (실험적 전이) <ol><li> 세포 현탁액의 30 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100μl 것은 각각의 배아의 allantoic 정맥에 주입, 계란은 고정 인큐베이터에 반환하고 추가 1~7일 거기에 남아 있었다. </li><li> 서로 다른 시간 지점에서, 폐 이하 CAM은 각 배아에서 수확되며 아래에 설명된대로, 종양 세포의 검출을위한 처리. </li></ol> 6. 수확 종양과 여자의 조직 <ol><li> 해부 영역이 준비됩니다. 분석은 매우 민감한 PCR 방식을 사용하여 인간 DNA를 quantifying하여 전이성 세포를 감지합니다. 그것은 외인성 DNA와 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 해부는 전용 지역에서 수행하고 해부를 통해 도구는 각 동물 사이에 청소합니다. 내장을 제거하는 기본 종양과 한 세트를 제거 한 세트를 계란을 절단 한 설정 해부 과정에서 도구의 3 별도의 세트를 사용하여 샘​​플의 교차 오염을 방지하기 위해. 또한, 넷 씻어 용기는 각 동물 간의 도구 rinsing 연속 사용됩니다. 시퀀스에서 이러한 세척은 다음과 같습니다 1) 더블 증류수, 2) 더블 증류수, 3) 염소 표백제, 4) 70 % 에탄올. </li><li> 달걀은 정지 인큐베이터에서 제거하고 동물을 마취 및 안락사에 15 분 동안 얼음에 게재됩니다. 창문은 종양이 표시되고 그러한 열립니다. 달걀 껍질의 일부​​를 제거하여 더 큰 창문을 열면 필요할 수 있습니다. 기본 종양은 CAM에서 resected 무게, 그리고 조직학에 대한 처리됩니다. </li><li> 여자는 동등 반쪽으로 반경 껍데기를 절단하여 달걀 껍질에서 제거됩니다. 배아는 컷 껍질에서 decanted 최대 깨끗한 무게는 보트를 가슴쪽으로 전송됩니다. 동물은 도구의 신선하고 깨끗한 집합을 이용한 해부합니다. 동물은 흉골을 통해 절단에 의해 열립니다. 일단 배아 역시 오른쪽 또는 왼쪽으로 기억 상실증이 수집에서 간장의 일부 열려 있습니다. 내장은 이후 모래 주머니에 연결된 식도에 부드럽게 당기와 기관을 연결 visera를 절단하여 제거됩니다. 폐에 상처 수집하기 위해 흉곽은 가슴 판은 구분 개설되고 마음이 제거됩니다. 이 시점에서 그것은 폐암의 사면 주위에 절단이 가능합니다 (머리에 가까운 가기 흉곽, 호흡 관을 따라 횡경막과 오른쪽 하단을 따라 왼쪽). 일관성을 위해 같은 폐는 각 동물에 수집됩니다. 수확 조직 샘플은 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다 또는 DNA의 격리를 위해 즉시 처리할 수 있습니다. </li></ol> 7. 게놈 DNA의 분리 및 정량 PCR 분석 <ol><li> 게놈 DNA는 Sybr 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트 (시그마 - 알드리치 카탈로그 # XNATRG)를 사용하여 조직에서 추출됩니다. 추출 DNA는 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송하고 -20 ° C에 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 이후 PCR 반응에 사용하기 전에 nuclease 무료로 물 속에 DNA 1시 50분을 희석하는 것이 중요합니다. 또는 DNA는 표준 DNA 추출 프로토콜 (Zijlstra 외., 2002)의 번호를 사용하여 추출하실 수 있습니다. </li><li> 인간의 DNA는 인간의 Alu 시퀀스에 대한 정량 PCR의 특정을 사용하여 여자의 조직에서 발견됩니다. 정량 PCR은 Exract - N - 앰프 키트에서 SYBR 녹색 증폭을 사용하여 수행됩니다 Alu 특정 primers를 사용하여. PCR 키트 SYBR 녹색, 버퍼, 솔츠 dNTPS, DNA 형성 촉매 효소 및 Jumpstart는 DNA 형성 촉매 항체를 포함하는 2X 반응 믹스와 함께 제공됩니다. 반응 혼합물은 각 프라이머의 0.4μM와 15μl의 최종 볼륨으로 구성되어 있습니다. 압축을 푼 DNA를 사용하는 대부분의 경우는 1시 50분는 양적 데이터를 제공합니다 희석을 위해, 그러나, 템플릿 DNA의 최적의 금액은 경험적으로 최적화해야 할 수 있습니다. 치킨 GAPDH의 primers는 PCR은 Alu 시퀀스에 대해 다음 조건에서 실행되는 내부 통제으로 사용됩니다 : 95시 효소 활성 ° 95 30 사이클 뒤에 2 분 C ° 30 S., 63를위한 C ° C 30 S. 72 ° 30 C S. 닭고기 GAPDH에 대한 반응 조건은 그러나 40 사이클로 PCR을 확장해야 할 수 있습니다 Alu에 대한 설명들에게 동일합니다. </li><li> 전이의 정량 분석은 제어 그룹 (Schmittgen 및 Livak, 2008 실험 그룹을 비교 ΔΔCt 방법을 사용 수행됩니다;. Zijlstra 외를, 2002). 또는 표준 곡선은 압축을 풉니다 - N - 앰프 키트 (Zijlstra 외., 2002)를 사용하여 압축을 푼 인간의 종양 세포의 희석 계열을 사용하여 생성할 수 있습니다. 통계 중요성은 학생 T - 테스트 또는 제어 및 실험 그룹의 Anova 분석을 사용하여 평가됩니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 닭 배아 전이 모델. 주요 단계에서 단면에있는 모델의 모습을 보여주는 A) 4 패널 다이어그램 : 1. 부화 10 일 후. CAM은 거의 최대 크기에 도달했습니다. 동맥과 정맥은 계란의 상단에 대한 위치 Allantoic 정맥과 별개로 볼 수 있습니다. 2. 바로 달걀 껍질에 구멍을 드릴링 후 달걀 : airsac에 하나 allantoic 정맥에 대한 부착 지점에 인접한 하나. 3. 가벼운 진공 후 외관 airsac을 벗어나 CAM을 드롭하는 데 사용되었습니다. 종양 세포 (파란색)은 떨어졌다 CAM에 적용됩니다. 4. 이식할 종양 세포의 성장 수 있도록 후, 닭 배아의 조직과 함께 종양을 분석 수확 아르 B) 모델의 시리얼 묘사 :. 1. 계란을 잠복기. 2. allantoic 정맥의 위치., 3 마킹. 달걀 껍질에 구멍을 시추. 4. CAM을 떨어진다. 5. 접목 종양 세포., 6 오프닝 커팅. 종양 세포를 적용., 7. 얼음에 계란을 냉각하는 것은 사전에 조직을 수집합니다. 8. 성장 7 일 후 종양을 수확. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 캠 종양의 조직학. 종양 베어링 chorioallantoic 막에서 가져온 조직은 포르말린, sectioned에 고정하고 trichrome 얼룩로 처리되었습니다. CAM의 성장 7 일 이후 A) HEp3 종양. B와 C가 보여주는 종양과 두 기질에서 확대 영역을 보여줍니다. D) normals CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 전이의 정량 분석 세로. 높거나 낮은 전이성 능력 (HEp3 M (하이) 각각 HEp3 M (낮은))으로 머리와 목 암의 HEp3에 대한 변형은 Alu PCR을 사용하여 전파하는 능력에 대해 분석했다. 텐 동물 칠일의 기간 동안 각 시점에서 분석했다. 이 샘플은 # 조직을 cells/50mg 같은 표준 곡선에 대한 계량 및 이후 표현했다. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 동물 자연 전이 세포의 억제는 종양의 전이 억제 항체 1A5로 치료. 종양은 일 - 10 태아의 CAM에 적용 5X10 5 HEp3 세포를 사용하여 형성되었습니다. 절반 동물 방지 CD151 항체 1A5 대우 있던 종양 세포를 적용한 후에 3 일. 종양 - 베어링 동물의 폐는 이틀 후에 수확 및 정량 실시간 PCR alu를 받게되었습니다. chGAPDH의 반대로 양적 실시간 PCR은 호스트의 게놈 DNA의 상당 수량 (ΔΔCt 메소드 (양적 두 그룹을 비교하는 B를 사용했다)의 존재를 확인하는 데 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. 전이성 폭포에서 체포, 성장, 그리고 intravasation을 평가. 체포, 성장 속도, 그리고 intravasation의 비율 : 기본적으로 보조 기관에 전이는 세 가지 측면의 기여에 의해 정의됩니다. 이들은 실험 전이 (A)와 자발적인 전이 (B)의 조합을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 체포은 세포의 숫자로 정의 실험 전이 (A)를 사용하면 2 시간 게시 주사를 발견했습니다. 체포 세포의 생존과 성장은 휴대폰 번호 이용하려면 포스트 주사의 변화로 결정됩니다. 성장은 3-7 일 동안 확산의 속도로 정의됩니다. Intravasation는 자발적인 전이 (B) 번호 intravasated 전지는 값이 일 6 일 현재 전이성 부담의 성장 예측 초과 일 7 전이성 부담 선물로 정의됩니다 사용 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. CAM에서 전이성의 머릿속으로 확장. GFP를 표현 HEp3 세포 발달 하루 12 정맥 주입했다. 일 1, 3, 5에 달걀이 희생되었고 CAM의 섹션은 형광등 스테레오 현미경으로 몇 군데했다. 진한 녹색 배경이 달걀 껍질에 의해 만들어진, vasculature는 검은색 선으로 표시로 볼 수 있으며, 종양 세포는 밝은 녹색 관광 명소로 볼 수 있습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

병아리 CAM은 암 생물학과 전이성 진행의 다양한 측면을 연구하기위한 모델 시스템으로 수십 년 동안 사용되었습니다. 전이성 능력 원리 평가는 휴면의 분석을 포함하는 그룹의 다양한하여이 모델에서 수행되었습니다 (. 아귀레 Ghiso 외, 1999; Ossowski과 제국, 1983), 조직 개조 (Deryugina 외, 2005;. 안 - Dantona . 외, 1999), 그리고 전이 (Zijlstra 외, 2008;. Zijlstra 외, 2002).. 그것은 사용하기 때문입니다 자사의 용이성, xenografts를 수락하기 위해 능력의 암 생물학을위한 매우 매력적인 모델을 계속하며, 저렴한 비용 (챔버 외, 1982;. 챔버 외, 1990).. 인간의 구체적인 Alu 기반의 정량 PCR (.. 김 외, 1998; Zijlstra 외, 2002)를 사용하여 우리는 인간 cpidermoid 암종 세포 라인 HEp3의 전이성 보급 (그림 3)을 분석할 수있는 능력을 보여줍니다. 또한 우리는 전이 억제 항체 1A5 (.; Zijlstra 외, 2008). 그림 4 (테스타 외, 1999)를 사용 억제 치료의 평가에서이 기술의 유틸리티를 보여줍니다. 전이성 능력과 치료 반응을 평가 수있는 이외에,이 모델은 또한 양적 전이성 폭포 (Zijlstra 외., 2002)의 개별 구성 요소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 종양 세포의 정맥 주사에​​ 의해 실험적인 전이를 사용하여,이 모델은 암 세포 보조 기관에 체포와​​ 그 이후의 성장 (그림 5A)의 분석을 위해 수 있습니다. 성장이 속도는 종방향 자연 전이 분석의 전이성 부담 (그림 5B)를 예측하는 데 사용할 수 있습니다. Intravasation는 자발적인 전이 (B) 번호 intravasated 세포가 일 7 전이성 부담 선물 마이너스 값이 일 6 전이성 부담 선물의 성장 예측과 같이 정의됩니다 사용 결정됩니다. . 루이스 동부 표준시, 기술의 확장 여기보고, 우리는 최근 종양 microenvironment (레옹 외, 2010을 대상으로 찬란 분류 nanoparticles를 사용하여 생체내에서 종양 세포의 행동 (. Zijlstra 외, 2008), 시각화하는 새로운 전략을 개발 알., 2006). 이러한 발전 방법을 통해이 모델의 유틸리티는 생존, 설치 및 종양 세포의 성장을 지원하는 복잡하고 역동적인 변화를 시각화하기 위해 악용될 수 있습니다. 여자 CAM의 상대적으로 저렴한 비용으로, immunodeficient 자연, 사용의 용이성과 적응성과 함께 이러한 기술은, 이미징 및 암 전이의 정량 분석​​이 모델은 가치가합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산 버퍼 살린 (D - PBS) (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> 산도 7.4 </td></tr><tr><td> 트립신, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4Na와 0.05 % (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> 스포츠먼 해처 </td><td> 베리 힐 </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> 이러한 incubators는 가장 쉽게 사용할 수 몇 가지 있습니다. 그러나 비디오는 다른 장비를 보여줍니다. </td></tr><tr><td> 스포츠먼 인큐베이터 </td><td> 베리 힐 </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel 회전 공구 </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 더 Dremel 커토프 바퀴 없습니다. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> 휴대용 피펫 에이드 </td><td> 어부 </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> 커튼 Applicators를 스쳐 </td><td> 어부 </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> 수정된 계란 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 여러 공급 업체가 사용할 수 있습니다. 계란은 약 35-55그램해야합니다. 그들이 나이 36 사이 55주해야 낳는 암탉. </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser 과학, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 현미경 조명기 </td><td> Amscope </td><td> HL250 - AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 게이지 바늘 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sybr 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

전이 암 세포가 일차 종양에서 보급하는 동안, 주위 조직으로 침범하고, 멀리 떨어진 장기로 확산. 전이는 많은 조직 유형, 기간 변수 기간을 포함하고 자주 어려운 조사 수치 만들기, 장기 이내 깊은 발생할 수 복잡한 과정이다. 또한, 전이성 프로세스의 효능이 어려운 종양 세포 행동의 단일 측면의 기여를 평가하는 전이성 폭포의 여러 단계에 의해 영향을받습니다. 그 결과, 전이의 assays 자주 전이를 공부하는 반드시 현실 컨텍스트를 제공하기 위해 실험 동물에서 수행됩니다. 불행히도,이 모델은 더 이상 자신의 복잡한 생리학에 의해 복잡하게됩니다. 여자의 난자는 chorioallantoic 멤브레인 (CAM), 종양 세포의 xenografting에 수용되는 달걀 껍질 아래에있는 잘 vascularized 엑스트라 배아 조직의 접근으로 인해, 전이를 공부하는 많은 한계를 극복 생체내 모델에서 독특한 (그림 1). 또한, 여자는 배아가 자연스럽게 immunodeficient이기 때문에, CAM은 쉽게 정상과 종양 조직 모두의 engraftment을 지원합니다. 가장 중요한 조류 CAM 성공적으로 성장, 침공, angiogenesis, 그리고 microenvironment의 개조를 포함하여 대부분의 암 세포 특성을 지원합니다. 이것은 암 전이로 이어질 가능성과 새로운 치료제로 전이성 암의 반응​​을 예측하는 경로의 조사를 위해 모델이 매우 유용합니다. 종 특정 Alu PCR에 의해 전파 세포의 검출은 양적 25 세포처럼 몇 가지에 의해 식민지 아르 장기 전이를 평가하는 것이 가능합니다. 인간 표피 암종 세포 라인 (HEp3)를 사용하여 우리는 여자의 간, 폐를 포함하여 먼 장기에 암 세포의 자발적인 전이를 분석이 모델을 사용합니다. 또한, Alu - PCR 프로토콜을 사용 우리는 전이의 개별 요소 intravasation, 체포, 넘쳐 흐름, 그리고 식민을 분석하고 quantitate하는 도구로 감도와 분석의 재현성을 보여줍니다.

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Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

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An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

연구

의학

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

양적 시각화 및 동적 써멀 이미징을 사용하여 피부암의 감지

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

자기 공명 영상, 체적 계산의 Tomography 및 초음파를 이용한 유방암의 뼈 전이의 누드 쥐 모델에서 Angiogenesis의 멀티 모달 이미징

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

뼈 전이의 모델

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...