Operação de eletroacupuntura em massa para camundongos ou ratos jovens

Aqui, apresentamos um protocolo para eletroacupuntura (EA) eficiente e rápida em camundongos ou ratos jovens usando um suporte impresso tridimensional (3D). Esta técnica permite a operação simultânea em vários animais, economizando tempo e aumentando a eficiência experimental.

A eletroacupuntura (EA) é amplamente utilizada para tratar várias condições de saúde. No entanto, o mecanismo subjacente do tratamento da EA permanece obscuro, dificultando sua promoção. O estudo mecanicista requer modelos de camundongos ou ratos para abordar essa questão. No entanto, esses animais não são obedientes ao processo experimental, que é demorado. Para resolver esses problemas, projetamos um fixador de corpo de pequenos animais impresso em 3D para melhorar a eficiência dos experimentos com animais da EA. Este vídeo mostra em detalhes como usar o fixador para executar EA em massa em camundongos ou ratos jovens. Para a seleção dos acupontos, optou-se pela linha oblíqua anterior do vértex temporal (cabeça MS6) e ponto de Tianshu (barriga ST25) para verificar o efeito do dispositivo de fixação com posição prona e posição supina. O uso do porta-animais de pequeno porte impresso em 3D permite que vários roedores sejam imobilizados e tratados simultaneamente, reduzindo o tempo e os recursos necessários para o experimento. Esta técnica poderia ser aplicada a outros modelos animais por impressão 3D de diferentes tamanhos e poderia potencialmente ser usada para várias condições de fixação. O dispositivo é benéfico para a promoção da pesquisa científica experimental em EA.

A eletroacupuntura (EA) é um método único no qual agulhas de acupuntura são inseridas no couro cabeludo e conectadas a uma eletromáquina para estimular pontos específicos¹. Ao contrário da estimulação manual, a AE permite um melhor controle da estimulação, estabilizando frequências e formas de onda específicas para alcançar efeitos terapêuticos ótimos². De acordo com uma pesquisa, 81,2% das instituições médicas na China usam EA ou acupuntura manual para tratar paralisia cerebral, neuralgia, paralisia facial e outras condições. Apesar de sua popularidade, o mecanismo específico de eficácia da EA ainda é desconhecido, o que tem dificultado sua promoção e aplicação no tratamento reabilitador de doenças neurológicas ^1,2,3. Mais pesquisas são necessárias para compreender completamente o mecanismo de eficácia da EA e promover seu uso no tratamento de reabilitação de doenças neurológicas.

À medida que a influência da acupuntura se expande em todo o mundo, muitos estudos já investigaram os mecanismos de EA realizados em modelos de roedores, como modelos de ratos ou camundongos ^1,2,3. Vários problemas são frequentemente encontrados nos experimentos de roedores da EA. A primeira é como imobilizar roedores sem anestesia, já que a acupuntura realizada em indivíduos acordados é mais reflexiva da prática clínica. Além disso, alguns experimentos requerem que os animais estejam acordados para observar os efeitos do tratamento ^2,3. Outro desafio é localizar com precisão os acupontos em camundongos ou ratos que correspondem aos dos humanos. A localização precisa de acupontos em roedores experimentais está sendo estudada por muitos estudiosos ^4,5. Nesse protocolo, foram selecionadas as SM6 e ST25, as quais foram claramente definidas em roedores pela transformação da localização anatômica humana. A MS6 é comumente utilizada para o tratamento de algumas doenças cerebrais, como a doença de Parkinson⁶. O ST25 é usualmente utilizado para tratar problemas gastrointestinais, como diarreia⁷. Esses dois acupontos foram escolhidos principalmente para demonstrar como os roedores podem ser efetivamente imobilizados tanto na posição supina quanto na posição prona. Além disso, esses acupontos têm sido extensivamente estudados e oferecem insights significativos para fins de pesquisa ^6,7.

O método anterior de imobilização de um único rato para experimentos não é apenas demorado, mas também difícil de manusear por uma única pessoa⁸. Além disso, devido à não cooperação dos animais, a taxa de sucesso é relativamente baixa na prática. Portanto, há uma necessidade crítica de criar um modelo animal facilmente estabelecido com características estáveis para melhorar a eficiência do experimento. Neste artigo, foi introduzido um suporte impresso em 3D para pequenos animais que poderia facilmente imobilizar múltiplos roedores, levando à restrição motora. O objetivo deste trabalho é administrar tratamentos de EA a um lote de ratos jovens ou camundongos, enfocando as estratégias de restrição em massa de camundongos, identificação e estimulação de acupontos MS6 e ST25.

Os experimentos deste estudo obedecem ao princípio "3Rs" da ética animal e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Etnia do Laboratório da Universidade de Medicina do Exército (AMUWEC20234543).

1. Preparo do dispositivo de fixação do corpo de roedores

1. Projetar um pequeno porta-animais com base na patente do modelo de utilidade chinês⁹.
2. Produza o dispositivo através da tecnologia de impressão 3D.
3. Prepare uma corda de 2 m de comprimento e divida em 6 cordas. Rosqueie estas 6 cordas através dos orifícios no fixador. Utilize a fivela com mola para prender as extremidades da corda, facilitando o ajuste do tamanho do laço.
   NOTA: O fixador pode ser fabricado por qualquer empresa equipada com tecnologia de impressão 3D com base em um desenho de projeto. O desenho do projeto do dispositivo é mostrado na Figura 1. O fixador utilizado neste estudo foi produzido por uma impressora 3D por um método de impressão denominado fused deposition modeling (FDM), também conhecido como fused filament fabrication (FFF)¹⁰. Este método de manufatura aditiva imprime as partes do projeto camada por camada, depositando seletivamente o material na forma fundida em um caminho predeterminado. O processo utiliza polímeros termoplásticos que vêm em filamentos para criar a estrutura física final. O aparelho de imobilização utilizado neste estudo pode fixar três animais simultaneamente, necessitando de seis cordas, sendo que cada animal necessita de um par de cordas: uma para o pescoço e outra para o tronco.

2. Preparação de roedores

1. Compre 3 ratos Sprague-Dawley (10-40 g, 7-45 dias de idade) e 3 camundongos C57 BL/C (5-40 g).
2. Crie animais em uma sala com um ciclo dia/noite de 12 horas, uma temperatura ambiente de 21-23 °C e uma umidade de 45%-60%. Desinfetar e ventilar o ambiente de alimentação regularmente, e permitir que os animais comam e bebam livremente.

3. Fixação dos roedores ao fixador (posição prona)

1. Coloque a cabeça do roedor no orifício em forma de U na frente do fixador, com o roedor em decúbito ventral. Passe o corpo do roedor através de duas alças de corda.
2. Aperte as cordas ao redor do pescoço e abdômen do roedor, garantindo que ele não possa escapar, mas não tão firmemente a ponto de causar desconforto respiratório e morte.
   1. O passo fundamental é fixar o pescoço no lugar. Deixe um espaço de 2-5 mm entre o pescoço do roedor e a corda. Certifique-se de que a corda não esteja muito apertada para os animais estrangular ou muito solta para escapar.
3. Corrija os outros roedores da mesma forma no dispositivo.
4. Repetir os passos de fixação acima (3.1-3.2) por 3 dias para minimizar a potencial resposta ao estresse causada pelo procedimento de fixação. Repetir o procedimento de fixação por 3 dias consecutivos, com cada sessão durando 5 min por dia.
   NOTA: Para garantir que os roedores não ficassem sobrecarregados durante o procedimento de fixação, repetimos o procedimento por 3 dias consecutivos. Cada sessão teve duração de 5 min por dia, proporcionando tempo suficiente para camundongos ou ratos se aclimatarem ao procedimento e minimizando qualquer potencial desconforto.
5. Strat EA a partir do dia 4.
6. Para evitar a propagação de doenças, mergulhe um cotonete estéril ou bola em álcool a 75% e limpe bem o suporte para limpá-lo e desinfetá-lo antes e depois de cada uso. Use luvas e outros equipamentos de proteção para evitar potenciais riscos à saúde ao manusear roedores.

4. Realização de EA em camundongos ou ratos jovens (MS6)

1. Escolha agulhas de acupuntura estéreis descartáveis de 0,25 mm x 13 mm.
2. Encontre os acupontos por localização anatômica e confirme a profundidade de inserção no acuponto.
   Observação : MS6 está localizado no lado lateral da cabeça. Essa região da cabeça passa pela conexão entre Shencong (Ex-hn1) e Xuanli (GB6), também conhecida como parietal anterior (Du21). MS6 corresponde à expressão do giro pré-central do córtex cerebral no couro cabeludo. Ex-hn1 está localizado 0,5 cm atrás do ponto médio da linha média anteroposterior da cabeça. GB6 está localizado no ponto médio da frente da orelha e no ângulo final do olho. O nervo supratroclear superior, o nervo supraorbital, o nervo occipital e o nervo auriculotemporal estão distribuídos nele. MS6 é usado principalmente para tratar acidente vascular cerebral e encefalopatia, como distúrbios motores.
3. Torcer lentamente e inserir agulhas estéreis bilateralmente no MS6 a uma profundidade de 3/5 do Shenchong anterior (Exhn1) ao Xuanli (GB6) ao longo do subcutâneo em 3 roedores, respectivamente.
4. Conecte um lado do cabo de conexão ao instrumento EA.
5. Conecte outro lado do cabo de conexão que contém os clipes EA positivos e negativos às hastes da agulha de acupuntura à esquerda e à direita MS6.
6. Ative o instrumento EA.
   1. Gire o botão (Função/ Escolher interruptor) para definir a frequência e o modo de função.
   2. Defina a Frequência para 10 Hz e escolha um modo de Onda Contínua .
   3. Gire o botão correspondente (Ajustar intensidade) para definir a intensidade. Cada botão de ajuste de intensidade controla a força atual dos roedores do fio conectado abaixo dele. Ajuste a intensidade da corrente para a faixa aceitável de roedores, geralmente 1-2 mA, com duração de 5 min.
      OBS: É importante monitorar a respiração e o comportamento dos roedores durante o procedimento para garantir que eles não estejam sentindo nenhum sofrimento ou desconforto. Se o rato parece estar lutando ou com dor, o procedimento deve ser interrompido imediatamente.

5. Fixação dos roedores ao fixador (posição supina)

1. Coloque as cabeças do roedor no orifício em forma de U na frente do fixador, com o roedor em decúbito ventral. Passe o corpo do roedor através de duas alças de corda.
2. Aperte a corda ao redor do pescoço e abdômen do roedor, garantindo que ele não possa escapar, mas não tão apertado a ponto de causar desconforto respiratório e morte.
   NOTA: Os pontos a serem observados durante a fixação são os mesmos da etapa 3.2.
3. Corrija os outros roedores da mesma forma.
4. Como no passo 3.4, repita os passos de fixação acima por 3 dias para reduzir a resposta de estresse dos roedores.
5. Strat EA a partir do dia 4.
   NOTA: A desinfecção é executada conforme mencionado na etapa 3.6.

6. Realizando EA (ST25)

1. Escolha agulhas de acupuntura estéreis descartáveis de 0,25 mm x 13 mm.
2. Encontre os acupontos por localização anatômica e confirme a profundidade de inserção no acuponto.
   NOTA: ST25 está localizado ao nível da cicatriz umbilical. Posicionar este ponto em roedores requer primeiro medir o comprimento da pata do roedor. ST25 está localizado a 2/3 do comprimento da pata ao lado do umbigo. Por exemplo, se a pata medida do roedor é de 0,6 cm, então ST25 está localizado 0,4 cm à direita e esquerda do umbigo.
3. Torcer lentamente e penetrar agulhas estéreis em ST25 bilateral a uma profundidade de 4-8 mm em 3 roedores, respectivamente.
4. Conecte um lado do cabo de conexão ao instrumento EA.
5. Conecte outro lado do cabo de conexão que contém os clipes EA positivos e negativos às hastes da agulha de acupuntura no ST25 esquerdo e direito.
6. Ative o instrumento EA.
   1. Gire o botão (Função/ Escolher interruptor) para definir a frequência e o modo de função.
   2. Defina a Frequência para 10 Hz e escolha Modo de Onda Contínua.
   3. Gire o botão correspondente (Ajustar intensidade) para definir a intensidade. Cada botão de ajuste de intensidade controla a força atual do rato do fio conectado abaixo dele. Ajuste a intensidade da corrente para a faixa aceitável de roedores, geralmente 1-2 mA, com duração de 5 min.
      NOTA: As observações foram as mesmas do passo 4.6.

A planta baixa do fixador do corpo do animal que projetamos é mostrada na Figura 1. Além disso, um modelo gráfico 3D deste fixador foi submetido para fornecer uma visão abrangente do projeto (Arquivo Suplementar 1). Trata-se de um dispositivo que permite imobilizar 3 roedores e realizar EA simultaneamente. Ratos e camundongos ficaram restritos ao fixador em estado de vigília, e tanto a posição prona quanto a supina puderam ser firmemente fixadas sem causar lesão aos roedores (Figura 2 e Figura 3). Com o auxílio do fixador, os acupontos MS6 e ST25 foram localizados e agulhados com sucesso em roedores (Figura 4 e Figura 5).

Para controlar as variáveis e validar a eficácia dessa abordagem de fixação, um experimentador imobilizou 3 ratos (Vídeo 1) ou 3 camundongos por três tentativas consecutivas em um estudo comparativo (Tabela 1). O achado demonstrou que o tempo médio de imobilização de 3 ratos nas posições prona e supina utilizando essa ferramenta foi de 77,1 s ± 7,8 s e 74,9 s ± 8,6 s, respectivamente (média ± DP). Quanto a 3 camundongos, o tempo médio de imobilização nas posições prona e supina com esse fixador foi de 72,0 s ± 10,5 s e 62,3 ± 4,2 s, respectivamente (média ± DP). Ambos os grupos de ratos e camundongos foram imobilizados com sucesso no dispositivo e não escaparam durante o tratamento EA de 5 min (Figura 2 e Figura 3). Na intensidade de 1-2 mA EA, camundongos e ratos se sentiram confortáveis e não lutaram violentamente. A respiração em camundongos e ratos foi estável, e nenhuma morte súbita ocorreu nos animais. Após o tratamento, os camundongos e ratos permaneceram saudáveis e sobreviveram.

Gráfico 1. Planta baixa do fixador de roedores em batelada. (1) Dispositivo porta-roedores, dividido em três partes. (2,3) Pilares: utilizados para fixar os membros de camundongos ou ratos jovens. (4) Caverna: usada para fixar a cabeça. (5) Furo: usado para fixar o pescoço dos ratos jovens. (6) Furo: usado para fixar o corpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ratos jovens fixados em posição prona e supina. (A-C) Tratamento do EA no acuponto MS6. (D-F) Tratamento do EA no acuponto ST25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Camundongos fixos em decúbito ventral e supino. (A-C) Tratamento do EA no acuponto MS6. (D-F) Tratamento do EA no acuponto ST25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: MS6 na região cerebral. O MS6 está localizado na face lateral da cabeça e está posicionado no ponto de conexão entre Shencong (Ex-hn1) e Xuanli (GB6), também conhecido como região parietal anterior (Du21). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ponto ST25 bilateral em vermelho. O ST25 está localizado ao nível da cicatriz umbilical. O posicionamento deste ponto no roedor requer primeiro a medição do comprimento da pata do roedor. ST25 está localizado a 2/3 do comprimento da pata ao lado do umbigo. Por exemplo, se a pata medida do roedor é de 0,6cm, então o ST25 é de 0,4 à direita e à esquerda do umbigo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tempo gasto na fixação de ratos e camundongos nas posições prona e supina. Os dados (tempo em segundos) foram obtidos por um experimentador que imobilizou 3 ratos e 3 camundongos por 3 tentativas consecutivas, respectivamente. O tempo médio necessário foi determinado calculando-se a média e o desvio padrão do tempo gasto para as 3 tentativas.

Arquivo suplementar 1: Arquivo de projeto do fixador de roedores de banho impresso em 3D. Este modelo 3D pode ser arrastado para obter uma visão completa de 360° do projeto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo 1: Filme de fixação em decúbito ventral e supino de ratos jovens com SD, conforme descrito em detalhes na legenda da Figura 2 . Este vídeo demonstra um experimentador contendo 3 ratos nas posições supina e prona. Clique aqui para baixar este vídeo.

A eletroacupuntura (EA) é uma forma de acupuntura que envolve o uso de estimulação elétrica em agulhas de acupuntura¹¹. Essa técnica envolve o uso de microcorrentes de pulso de intensidade e frequência específicas para estimular pontos de acupuntura e alcançar efeitos terapêuticos aprimorados³. No entanto, o mecanismo de EA para cicatrização é limitado e requer extensa pesquisa básica para comprovação1,2,3. Modelos de roedores são comumente utilizados em estudos básicos de EA8,12,13, e nosso objetivo é fornecer um método rápido e eficiente para a realização desses experimentos em ratos e camundongos.

Atualmente, o experimento da EA enfrenta muitos desafios. O principal desafio é imobilizar efetivamente roedores sem anestesia. A imobilização estável dos animais é crucial e tem um impacto significativo no resultado da experiência animal. Caso contrário, as funções fisiológicas dos animais anestesiados são diferentes das dos animais acordados, e o tratamento clínico com acupuntura é sempre realizado em pacientes acordados. Portanto, estudos experimentais com animais acordados são mais práticos para fins clínicos. Anteriormente, a imobilização com placa de fixação era o método preferido, porém demorado e permitido apenas a operação de um único roedor¹⁴. Os imobilizadores tradicionais também exigiam amarrar os membros do roedor, o que era um processo demorado e muitas vezes resultava em dor devido à fixação apertada. Vários estudos implementaram a fita adesiva para camundongos, mas sua capacidade de escapar facilmente representa desafios significativos, particularmente durante procedimentos de acupuntura⁸. Quando há mais sujeitos experimentais, a operação em lote é frequentemente necessária para economizar tempo e esforço². Por isso, desenvolvemos um fixador de corpo de pequenos animais impresso em 3D que oferece várias vantagens em relação aos métodos tradicionais de fixação¹⁵: 1) encurta o tempo de fixação, melhorando consideravelmente a eficiência experimental¹⁶; 2) é simples e de fácil aplicação, não sendo afetado por fatores subjetivos^15,16; 3) Levou menos nocivo aos roedores; 4) Uma vez fixo, o EA pode ser realizado em vários ratos jovens ao mesmo tempo, economizando tempo e permitindo a observação simultânea dos resultados do tratamento.

O uso da tecnologia de impressão 3D para estudos experimentais de EA é uma expansão valiosa no campo da pesquisa em acupuntura. O dispositivo pode ser ajustado para qualquer tamanho quando impresso em 3D, o que ajuda a acupuntura experimental a ser realizada de forma mais eficaz. A modelagem de deposição fundida (FDM), também conhecida como fabricação de filamentos fundidos (FFF), um método de fabricação aditiva^10, é usada para imprimir o fixador em 3D. Este dispositivo é adequado não só para este experimento, mas também para a realização de experimentos como TC ou RM em roedores^17,18. Além disso, também pode ser aplicado a qualquer situação em que a fixação em massa seja necessária, exceto para estudos de EA. Devido à prevalência da tecnologia de impressão 3D, este dispositivo está facilmente disponível. Pode ser feito através de um fabricante local de impressão 3D. Além disso, este dispositivo de fixação pode ser modificado e personalizado com base no desenho do projeto. Neste estudo, o dispositivo de fixação é composto por três seções, cada uma capaz de fixar um único roedor. Se for necessário incluir roedores adicionais ou outros animais, o dispositivo pode ser dimensionado proporcionalmente para acomodar o maior número. Por exemplo, ele pode ser projetado como um dispositivo que pode fixar 5 ratos ou até mesmo como um dispositivo de fixação para outros animais, como coelhos.

Outro desafio é encontrar acupontos nos roedores que correspondam aos humanos. Os acupontos MS6 e ST25 foram escolhidos para examinar os efeitos da fixação em decúbito ventral e supino. Além disso, esses dois acupontos têm sido estudados por muitos estudiosos ^6,7,19. A MS6 é mais frequentemente utilizada em pesquisas de doenças cerebrais, como doença de Parkinson, disfunção após acidente vascular cerebral, etc ^6,13,19. A SM6 poderia melhorar a função neurológica de ratos que sofrem de acidente vascular cerebral isquêmico via modulação da via de sinalização JAK/STAT mediada por IL-12 em um estudo anterior¹³. O ST25 é usualmente utilizado para o tratamento do trato gastrintestinal, como diarreia e síndrome do intestino irritável (SII)^7,12. Um estudo anterior relatou que o EA aplicado apenas no ponto ST25 mostrou o potencial de aliviar a hipersensibilidade visceral, ao mesmo tempo em que restaurou a frequência normal de ondas lentas e o ritmo do cólon em ratos com SII¹². Esses dois acupontos também são capazes de demonstrar adequadamente os efeitos do posicionamento supino e prono em roedores. Além disso, esses dois acupontos têm a significância de exibição ^6,7,19. Como esses dois acupontos têm sido estudados por muitos estudiosos, fornecemos um protocolo sobre como localizar esses dois acupontos em roedores. É útil para experimentos com animais onde estudos MS6 e ST25 estão sendo conduzidos. No entanto, o presente estudo apresenta algumas limitações. Por exemplo, a posição e a profundidade de inserção da agulha não podem ser medidas objetivamente e podem variar de acordo com o nível de experiência do operador.

Nossos experimentos cumprem o princípio "3Rs" da ética animal e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal de Laboratório e Étnico da Universidade de Medicina do Exército. O passo mais desafiador e crucial neste experimento é encontrar um método confiável e eficiente para imobilizar roedores com segurança. Isso ocorre porque qualquer tentativa de escapar ou morte dos roedores durante a estimulação de 5 minutos do EA resultará no fracasso do experimento. O design da caverna frontal aproveita a preferência dos roedores para cavar buracos. Colocar a cabeça dos roedores dentro da caverna tem o objetivo de proporcionar conforto psicológico. Além disso, as cordas utilizadas para prender a cabeça e o corpo dos roedores devem estar moderadamente seguras, não permanecendo excessivamente frouxas nem excessivamente apertadas para evitar a fuga do roedor e evitar desconforto respiratório. Após a estimulação elétrica, os comportamentos e respostas dos roedores foram cuidadosamente monitorados. Idealmente, ao aplicar uma corrente de 1-2 mA, os roedores não apresentariam lutas agressivas ou vocalizações em resposta ao choque elétrico²⁰. O fixador também pode ser usado para fixar roedores em decúbito dorsal, prono e outros tipos de fixação, conforme necessário. É adequado para uma variedade de necessidades experimentais, e a operação de fixação é de fácil execução²¹. No entanto, isso levou a uma limitação de que animais de tamanhos variados necessitam de equipamentos de imobilização personalizados de tamanhos variados. Apenas animais com pequenas discrepâncias de tamanho podem ser contidos usando o mesmo dispositivo. O fixador de imobilização em batelada utilizado neste protocolo imobiliza de forma eficiente e confiável roedores dentro da faixa de peso de 10-40 g. Para animais fora dessa faixa de peso, são necessários fixadores de imobilização em lote personalizados para atender às suas necessidades específicas.

Além disso, a fixação de roedores em lote impressa em 3D usada para operações EA a granel em roedores oferece maior segurança, pois é resistente a arranhões e mordidas de roedores. Estudos de EA em roedores têm fornecido valiosas informações sobre os potenciais benefícios dessa modalidade terapêutica em humanos 1,2,3,6,7,11,14. O dispositivo é benéfico para a promoção da pesquisa científica experimental em EA. Essa técnica permite que os pesquisadores realizem experimentos com animais que necessitem da imobilização de animais. Além disso, apresenta a localização exata de ST25 e MS6, que podem servir de referência para aqueles que estudam esses dois acupontos no futuro. Em última análise, espera-se que essa metodologia leve a modelos animais valiosos para a pesquisa de EA.

O fixador de camundongos em batelada impresso em 3D descrito neste artigo oferece um método simples e eficiente para a realização de experimentos de EA em ratos ou camundongos. Seu design considera o conforto e a segurança dos animais, bem como a necessidade de fixação rápida e eficiente. Este dispositivo tem o potencial de economizar tempo e esforço na realização de experimentos com animais, promovendo o avanço da pesquisa em eletroacupuntura e, finalmente, levando a melhores tratamentos para várias doenças.

Os autores declararam que não existem conflitos de interesse concorrentes.

Agradecimentos ao Departamento de Neurocirurgia do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Medicina do Exército pelo apoio ao local. Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Natural Science Foundation of China (82104696).