PET/CT com [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 para imagens de lesões tendíneas em modelos de lesão do tendão de Aquiles de ratos

Aqui, apresentamos um protocolo para utilizar imagens PET/CT [⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 para exibir alta sensibilidade na detecção e localização precisa de lesões tendíneas.

As lesões do tendão, particularmente aquelas que afetam o tendão de Aquiles, são condições comuns relacionadas ao esporte que afetam significativamente a qualidade de vida dos pacientes. Embora os métodos diagnósticos existentes, como ressonância magnética e ultrassom, sejam amplamente utilizados, eles podem ocasionalmente não fornecer informações patológicas precisas. Este estudo teve como objetivo investigar a viabilidade do uso de tomografia por emissão de pósitrons/tomografia computadorizada (PET/CT) [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 para avaliar um modelo experimental de lesão do tendão de Aquiles em ratos. A aplicação da imagem PET/CT [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 demonstrou alta sensibilidade na detecção e localização precisa de lesões tendíneas, oferecendo insights patológicos mais abrangentes em comparação com as técnicas convencionais de imagem. A proteína de ativação de fibroblastos (FAP), um marcador de fibroblastos ativados, desempenha um papel crucial no processo de reparo do tendão. A captação do traçador começou no lado lesionado/rompido desde a primeira semana após a modelagem e atingiu o pico durante a segunda semana. Esses resultados mostram que a expressão da PAF, ativada pela lesão e ruptura do tendão de Aquiles, atingiu seu nível mais alto durante a segunda semana do processo de reparo. Aproveitando a especificidade do traçador [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286, esta nova abordagem de imagem visualiza com precisão a extensão e a progressão das lesões tendinosas no modelo animal.

Os fibroblastos são distribuídos de forma onipresente em quase todos os tecidos e normalmente residem em um estado quiescente. Após a interrupção da integridade do tecido, os fibroblastos são ativados e migram para o local da lesão, orquestrando o processo de reparo¹. Uma vez concluído o reparo, os fibroblastos geralmente voltam ao seu estado quiescente; no entanto, em condições de inflamação crônica ou fibrose, eles podem permanecer persistentemente ativados. A PAF é uma proteína transmembrana expressa nas superfícies de fibroblastos ativados. Estudos recentes demonstraram um método não invasivo altamente promissor para rastrear a PAF para identificar várias entidades tumorais importantes, incluindo câncer de mama, pulmão e colorretal². Essa abordagem pode ser explorada ainda mais por seu potencial no diagnóstico de lesões tendíneas.

As lesões tendinosas constituem um problema musculoesquelético significativo, compreendendo aproximadamente 30% de todas as consultas relacionadas ao músculo-esquelético na prática médica geral³. Essas lesões são prevalentes em várias faixas etárias e demografias, com uma incidência notavelmente maior entre indivíduos com 30 anos ou mais, grupos ocupacionais envolvidos em movimentos repetitivos e atletas. Exemplos notáveis incluem lesões do manguito rotador, rupturas do tendão de Aquiles, tendinopatia patelar e cotovelo de tenista, cada um exibindo taxas de incidência distintas e populações afetadas 4,5,6,7. Modalidades diagnósticas, como ultrassom B e ressonância magnética, são comumente empregadas para avaliar lesões tendíneas. No entanto, dado o processo característico de cicatrização dos tendões envolvendo acúmulo de fibroblastos ao redor da superfície da ferida, um estudo foi conduzido para investigar o uso de Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04 para modelos de lesão tendínea de imagem⁸. Os achados apóiam a hipótese de que a imagem PET-CT com FAPI pode servir como um método eficaz para monitorar o progresso da cicatrização do tendão e avaliar a gravidade da lesão.

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 exbita a vantagem de direcionar especificamente a PAF no microambiente tumoral com um tempo de retenção prolongado. Atualmente é usado para imagens de tumores. Até onde sabemos, PET/CT com [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 não tem sido usado para imagens de lesões tendíneas. Portanto, conduzimos este estudo para explorar a aplicação de PET/CT com [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 em lesões tendíneas de imagem.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os padrões éticos para experimentação animal pelo Primeiro Hospital Afiliado da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang. (Número de referência: 20241008). ⁶⁸Ga é um elemento radioativo que emite pósitrons por decaimento, que rapidamente se combinam com os elétrons circundantes para liberar raios gama. Os raios gama podem penetrar na pele, representando um risco de danos causados pela radiação ao corpo. Todo o pessoal experimental deve passar por treinamento de segurança e proteção contra radiação antes de realizar experimentos relacionados. Durante os experimentos, é necessário usar dosímetros de radiação, instrumentos de blindagem e outros equipamentos de proteção. Os resíduos radioativos produzidos no experimento precisam ser descartados adequadamente após o experimento.

1. Processo de preparação e modelagem de modelos animais

1. Preparação
   1. Obtenha ratos Sprague-Dawley (SD) machos (6-8 semanas de idade, ~ 250 g, n = 8). Aclimate-os em condições laboratoriais padrão com acesso ad libitum a alimentos e água por 7 dias. Use-os para estabelecer os modelos de lesão e ruptura do tendão de Aquiles.
   2. Dividimos aleatoriamente os ratos em dois grupos: grupo um: modelo de lesão do tendão de Aquiles (n = 4); grupo dois: modelo de lesão do tendão de Aquiles (n = 4).
2. Processo de modelagem
   1. Preparar os instrumentais: bisturi, pinça hemostática, pinça padrão, isoflurano, oxigênio, compressas com álcool, iodóforo, placa de fixação, suturas cirúrgicas e agulhas.
   2. Anestesiar o rato numa câmara de indução com uma mistura de isoflurano e oxigénio (1:1). Prenda o rato inconsciente em uma placa de fixação e mantenha a anestesia usando uma máscara de gás que fornece um suprimento contínuo de isoflurano-oxigênio.
   3. Esterilize os instrumentos cirúrgicos com álcool e desinfete o local da cirurgia.
   4. Estabeleça o modelo de lesão do tendão de Aquiles.
      1. Aplique o creme depilatório uniformemente no membro posterior direito, aguarde 5 min e remova os pelos com uma navalha.
      2. Use um bisturi para fazer uma incisão longitudinal para expor o tendão de Aquiles.
      3. Comprima o tendão usando uma pinça hemostática até que esteja achatado.
      4. Feche a incisão com suturas.
   5. Estabelecer o modelo de ruptura do tendão de Aquiles.
      1. Siga as etapas 1.2.4.1 e 1.2.4.2 para expor o tendão de Achilies.
      2. Segure o tendão de Aquiles usando uma pinça hemostática e faça uma incisão na linha média de espessura total usando uma tesoura cirúrgica (Figura 1).
      3. Suturar o tendão cortado e fechar a incisão na pele.
   6. Monitore os ratos em busca de sinais de angústia e garanta a cicatrização adequada da ferida. Realize imagens PET 1 semana após a cirurgia.

2. Síntese de ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286

NOTA: ⁶⁸Ga (meia-vida: 68 min) são obtidos de um gerador de ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga.

1. Prepare 50 μg do precursor, dissolva-o em 800 μL de acetonitrila anidra e adicione 3 mL de solução tampão de acetato de sódio 0,1 M para ajustar o pH para ~ 4. Eluir o gerador de ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga (5 mL/3 min; certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa).
2. Retire 5 mL de ácido clorídrico 0,1 M usando uma seringa com cabeça de sílica gel e injete o clorídrico no gerador de ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga para substituir o ⁶⁸Ga. Eluir ⁶⁸Ga (∼17 mci) em um frasco de vidro de 10 mL
   NOTA: Evite o contato do ácido clorídrico com o metal.
3. Misture o precursor dissolvido (NOTA-FAP-2286, número de registro CAS: 2583823-71-4) e eluído ⁶⁸Ga e coloque-os em um aquecedor a 35 ° C por 20 min (a reação de rotulagem é mostrada na Figura 2).
4. Para purificar o produto, pré-ative a coluna C18 com 10 mL de etanol e 10 mL de água. Colocar o produto na coluna C18 e enxaguar com 1 mL de etanol a 50% para obter o produto final.
5. Evaporar o etanol. Aqueça o frasco de produto final a 80 °C por ~20 min para remover o excesso de etanol da solução por evaporação.
6. Realize uma verificação de controle de qualidade usando HPLC: Fase móvel: A (0,1% H₃PO₄ Solução aquosa), 72% -52%, 0-20 min; B (CH₃CN), 28%-48%, 0-20 min; Vazão: 3 mL/min.

3. Imagem PET de pequenos animais

1. Prenda o rato em uma contenção. Administrar 500 μci de ⁶⁸GA-NOTA-FAP2286 através da veia da cauda nos ratos de ambos os grupos.
2. Induzir a anestesia com isoflurano em uma câmara de indução.
3. Posicione o rato totalmente anestesiado no campo de varredura com o tendão de Aquiles no centro do campo de varredura (Figura 3).
4. Realize a varredura PET de pequenos animais e obtenha resultados de imagem.
   1. Ligue o computador conectado ao sistema PET de pequenos animais. Clique em Aquisição de TC para iniciar o processo de pré-aquecimento do sistema de TC.
   2. Quando o pré-aquecimento estiver concluído, selecione o protocolo de digitalização e abra o fluxo de trabalho de digitalização correspondente (a duração da digitalização é predefinida para 10 min).
   3. Clique em Scout View para confirmar o posicionamento do tendão de Aquiles no centro do campo de varredura. Se a posição estiver correta, clique em Iniciar fluxo de trabalho para realizar as varreduras PET e CT.
      1. Use os seguintes parâmetros: NCT bed view: 0-36,2-76,4 mm, tempo de tomografia computadorizada: 60 s/um leito. PET: Adquirir por tempo: 600 s; Nível de energia de fotopico de 511 KeV; 350 Kev Discriminação de Nível Inferior; discriminação de nível superior de 650 KeV; Janela de temporização de 3.432 ns.
   4. Após a conclusão da varredura, clique em Reconstrução para reconstruir os arquivos de varredura e obter os resultados da imagem. Use o local de trabalho de pesquisa para pós-processamento das imagens.

Sintetizamos com sucesso [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 com um rendimento de mais de 70% (decaimento corrigido), alcançando uma pureza radioquímica superior a 95%. O perfil de HPLC é mostrado na Figura 4. Modelos de lesões tendinosas foram estabelecidos cirurgicamente e [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 foi administrado por via intravenosa, seguido por imagens PET bem-sucedidas em pequenos animais. Os resultados são apresentados na Figura 5, Figura 6 e Figura 7. Conforme ilustrado na imagem PET (Figura 5), a captação do traçador começou no lado lesionado/rompido 30 minutos após a injeção e continuou a aumentar nos 90 minutos seguintes, mostrando uma diferença significativa em comparação com o tendão de Aquiles normal e o tecido muscular. Em contraste, a Figura 6 demonstra que distinguir entre o tendão de Aquiles lesionado/roto e o tendão de Aquiles normal nas imagens de TC é um desafio. A imagem de projeção de intensidade máxima (MIP) na Figura 7 mostra que a captação do traçador começou no lado lesionado/quebrado desde a primeira semana após a modelagem e atingiu o pico durante a segunda semana, indicando que a expressão da PAF, ativada pela lesão e ruptura do tendão de Aquiles, atinge seu nível mais alto durante a segunda semana do processo de reparo. Os valores específicos de SUV são fornecidos na Tabela 1 e na Tabela 2. A Tabela 1 indica que aos 30, 60 e 90 minutos após a injeção, os valores máximos e médios de SUV no lado da fratura/lesão foram significativamente maiores do que os do tendão de Aquiles normal e do tecido muscular, com significância estatística observada em todos os três momentos. A Tabela 2 confirma ainda que, durante as 3 semanas iniciais, os valores de SUV no lado da fratura/lesão diferiram daqueles do lado normal e do tecido muscular, com a diferença mais pronunciada ocorrendo na segunda semana. Os dados da Tabela 1 e da Tabela 2 corroboram os achados de imagem descritos na Figura 5 e na Figura 7.

Figura 1: Modelos do tendão de Aquiles de ratos. (A) Modelo de lesão do tendão de Aquiles; (B) Modelo de ruptura do tendão de Aquiles. (C) Estrutura normal do tendão de Aquiles em ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A reação de rotulagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O método de fixação especial para manter o tendão de Aquiles do rato no centro do campo de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Os espectros radioativos de HPLC e ultravioleta de [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados da imagem PET. Imagem do modelo de ruptura do tendão de Aquiles em (A) 30 min após a injeção, (B) 60 min após a injeção, (C) 90 min após a injeção. Imagem do modelo de lesão do tendão de Aquiles em (D) 30 min após a injeção, (E) 60 min após a injeção, (F) 90 min após a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Resultados da TC. Imagem de tomografia computadorizada de ruptura do tendão de Aquiles após (A) 7 dias, (B) 14 dias, (C) 21 dias. Imagem de tomografia computadorizada do tendão de Aquiles lesionado após (D) 7 dias, (E) 14 dias, (F) 21 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Resultados da PImáx da imagem PET-CT. PImáx de PET-CT de ruptura do tendão de Aquiles após (A) 7 dias, (B) 14 dias, (C) 21 dias. MIP de PET-CT de tendão de Aquiles lesionado após (D) 7 dias, (E) 14 dias, (F) 21 dias. Abreviatura: MIP = projeção de intensidade máxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Os valores de SUV de diferentes órgãos 30, 60 e 90 min após a injeção. Abreviatura: SUV = valor de absorção padronizado.

Tabela 2: O valor SUV de diferentes órgãos 1 semana, 2 semanas e 3 semanas após a modelagem. Abreviatura: SUV = valor de absorção padronizado.

As imagens mostram diferenças notáveis entre os lados direito e esquerdo. Os exames de PET em pequenos animais ilustram claramente as diferenças entre os tendões de Aquiles normais e lesionados/rompidos. Essas diferenças podem ser atribuídas ao acúmulo de FAPs no lado lesionado/rompido, levando ao aumento da captação do agente de imagem. Experimentos de imagem, juntamente com medições de SUV_max e SUV_mean , demonstram claramente o contraste entre o tendão de Aquiles lesionado / rompido e o tendão de Aquiles normal. As alterações na expressão de FAP durante o processo de reparo podem ser monitoradas de forma eficaz usando imagens PET.

O sucesso deste protocolo depende de várias etapas críticas. Primeiro, a preparação e o controle de qualidade do radiotraçador [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 são primordiais. Isso envolve o emprego de técnicas radioquímicas precisas para garantir alta pureza radioquímica e atividade específica. Em segundo lugar, induzir com precisão lesões do tendão de Aquiles em modelos de ratos é crucial para manter a consistência entre os indivíduos. As técnicas cirúrgicas padronizadas e os cuidados pós-operatórios devem estar de acordo com os protocolos estabelecidos. Em terceiro lugar, determinar o momento ideal para imagens de PET/CT pós-lesão é essencial para capturar efetivamente os estágios mais informativos do processo de cicatrização. Uma série de pontos de tempo pode ser necessária para rastrear com precisão a progressão da expressão de FAP. Em quarto lugar, protocolos meticulosos de aquisição e reconstrução de imagens são necessários para maximizar a relação sinal-ruído e a resolução espacial, o que pode ser particularmente desafiador em estudos de imagem de pequenos animais⁹. Finalmente, a análise quantitativa rigorosa dos dados de PET/CT desempenha um papel crítico na extração de informações significativas sobre o processo de cicatrização do tendão; isso inclui medições como SUV e potencialmente incorporando análise de textura. Além disso, o radiotraçador exibe captação rápida e retenção prolongada em tumores.

Várias modificações e estratégias de solução de problemas podem ser consideradas para otimizar o protocolo. Ajustes na dose do radiotraçador ou nos pontos de tempo de imagem podem ser necessários para obter uma relação sinal-ruído ideal, equilibrando captação suficiente com sinal de fundo mínimo. O refinamento do modelo de lesão tendínea é essencial para garantir a consistência entre os sujeitos, potencialmente por meio da padronização da força aplicada em lesões por esmagamento ou da extensão da laceração. A implementação de técnicas de correção de movimento pode ser crucial em imagens de pequenos animais para minimizar artefatos causados por movimentos respiratórios ou outros movimentos involuntários. A exploração de algoritmos alternativos de reconstrução de imagens, incluindo métodos de reconstrução iterativos, é promissora para melhorar a resolução espacial e a precisão quantitativa. Além disso, a incorporação de imagens dinâmicas de PET pode fornecer informações mais profundas sobre a cinética da captação de [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 em tendões lesionados, oferecendo assim informações mais abrangentes sobre o processo de cicatrização. NOTA-FAP-2286 também demonstrou um potencial substancial no diagnóstico e tratamento de várias doenças, particularmente condições ortopédicas¹⁰. Em tumores ósseos malignos e benignos, como osteossarcoma e tumores ósseos metastáticos, o NOTA-FAP-2286 oferece alta especificidade para PAF, permitindo imagens precisas de PET/CT e aplicações terapêuticas¹¹. Além disso, em condições inflamatórias e fibróticas, como fibrose articular, distúrbios de cicatrização de fraturas e artrite, NOTA-FAP-2286 fornece informações valiosas sobre processos patológicos e atividade da doença¹².

Embora inovador, esse método apresenta várias limitações. A resolução espacial da imagem PET, geralmente variando de 1 mm a 2 mm para scanners de pequenos animais, pode restringir a capacidade de detectar mudanças sutis na cicatrização do tendão, particularmente durante os estágios iniciais ou para pequenas lesões¹⁰. Existe um risco potencial de captação inespecífica de radiotraçadores nos tecidos circundantes, o que pode complicar a interpretação dos resultados, especialmente em regiões anatômicas complexas. Além disso, a necessidade de equipamentos especializados e experiência em radioquímica e imagens de pequenos animais pode restringir sua ampla adoção. A tradução dos resultados de modelos de ratos para aplicações humanas apresenta desafios devido a variações no tamanho do tendão, processos de cicatrização e escala de lesões. Além disso, embora a exposição à radiação associada à imagem PET seja mínima, ela pode limitar a frequência de estudos longitudinais no mesmo animal.

A importância da imagem PET/CT direcionada à FAP reside em seu potencial para fornecer visualização específica e sensível em nível molecular dos processos de cicatrização do tendão⁹. Em comparação com as técnicas convencionais de imagem, como ressonância magnética ou ultrassom, essa técnica oferece insights exclusivos sobre a ativação de fibroblastos, um processo crucial na cicatrização do tendão. Permite a avaliação quantitativa da progressão da cicatrização ao longo do tempo, potencialmente permitindo a detecção precoce de anormalidades ou complicações no processo de cicatrização. Ao contrário de outros traçadores PET como [¹⁸F]-FDG, que reflete principalmente o metabolismo da glicose, [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 visa especificamente a FAP, fornecendo assim informações mais precisas sobre a resposta fibroblástica durante o reparo do tendão. Essa especificidade aumenta a capacidade de discernir entre processos normais de cicatrização e patológicos, levando a uma caracterização mais precisa da lesão.

A importância deste método na pesquisa de lesões tendíneas é multifacetada. Ele fornece uma abordagem não invasiva para monitorar os processos de cicatrização dos tendões em estudos pré-clínicos, facilitando a avaliação longitudinal sem a necessidade de biópsias repetidas ou sacrifício de animais em vários momentos. Isso não apenas reduz significativamente o número de animais necessários para a pesquisa, mas também produz dados mais consistentes. Além disso, esse método é promissor para avaliar novas intervenções terapêuticas para lesões tendíneas, oferecendo uma medida quantitativa da eficácia do tratamento. Além disso, pode ser fundamental na investigação dos mecanismos moleculares subjacentes ao reparo e regeneração do tendão, potencialmente identificando novos alvos terapêuticos. Particularmente empolgante é sua potencial tradução para aplicações clínicas, pois pode melhorar o diagnóstico e o tratamento de lesões tendinosas em humanos. Nos campos da pesquisa ortopédica, medicina esportiva e medicina regenerativa, essa técnica de imagem tem o potencial de se tornar uma ferramenta poderosa para compreender e otimizar estratégias relacionadas à cicatrização do tendão, levando a melhores resultados para os pacientes.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O estudo foi financiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde de Zhejiang (concessão nº 2023KY694), Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang (número da concessão: LTG23H180014).