PET/CT con [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 para la obtención de imágenes de lesiones tendinosas en modelos de lesiones del tendón de Aquiles en ratas

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar imágenes PET/CT [⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 para exhibir una alta sensibilidad en la detección y localización precisa de lesiones tendinosas.

Las lesiones de tendones, en particular las que afectan al tendón de Aquiles, son afecciones comunes relacionadas con el deporte que afectan significativamente la calidad de vida de los pacientes. Aunque los métodos de diagnóstico existentes, como la resonancia magnética y la ecografía, son ampliamente utilizados, en ocasiones pueden no proporcionar información patológica precisa. Este estudio tuvo como objetivo investigar la viabilidad del uso de imágenes de tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT) [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 para evaluar un modelo experimental de lesión del tendón de Aquiles en ratas. La aplicación de la PET/CT [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 demostró una alta sensibilidad en la detección y localización precisa de lesiones tendinosas, ofreciendo una visión patológica más completa en comparación con las técnicas de imagen convencionales. La proteína de activación de fibroblastos (FAP), un marcador de fibroblastos activados, desempeña un papel crucial en el proceso de reparación del tendón. La captación del trazador comenzó en el lado lesionado/roto desde la primera semana después del modelado y alcanzó su punto máximo durante la segunda semana. Estos resultados muestran que la expresión de FAP, activada por la lesión y rotura del tendón de Aquiles, alcanzó su nivel más alto durante la segunda semana del proceso de reparación. Al aprovechar la especificidad del trazador [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286, este novedoso enfoque de imagen visualiza con precisión el alcance y la progresión de las lesiones tendinosas en el modelo animal.

Los fibroblastos se distribuyen de forma ubicua en casi todos los tejidos y, por lo general, residen en un estado de reposo. Tras la interrupción de la integridad del tejido, los fibroblastos se activan y migran al sitio de la lesión, orquestando el proceso de reparación¹. Una vez que se completa la reparación, los fibroblastos generalmente vuelven a su estado de reposo; Sin embargo, en condiciones de inflamación crónica o fibrosis, pueden permanecer activados de manera persistente. La FAP es una proteína transmembrana que se expresa en las superficies de los fibroblastos activados. Estudios recientes han demostrado la existencia de un método no invasivo muy prometedor para el seguimiento de la PAF con el fin de identificar varias entidades tumorales importantes, como el cáncer de mama, pulmón y colorrectal². Este enfoque podría explorarse más a fondo por su potencial en el diagnóstico de lesiones tendinosas.

Las lesiones tendinosas constituyen un problema musculoesquelético significativo, comprendiendo aproximadamente el 30% de todas las consultas relacionadas con el musculoesqueleto en la práctica médica general³. Estas lesiones son prevalentes en varios grupos de edad y grupos demográficos, con una incidencia notablemente mayor entre las personas de 30 años o más, los grupos ocupacionales que realizan movimientos repetitivos y los atletas. Ejemplos notables incluyen lesiones del manguito rotador, rupturas del tendón de Aquiles, tendinopatía rotuliana y codo de tenista, cada una de las cuales exhibe distintas tasas de incidencia y poblaciones afectadas 4,5,6,7. Las modalidades diagnósticas, como la ecografía B y la resonancia magnética, se emplean comúnmente para evaluar las lesiones de los tendones. Sin embargo, dado el proceso de cicatrización característico de los tendones que implica la acumulación de fibroblastos alrededor de la superficie de la herida, se realizó un estudio para investigar el uso de Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04 para la obtención de imágenes de modelos de lesiones tendinosas⁸. Los hallazgos apoyan la hipótesis de que las imágenes PET-CT con FAPI pueden servir como un método eficaz para monitorear el progreso de la curación del tendón y evaluar la gravedad de la lesión.

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 ofrece la ventaja de dirigirse específicamente a la FAP en el microambiente tumoral con un tiempo de retención prolongado. Actualmente se utiliza para la obtención de imágenes tumorales. Hasta donde sabemos, la PET/CT con [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 no se ha utilizado para obtener imágenes de lesiones tendinosas. Por lo tanto, realizamos este estudio para explorar la aplicación de PET/CT con [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 en la imagen de lesiones tendinosas.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los estándares éticos para la experimentación con animales por el Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. (Nº de referencia: 20241008). ^{Artículo 68}El Ga es un elemento radiactivo que emite positrones por desintegración, que se combinan rápidamente con los electrones circundantes para liberar rayos gamma. Los rayos gamma pueden penetrar en la piel, lo que supone un riesgo de daño por radiación en el cuerpo. Todo el personal experimental debe recibir formación sobre seguridad y protección radiológica antes de realizar experimentos relacionados. Durante los experimentos, es necesario usar dosímetros de radiación, instrumentos de protección y otros equipos de protección. Los residuos radiactivos producidos en el experimento deben eliminarse adecuadamente después del experimento.

1. Proceso de preparación y modelado de modelos animales

1. Preparación
   1. Obtenga ratas macho Sprague-Dawley (SD) (6-8 semanas de edad, ~ 250 g, n = 8). Aclimatarlos en condiciones estándar de laboratorio con acceso ad libitum a alimentos y agua durante 7 días. Utilícelos para establecer los modelos de lesión y rotura del tendón de Aquiles.
   2. Divida aleatoriamente las ratas en dos grupos: grupo uno: modelo de lesión del tendón de Aquiles (n = 4); grupo dos: modelo de lesión del tendón de Aquiles (n = 4).
2. Proceso de modelado
   1. Prepare los instrumentos: bisturí, pinzas hemostáticas, pinzas estándar, isoflurano, oxígeno, hisopos con alcohol, yodóforo, placa de fijación, suturas quirúrgicas y agujas.
   2. Anestesiar a la rata en una cámara de inducción con una mezcla de isoflurano y oxígeno (1:1). Asegure a la rata inconsciente en una tabla de fijación y mantenga la anestesia usando una máscara de gas que administre un suministro continuo de isoflurano-oxígeno.
   3. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos con alcohol y desinfectar el sitio quirúrgico.
   4. Establecer el modelo de lesión del tendón de Aquiles.
      1. Aplique la crema depilatoria de manera uniforme en la extremidad posterior derecha, espere 5 minutos y elimine el vello con una navaja.
      2. Use un bisturí para hacer una incisión longitudinal para exponer el tendón de Aquiles.
      3. Comprima el tendón con pinzas hemostáticas hasta que quede aplanado.
      4. Cierre la incisión con suturas.
   5. Establecer el modelo de rotura del tendón de Aquiles.
      1. Siga los pasos 1.2.4.1 y 1.2.4.2 para exponer el tendón de Achilios.
      2. Agarre el tendón de Aquiles con pinzas hemostáticas y cree una incisión de espesor completo en la línea media con tijeras quirúrgicas (Figura 1).
      3. Suturar el tendón amputado y cerrar la incisión en la piel.
   6. Vigile a las ratas en busca de signos de angustia y asegúrese de que las heridas cicatricen adecuadamente. Realizar la tomografía por emisión de positrones 1 semana después de la cirugía.

2. Síntesis de ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286

NOTA: ⁶⁸Ga (vida media: 68 min) se obtiene de un generador de ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga.

1. Prepare 50 μg del precursor, disuélvalo en 800 μL de acetonitrilo anhidro y agregue 3 mL de solución tampón de acetato de sodio 0,1 M para ajustar el pH a ~4. Eluir el generador de ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga (5 mL/3 min; asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa).
2. Extraiga 5 mL de ácido clorhídrico 0.1 M usando una jeringa con cabeza de gel de sílice e inyecte el clorhídrico en el generador de ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga para reemplazar el ⁶⁸Ga. Elute ⁶⁸Ga (∼17 mci) en un vial de vidrio de 10 mL
   NOTA: Evite el contacto del ácido clorhídrico con el metal.
3. Mezcle el precursor disuelto (NOTA-FAP-2286, número de registro CAS: 2583823-71-4) y eluyó ⁶⁸Ga y colóquelos en un calentador a 35 °C durante 20 min (la reacción de etiquetado se muestra en la Figura 2).
4. Para purificar el producto, preactive la columna C18 con 10 mL de etanol y 10 mL de agua. Colocar el producto en la columna C18 y enjuagar con 1 mL de etanol al 50% para obtener el producto final.
5. Evapora el etanol. Calentar la botella de producto final a 80 °C durante ~20 min para eliminar el exceso de etanol de la solución por evaporación.
6. Realizar un control de calidad mediante HPLC: Fase móvil: A (0,1% H₃PO₄ Solución acuosa), 72%-52%, 0-20 min; B (CH₃CN), 28%-48%, 0-20 min; Caudal: 3 mL/min.

3. Imágenes PET de animales pequeños

1. Asegura a la rata en un sujetador. Administrar 500 μci de ⁶⁸GA-NOTA-FAP2286 a través de la vena de la cola en las ratas de ambos grupos.
2. Inducir la anestesia con isoflurano en una cámara de inducción.
3. Coloque la rata completamente anestesiada en el campo de exploración con el tendón de Aquiles en el centro del campo de exploración (Figura 3).
4. Realice escaneos PET de animales pequeños y obtenga resultados de imágenes.
   1. Encienda la computadora conectada al sistema PET para animales pequeños. Haga clic en Adquisición de CT para iniciar el proceso de precalentamiento del sistema CT.
   2. Una vez completado el precalentamiento, seleccione el protocolo de escaneo y abra el flujo de trabajo de escaneo correspondiente (la duración del escaneo está preestablecida en 10 minutos).
   3. Haga clic en Vista de explorador para confirmar la posición del tendón de Aquiles en el centro del campo de escaneo. Si la posición es correcta, haga clic en Iniciar flujo de trabajo para realizar las exploraciones PET y CT.
      1. Utilice los siguientes parámetros: Vista de la cama NCT: 0-36,2-76,4 mm, tiempo de exploración CT: 60 s / una cama. PET: Adquirir por tiempo: 600 s; Nivel de energía fotopico de 511 KeV; 350 kev discriminación de nivel inferior; Discriminación de nivel superior de 650 KeV; Ventana de temporización de 3.432 ns.
   4. Una vez completado el escaneo, haga clic en Reconstrucción para reconstruir los archivos del escaneo y obtener los resultados de las imágenes. Utilice el área de trabajo de investigación para el procesamiento posterior de las imágenes.

Sintetizamos con éxito [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 con un rendimiento de más del 70% (Descomposición corregida), logrando una pureza radioquímica superior al 95%. El perfil de HPLC se muestra en la Figura 4. Se establecieron modelos de lesiones tendinosas quirúrgicamente y se administró [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 por vía intravenosa, seguido de imágenes PET exitosas en animales pequeños. Los resultados se presentan en la Figura 5, Figura 6 y Figura 7. Como se ilustra en la imagen PET (Figura 5), la absorción del trazador comenzó en el lado lesionado/roto a los 30 minutos después de la inyección y continuó aumentando durante los siguientes 90 minutos, mostrando una diferencia significativa en comparación con el tendón de Aquiles normal y el tejido muscular. Por el contrario, la Figura 6 demuestra que distinguir entre el tendón de Aquiles lesionado/roto y el tendón de Aquiles normal en las imágenes de TC es un desafío. La imagen de proyección de máxima intensidad (MIP) en la Figura 7 muestra que la captación del trazador comenzó en el lado lesionado/roto desde la primera semana después del modelado y alcanzó su punto máximo durante la segunda semana, lo que indica que la expresión de FAP, activada por la lesión y ruptura del tendón de Aquiles, alcanza su nivel más alto durante la segunda semana del proceso de reparación. Los valores específicos de SUV se proporcionan en la Tabla 1 y la Tabla 2. La Tabla 1 indica que a los 30, 60 y 90 min después de la inyección, los valores máximos y medios de SUV en el lado de la fractura/lesión fueron significativamente más altos que los del tendón de Aquiles normal y el tejido muscular, con significación estadística observada en los tres puntos temporales. La Tabla 2 confirma además que durante las 3 semanas iniciales, los valores de SUV en el lado de la fractura/lesión difirieron de los del lado normal y del tejido muscular, con la diferencia más pronunciada en la segunda semana. Los datos de la Tabla 1 y la Tabla 2 corroboran los hallazgos de imágenes representados en la Figura 5 y la Figura 7.

Figura 1: Modelos del tendón de Aquiles de la rata. (A) Modelo de lesión del tendón de Aquiles; (B) Modelo de rotura del tendón de Aquiles. (C) Estructura normal del tendón de Aquiles en ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La reacción del etiquetado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El método de fijación especial para mantener el tendón de Aquiles de la rata en el centro del campo de escaneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los espectros radiactivos de HPLC y ultravioleta de [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados de la PET. Imagen del modelo de rotura del tendón de Aquiles (A) 30 min después de la inyección, (B) 60 min después de la inyección, (C) 90 min después de la inyección. Imagen del modelo de lesión del tendón de Aquiles a (D) 30 min después de la inyección, (E) 60 min después de la inyección, (F) 90 min después de la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Resultados de la tomografía computarizada. Tomografía computarizada de la rotura del tendón de Aquiles después de (A) 7 días, (B) 14 días, (C) 21 días. Tomografía computarizada del tendón de Aquiles lesionado después de (D) 7 días, (E) 14 días, (F) 21 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Resultados de la MIP de la PET-CT. MIP de la PET-CT de la ruptura del tendón de Aquiles después de (A) 7 días, (B) 14 días, (C) 21 días. MIP de imágenes PET-CT del tendón de Aquiles lesionado después de (D) 7 días, (E) 14 días, (F) 21 días. Abreviatura: MIP = proyección de intensidad máxima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Los valores de SUV de los diferentes órganos 30, 60 y 90 min después de la inyección. Abreviatura: SUV = valor de absorción estandarizado.

Tabla 2: El valor de SUV de diferentes órganos 1 semana, 2 semanas y 3 semanas después del modelado. Abreviatura: SUV = valor de absorción estandarizado.

Las imágenes muestran diferencias notables entre el lado derecho y el izquierdo. Las tomografías por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) de animales pequeños ilustran claramente las diferencias entre los tendones de Aquiles normales y los lesionados/rotos. Estas diferencias pueden atribuirse a la acumulación de FAP en el lado lesionado/roto, lo que conduce a una mayor absorción del agente de imagen. Los experimentos de imagen, junto con las mediciones de SUV_max y SUV_means , demuestran claramente el contraste entre el tendón de Aquiles lesionado/roto y el tendón de Aquiles normal. Las alteraciones en la expresión de FAP durante el proceso de reparación se pueden monitorear de manera efectiva mediante imágenes PET.

El éxito de este protocolo depende de varios pasos críticos. En primer lugar, la preparación y el control de calidad del radiotrazador [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 son primordiales. Esto implica el empleo de técnicas radioquímicas precisas para garantizar una alta pureza radioquímica y una actividad específica. En segundo lugar, la inducción precisa de lesiones del tendón de Aquiles en modelos de ratas es crucial para mantener la coherencia entre los sujetos. Las técnicas quirúrgicas estandarizadas y los cuidados postoperatorios deben ser de acuerdo a los protocolos establecidos. En tercer lugar, determinar el momento óptimo para la toma de imágenes PET/CT después de la lesión es esencial para capturar de manera efectiva las etapas más informativas del proceso de curación. Puede ser necesaria una serie de puntos de tiempo para realizar un seguimiento preciso de la progresión de la expresión de FAP. En cuarto lugar, se requieren protocolos meticulosos de adquisición y reconstrucción de imágenes para maximizar tanto la relación señal-ruido como la resolución espacial, lo que puede ser particularmente difícil en los estudios de imágenes de animales pequeños⁹. Por último, el análisis cuantitativo riguroso de los datos de PET/CT desempeña un papel fundamental en la extracción de información significativa sobre el proceso de curación del tendón; esto incluye mediciones como SUV y potencialmente incorporando análisis de textura. Además, la radiosonda exhibe una absorción rápida y una retención prolongada en los tumores.

Se pueden considerar varias modificaciones y estrategias de solución de problemas para optimizar el protocolo. Pueden ser necesarios ajustes en la dosis del radiotrazador o en los puntos de tiempo de obtención de imágenes para lograr una relación señal-ruido óptima, equilibrando una absorción suficiente con una señal de fondo mínima. El refinamiento del modelo de lesión del tendón es esencial para garantizar la consistencia entre los sujetos, posiblemente a través de la estandarización de la fuerza aplicada en las lesiones por aplastamiento o el alcance de la laceración. La implementación de técnicas de corrección de movimiento podría ser crucial en la obtención de imágenes de animales pequeños para minimizar los artefactos causados por movimientos respiratorios u otros movimientos involuntarios. La exploración de algoritmos alternativos de reconstrucción de imágenes, incluidos los métodos de reconstrucción iterativos, es prometedora para mejorar la resolución espacial y la precisión cuantitativa. Además, la incorporación de imágenes PET dinámicas podría proporcionar información más profunda sobre la cinética de la absorción de [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 en los tendones lesionados, ofreciendo así información más completa sobre el proceso de curación. NOTA-FAP-2286 también ha demostrado un potencial sustancial en el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades, particularmente afecciones ortopédicas¹⁰. En tumores óseos malignos y benignos, como el osteosarcoma y los tumores óseos metastásicos, NOTA-FAP-2286 ofrece una alta especificidad para la PAF, lo que permite obtener imágenes PET/CT precisas y aplicaciones terapéuticas¹¹. Además, en afecciones inflamatorias y fibróticas como la fibrosis articular, los trastornos de la cicatrización de fracturas y la artritis, NOTA-FAP-2286 proporciona información valiosa sobre los procesos patológicos y la actividad de la enfermedad¹².

Aunque innovador, este método tiene varias limitaciones. La resolución espacial de las imágenes PET, que suele oscilar entre 1 mm y 2 mm en el caso de los escáneres de animales pequeños, puede restringir la capacidad de detectar cambios sutiles en la cicatrización de los tendones, especialmente en las primeras etapas o en el caso de lesiones pequeñas¹⁰. Existe un riesgo potencial de absorción inespecífica de radiotrazadores en los tejidos circundantes, lo que podría complicar la interpretación de los resultados, especialmente en regiones anatómicas complejas. Además, la necesidad de contar con equipo especializado y conocimientos especializados en radioquímica e imágenes de animales pequeños puede restringir su adopción generalizada. Trasladar los hallazgos de los modelos de ratas a aplicaciones humanas presenta desafíos debido a las variaciones en el tamaño del tendón, los procesos de curación y la escala de las lesiones. Además, aunque la exposición a la radiación asociada con las imágenes PET es mínima, puede limitar la frecuencia de los estudios longitudinales en el mismo animal.

La importancia de las imágenes PET/CT dirigidas a FAP radica en su potencial para proporcionar una visualización específica y sensible a nivel molecular de los procesos de curación de los^{tendones 9}. En comparación con las técnicas de imagen convencionales, como la resonancia magnética o la ecografía, esta técnica ofrece información única sobre la activación de los fibroblastos, un proceso crucial en la curación de los tendones. Permite una evaluación cuantitativa de la progresión de la cicatrización a lo largo del tiempo, lo que puede permitir una detección más temprana de anomalías o complicaciones en el proceso de curación. A diferencia de otros trazadores PET como [¹⁸F]-FDG, que refleja principalmente el metabolismo de la glucosa, [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 se dirige específicamente a la FAP, proporcionando así información más precisa sobre la respuesta fibroblástica durante la reparación del tendón. Esta especificidad mejora la capacidad de discernir entre la cicatrización normal y los procesos patológicos, lo que conduce a una caracterización más precisa de la lesión.

La importancia de este método en la investigación de las lesiones tendinosas es multifacética. Proporciona un enfoque no invasivo para monitorear los procesos de curación de los tendones en estudios preclínicos, lo que facilita la evaluación longitudinal sin la necesidad de biopsias repetidas o sacrificios de animales en varios puntos de tiempo. Esto no solo reduce significativamente el número de animales necesarios para la investigación, sino que también proporciona datos más consistentes. Además, este método es prometedor para evaluar nuevas intervenciones terapéuticas para las lesiones tendinosas, ya que ofrece una medida cuantitativa de la eficacia del tratamiento. Además, podría ser fundamental en la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la reparación y regeneración de los tendones, lo que podría identificar nuevas dianas terapéuticas. Particularmente emocionante es su posible traslación a aplicaciones clínicas, ya que podría mejorar el diagnóstico y el tratamiento de las lesiones de los tendones en humanos. En los campos de la investigación ortopédica, la medicina deportiva y la medicina regenerativa por igual, esta técnica de imagen tiene el potencial de convertirse en una poderosa herramienta para comprender y optimizar las estrategias relacionadas con la curación de los tendones, lo que en última instancia conduce a mejores resultados para los pacientes.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El estudio fue financiado por el Programa de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de Zhejiang (subvención No.2023KY694), la Fundación de Ciencias Naturales de Zhejiang (número de subvención: LTG23H180014).