Culturas de enriquecimento: cultivo de micróbios aeróbicos e anaeróbicos em meios seletivos e diferenciais

Fonte: Christopher P. Corbo¹, Jonathan F. Blaize¹, Elizabeth Suter^1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Células procarióticas são capazes de habitar quase todos os ambientes deste planeta. Como um reino, eles possuem uma grande diversidade metabólica, permitindo-lhes usar uma grande variedade de moléculas para geração de energia (1). Portanto, ao cultivar esses organismos em laboratório, todas as moléculas necessárias e específicas necessárias para fazer energia devem ser fornecidas na mídia de crescimento. Enquanto alguns organismos são metabolicamente diversos, outros são capazes de sobreviver em ambientes extremos, como altas ou baixas temperaturas, pH alcalino e ácido, ambientes reduzidos ou ausentes de oxigênio, ou ambientes que contenham sal alto (2,3,4). Denominados de "extremófilos", esses organismos muitas vezes requerem que esses ambientes intensos se proliferem. Quando os cientistas procuram cultivar tais organismos, os componentes da mídia, bem como quaisquer condições ambientais específicas, todos precisam ser levados em conta para cultivar com sucesso os organismos de interesse.

Os cientistas são capazes de cultivar organismos culturais em laboratório porque entendem os requisitos específicos que essas espécies precisam para crescer. No entanto, os organismos culturaláveis representam menos de 1% das espécies estimadas no planeta (5). Organismos que detectamos por sequenciamento genético, mas que não são capazes de crescer em laboratório são considerados não culturais (6). Neste momento, não sabemos o suficiente sobre o metabolismo e as condições de crescimento desses organismos para replicar seu ambiente em laboratório.

Organismos exigentes estão em algum lugar entre os dois primeiros. Esses organismos são culturaáveis, mas requerem condições de crescimento muito específicas, como componentes específicos da mídia de crescimento e/ou condições específicas de crescimento. Dois exemplos desse gênero são Neisseria sp. e Haemophilus sp., ambos requerem glóbulos vermelhos parcialmente quebrados (também conhecidos como ágar de chocolate), bem como fatores específicos de crescimento e um ambiente rico em dióxido de carbono (7). Sem todos os componentes específicos necessários, esses organismos não crescerão. Muitas vezes, mesmo com todas as suas exigências, esses organismos crescem mal.

Ao contrário das células eucarióticas, que só são capazes de crescer em um ambiente aeróbico, ou contendo oxigênio, as células procarióticas são capazes de crescer anaerobicamente usando várias vias de fermentação para gerar energia ampla (8). Outros procariotes preferem um ambiente microaerofílico, ou oxigênio reduzido, ou mesmo um ambiente capnofílico ou de dióxido de carbono alto (9). Esses organismos são mais desafiadores para enriquecer, já que a atmosfera deve ser alterada. Cientistas que frequentemente trabalham com organismos sensíveis a um ambiente oxigenado normalmente trabalhariam em uma câmara anaeróbica e incubadora, onde um gás pesado e inerte como o argônio é bombeado para deslocar o oxigênio (10). Outros fazem uso de sistemas de pacotes de gás selados convencionalmente disponíveis que usam água para gerar hidrogênio e dióxido de carbono, juntamente com um catalisador como o paládio para remover todo o oxigênio atmosférico. Estes kits disponíveis comercialmente podem criar qualquer uma das condições atmosféricas acima mencionadas (10).

Seja cultivando um patógeno para determinar uma infecção potencial ou procurando identificar uma espécie específica de bactérias presentes em um ambiente natural, existe um problema. Nenhuma espécie bacteriana habita um habitat. As bactérias vivem como comunidades multicelulares em todos os lugares, desde a pele dos humanos até os oceanos do nosso planeta (11). Ao tentar isolar uma espécie de bactéria, os cientistas devem trabalhar para excluir os inúmeros outros organismos que também estão habitando a área isolada. Por essa razão, a mídia de crescimento enriquecida para bactérias muitas vezes realiza duas funções. A primeira é tornar a mídia seletiva. Um agente seletivo impedirá que algumas espécies cresçam, sem inibir e muitas vezes até mesmo promover outras para crescer (12). A segunda função dos ingredientes da mídia pode ser trabalhar como agentes diferenciais. Tais agentes permitem a identificação de uma característica bioquímica particular de um organismo isolado. Ao associar várias mídias seletivas e diferenciais diferentes, juntamente com condições adequadas de crescimento, cientistas e diagnósticos são capazes de identificar a presença de espécies bacterianas específicas de um determinado isolado.

Um exemplo de mídia seletiva e diferencial auxiliando na identificação é no caso do organismo clinicamente significativo Staphylococcus aureus. Este organismo é tipicamente cultivado em ágar de sal manitol. Esta mídia não só seleciona para organismos que podem viver em um ambiente de sal alto, que incluem alguns gram positivos como o Staphylococcus,mas também inibe quaisquer organismos sensíveis ao sal. O açúcar mannitol é o componente diferencial deste meio. De todas as espécies de Staphylococcus clinicamente significativas, apenas S. aureus é capaz de fermentar manitol. Esta reação de fermentação produz ácido como um subproduto que faz com que o indicador vermelho metil vermelho na mídia se transforme em amarelo. Outras espécies de Staphylococcus (como Staphylococcus epidermidis), embora capazes de crescer, deixarão a mídia vermelha na cor.

Este exercício de laboratório demonstra técnica asséptica adequada, bem como a inoculação adequada da mídia de crescimento a partir do caldo. Também introduz o crescimento de organismos contaminantes comuns em meios de enriquecimento, o uso de um sistema de cultura anaeróbica de pacotes gasosos para bactérias anaeróbicas e o uso de diferentes mídias seletivas e diferenciais para a identificação presuntiva de bactérias gram positivas e gram-negativas.

1. Preparação

1. Antes de começar, lave bem as mãos e coloque luvas de tamanho adequado.
2. Esterilizar a superfície de trabalho com hipoclorito de sódio de 5% (alvejante) e secar completamente.
3. Coloque um laço inoculante em um frasco vazio de 120 mL Erlenmeyer para que ele não toque na parte superior do banco durante o trabalho.

2. Growth Media and Cultures

1. Reúna quatro pratos de Mannitol Salt Agar (MSA), ágar azul de metilaeno Eosin (EMB) e oito ágar de soja tripptic (TSA) da geladeira (estes podem ser comprados comercialmente).
2. Coloque placas na área de trabalho limpa.
3. Junte as seguintes culturas de caldo: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidise Proteus vulgaris. Tenha cuidado: como se trata de organismos aeróbicos, as tampas dos tubos devem estar ligeiramente soltas.
4. Coloque todas as culturas em um rack de tubo de ensaio na superfície de trabalho limpa.

3. Transferir culturas e incubação

1. Fique ou sente-se no banco com todos os materiais ao alcance.
2. Para usar a técnica asséptica para transferir as bactérias para a placa, primeiro flameja o laço até que esteja brilhando laranja - e, em seguida, deixe esfriar no ar.
3. Enquanto o laço esfria, pegue a cultura do caldo de E. coli,e depois abra a tampa usando seu dedo mindinho.
4. Inflamar a abertura do tubo rapidamente. Isso evita a contaminação.
5. Mergulhe o laço no tubo e coloque o organismo no primeiro quadrante de uma placa EMB.
6. Após a primeira raia ser realizada, flame o loop, e depois executar uma segunda raia cruzando a primeira raia apenas uma ou duas vezes. Isso permitirá o isolamento de uma única colônia e determinará se há alguma contaminação.
7. Repita isso até que todos os quatro quadrantes da placa tenham sido listrados.
8. Agora, transfira cada um dos outros quatro organismos da mesma maneira de chapeamento de raia para que o produto final seja uma placa MSA, uma placa EMB, e duas placas TSA separadas por organismo.
9. Uma vez que todos os organismos foram transferidos, inflamar o laço uma última vez e colocá-lo fora.
10. Coloque 1 placa TSA com cada organismo no pacote de gás e, em seguida, agite um sachê de gás antes de colocá-lo na câmara ao lado das placas. Selar firmemente.
11. Incubar todas as placas a 37°C durante a noite.
12. Esterilize a superfície de trabalho uma última vez com 5% de alvejante.

4. Resultados de leitura e gravação

1. Remova as placas da incubadora e coloque-as em um banco de laboratório limpo
2. Tome nota do crescimento a partir dos organismos em cada placa em seu caderno de laboratório. Em particular, tome notas detalhadas sobre:
   1. Números e tamanho das colônias (se presentes) em cada placa, para cada cepa banhada
   2. Aparência do ágar em torno de quaisquer colônias crescendo nas placas msa
   3. Aparência de quaisquer colônias crescendo nas placas emb
   4. Diferenças no crescimento entre as placas TSA cultivadas fora versus dentro do pacote de gás

Mannitol Salt Agar (MSA): Este meio é seletivo para organismos gram positivos que são capazes de sobreviver em 6,5% de cloreto de sódio. Os organismos gram-negativos Escherichia coli e Proteus vulgaris não devem ser capazes de crescer neste meio por causa da alta concentração de sal. S. epidermidis e S. aureus devem ser capazes de crescer. A mídia é diferencial entre os dois porque o S. aureus é capaz de fermentar o mannitol - transformando o indicador vermelho metil amarelo brilhante devido à produção de ácido como subproduto de fermentação. S. epidermidis deve manter a cor rosa na placa.
NOTA: Se as colônias forem pequenas, o crescimento neste meio pode exigir incubação adicional por um total de até 48 horas a temperatura ideal - aqui, 37°C.

Eosin Metileno Ágar azul (EMB): Este meio é seletivo para organismos gram negativos, por isso as placas Escherichia coli e Proteus vulgaris devem apresentar crescimento. Os corantes azuis de eosina e metileno são tóxicos para gram células positivas, então nenhuma espécie de Streptococcus deve crescer. A membrana externa das células gram-negativas impede que os corantes entrem nas células. Esta mídia é diferencial porque permite que se teste para a capacidade do organismo de fermentar lactose. E. coli transforma uma cor roxa brilhante (muitas vezes com um brilho metálico verde se cultivado por tempo suficiente) devido à fermentação da lactose na mídia. O P. vulgaris, embora capaz de crescer, não fermenta lactose (porém é capaz de fermentar outros açúcares).

Agar de soja tripptic (TSA): Este meio não é seletivo, por isso todas as espécies de estudo devem crescer. No entanto, comparando as condições aeróbicas versus anaeróbicas, as placas da embalagem de gás devem apresentar menos crescimento (e colônias menores). Isso ocorre porque nenhuma das bactérias cultivadas na demonstração são aerobes obrigatórios, mas sua condição de crescimento ideal inclui oxigênio.

Diferentes espécies bacterianas são capazes de crescer em diferentes ambientes e são capazes de usar diferentes fontes de carbono como forma de gerar energia. Ao trabalhar com essas culturas no laboratório, é importante conhecer os componentes da mídia de crescimento que está sendo trabalhada e combinar a mídia de crescimento com as espécies bacterianas. Cientistas e diagnósticos também podem explorar as diferentes reações bioquímicas como uma maneira de isolar diferentes espécies das outras e como uma maneira de distinguir e identificar bactérias em um ambiente misto.

1. Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
2. Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
3. Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
4. Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
5. Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
6. Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
7. Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
8. Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
9. Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO₂ for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
10. Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
11. de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
12. Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)