マウスまたは若齢ラットに対するバルク電気鍼治療手術

ここでは、3次元(3D)プリントホルダーを使用して、マウスまたは若いラットに効率的かつ迅速な電気鍼治療(EA)を行うためのプロトコルを紹介します。この技術により、複数の動物を同時に操作できるため、時間が節約され、実験効率が向上します。

電気鍼治療(EA)は、さまざまな健康状態の治療に広く使用されています。しかし、EA治療の根底にあるメカニズムは不明のままであり、その推進を妨げています。メカニズム研究では、この問題に対処するためにマウスまたはラットモデルが必要です。しかし、これらの動物は実験プロセスに従わないため、時間がかかります。これらの問題を解決するために、EAの動物実験の効率を向上させるために、3Dプリントされた小動物の体バルク固定器を設計しました。このビデオでは、固定具を使用してマウスまたは若いラットにバルクEAを実行する方法を詳しく説明します。ツボの選定にあたっては、側頭頂点の前斜線(MS6頭部)と天書点(ST25腹部)を選定し、伏臥位と仰臥位による固定装置の効果を検証した。3Dプリントされた小動物ホルダーを使用すると、複数のげっ歯類を同時に固定して処理できるため、実験に必要な時間とリソースを削減できます。この技術は、さまざまなサイズの3Dプリントによって他の動物モデルに適用でき、さまざまな固定条件に使用できる可能性があります。このデバイスは、EAでの実験的科学研究の促進に役立ちます。

電気鍼治療(EA)は、鍼を頭皮に挿入し、電気機械に接続して特定のツボを刺激するユニークな方法です¹。手動刺激とは異なり、EAは特定の周波数と波形を安定させることで刺激をより適切に制御し、最適な^{治療効果を得ることができます}2。調査によると、中国の医療機関の81.2%が、脳性麻痺、神経痛、顔面神経麻痺などの治療にEAまたは手鍼治療を使用しています。その人気にもかかわらず、EAの有効性の特定のメカニズムはまだ不明であり、神経疾患のリハビリテーション治療におけるその促進と応用を妨げています^1,2,3。EAの有効性メカニズムを十分に理解し、神経疾患のリハビリテーション治療への応用を促進するためには、さらなる研究が必要です。

鍼治療の影響が世界的に拡大するにつれて、ラットやマウスのモデルなどのげっ歯類モデルで実施されるEAのメカニズムはすでに多くの研究で調査されています^1,2,3。EAのげっ歯類の実験では、いくつかの問題がしばしば発生します。1つ目は、覚醒している被験者に行われる鍼治療が臨床診療をより反映しているため、麻酔なしでげっ歯類を固定する方法です。さらに、一部の実験では、治療効果を観察するために動物を目覚めさせる必要があります^2,3。また、マウスやラットのツボをヒトのツボと正確に一致させることも課題です。実験的なげっ歯類における経穴の正確な局在は、現在多くの学者によって研究されています^4,5。このプロトコルでは、MS6とST25が選択され、ヒトの解剖学的局在化の変換によってげっ歯類で明確に定義されています。MS6は、パーキン^ソン病6などの脳疾患の治療に一般的に使用されています。ST25は通常、下痢などの胃腸の問題の治療^{に使用されます7。}これらの2つのツボは、主にげっ歯類を仰臥位と腹臥位の両方で効果的に固定する方法を示すために選択されました。さらに、これらのツボは広く研究されており、研究目的に重要な洞察を提供しています^6,7。

実験のために1匹のラットを固定する従来の方法は、時間がかかるだけでなく、^{1人で扱う}のも困難でした8。さらに、動物が非協力的であるため、実際の成功率は比較的低いです。そのため、実験の効率化のためには、安定な特性を持つ簡便なモデル動物を作製することが急務となっています。この記事では、複数のげっ歯類を簡単に固定でき、運動制限につながる小動物用の3Dプリントホルダーを紹介しました。この論文の目的は、マウスのバルク制限、MS6およびST25経穴の同定、および刺激の戦略に焦点を当てて、若いラットまたはマウスのバッチにEA治療を投与することです。

この研究の実験は、動物倫理の「3R」の原則に準拠しており、陸軍医科大学(AMUWEC20234543)の実験動物福祉および民族委員会によって承認されています。

1.げっ歯類の体固定装置の準備

1. 中国の実用新案特許⁹に基づいて小動物用ホルダーを設計します。
2. 3D印刷技術でデバイスを製造します。
3. 長さ2mのロープを用意し、6本のロープに分けます。この6本のロープを固定具の穴に通します。バネ仕掛けのバックルを利用してロープの端を固定し、ループサイズの調整を容易にします。
   注:固定具は、設計図に基づいて3D印刷技術を備えた任意の会社で製造できます。デバイスの設計図を 図1に示します。本研究で用いた固定具は、溶融堆積モデリング(FDM)、溶融フィラメント製造(FFF)とも呼ばれる印刷法により、3Dプリンターで製造された¹⁰。この積層造形法は、溶融した形状の材料を所定の経路に選択的に堆積させることにより、設計の部品を層ごとに印刷します。このプロセスでは、フィラメントに入った熱可塑性ポリマーを使用して、最終的な物理的構造を作成します。本研究で用いた固定装置は、3匹の動物を同時に固定することができ、6本のロープが必要で、各動物には首用と胴体用のロープが1本ずつ必要になります。

2.げっ歯類の準備

1. 3匹のSprague-Dawleyラット(10-40 g、7-45日齢)と3匹のC57 BL / Cマウス(5-40 g)を購入します。
2. 昼夜サイクルが12時間、周囲温度が21〜23°C、湿度が45%〜60%の部屋で動物を飼育します。定期的に給餌環境の消毒と換気を行い、動物が自由に食べたり飲んだりできるようにしてください。

3.げっ歯類を固定具に固定する(腹臥位)

1. げっ歯類の頭を固定具の前のU字型の穴に置き、げっ歯類をうつ伏せの位置にします。げっ歯類の体を2つのロープループに通します。
2. げっ歯類の首と腹部にロープを固定し、逃げられないようにしますが、呼吸困難や死を引き起こすほどきつく締め付けないでください。
   1. 重要なステップは、首を所定の位置に固定することです。げっ歯類の首とロープの間に2〜5mmの隙間を残します。ロープがきつすぎて動物が首を絞めたり、緩すぎて逃げられなかったりしないようにしてください。
3. 他のげっ歯類をデバイス内で同じ方法で固定します。
4. 上記の固定手順(3.1-3.2)を3日間繰り返して、固定手順によって引き起こされる潜在的なストレス反応を最小限に抑えます。固定手順を3日間連続して繰り返し、各セッションは1日あたり5分間続きます。
   注:固定手順中にげっ歯類に過度のストレスがかからないようにするために、手順を3日間連続して繰り返しました。各セッションは1日あたり5分間続き、マウスまたはラットが手順に慣れ、潜在的な不快感を最小限に抑えるのに十分な時間を提供しました。
5. 4日目からのストラトEA。
6. 病気の蔓延を防ぐために、滅菌綿棒またはボールを75%アルコールに浸し、ホルダーを完全に拭いて、使用する前後に清掃および消毒してください。げっ歯類を取り扱う際の潜在的な健康上のリスクを回避するために、手袋やその他の保護具を使用してください。

4. マウスまたは若齢ラットでのEAの実施(MS6)

1. 0.25 mm x 13 mmの使い捨て滅菌鍼をお選びください。
2. 解剖学的位置からツボを見つけ、ツボの挿入深さを確認します。
   注意: MS6はヘッドの外側にあります。頭部のこの領域は、前頭頂葉(Du21)としても知られる深空(Ex-hn1)と玄里(GB6)の間の接続を通過します。MS6は、頭皮の大脳皮質の中心前回の発現に対応します。Ex-hn1は、頭部の前後正中線の中点から0.5cm後方に位置しています。GB6は、耳の前部と目の端の角度の中間点にあります。上顎上神経、眼窩上神経、後頭神経、および耳介側頭神経が分布しています。MS6は、主に脳卒中や運動障害などの脳症の治療に使用されます。
3. 3匹のげっ歯類の皮下に沿って、前深中(Exhn1)から玄里(GB6)まで、それぞれ3/5の深さでMS6に滅菌針をゆっくりとねじり、挿入します。
4. 接続ケーブルの片側をEA機器に接続します。
5. プラスとマイナスのEAクリップを含む接続ケーブルの反対側を、左右のMS6の鍼灸シャンクに接続します。
6. EAインストゥルメントをオンにします。
   1. ボタンを回して(機能/スイッチを選択)、周波数と機能モードを設定します。
   2. [周波数] を 10 Hz に設定し、[連続波] モードを選択します。
   3. 対応するボタン(強度調整)を回して強度を設定します。各強度調整ボタンは、その下に接続されたワイヤのげっ歯類の現在の強度を制御します。電流強度をげっ歯類の許容範囲(通常は1〜2 mA、5分間持続)に調整します。
      注意: 処置中のげっ歯類の呼吸と行動を監視して、苦痛や不快感を感じていないことを確認することが重要です。ラットが苦しんでいる、または痛みを感じているように見える場合は、手順を直ちに中止する必要があります。.

5.げっ歯類を固定具に固定する(仰臥位)

1. げっ歯類の頭を固定具の前のU字型の穴に入れ、げっ歯類をうつ伏せの位置にします。げっ歯類の体を2つのロープループに通します。
2. げっ歯類の首と腹部にロープを固定し、逃げられないようにしますが、呼吸困難や死を引き起こすほどきつく締め付けないでください。
   注:固定中の注意点は、手順3.2と同じです。
3. 他のげっ歯類も同じように修正します。
4. ステップ3.4と同様に、げっ歯類のストレス反応を減らすために、上記の固定ステップを3日間繰り返します。
5. 4日目からのストラトEA。
   注意: 消毒は、手順3.6で説明したように実行されます。

6. EAの実行(ST25)

1. 0.25 mm x 13 mmの使い捨て滅菌鍼をお選びください。
2. 解剖学的位置からツボを見つけ、ツボの挿入深さを確認します。
   注:ST25は臍の高さにあります。げっ歯類にこの点を配置するには、まずげっ歯類の足の長さを測定する必要があります。ST25は、おへその隣の足の長さの2/3にあります。例えば、げっ歯類の測定された足が0.6 cmの場合、ST25は臍の左右0.4 cmに位置します。
3. 3匹のげっ歯類で、滅菌針をST25両側にゆっくりとねじり、4〜8mmの深さで貫通させます。
4. 接続ケーブルの片側をEA機器に接続します。
5. プラスとマイナスのEAクリップを含む接続ケーブルの反対側を、左右のST25の鍼灸シャンクに接続します。
6. EAインストゥルメントをオンにします。
   1. ボタンを回して(機能/スイッチを選択)、周波数と機能モードを設定します。
   2. 「周波数」を「10 Hz」に設定し、「連続波モード」を選択します。
   3. 対応するボタン(強度調整)を回して強度を設定します。各強度調整ボタンは、その下に接続されたワイヤのラットの現在の強度を制御します。電流強度をげっ歯類の許容範囲(通常は1〜2 mA、5分間持続)に調整します。
      注:観察結果はステップ4.6と同じでした。

私たちが設計した動物の体固定具の間取り図を図1に示します。さらに、この固定具の3Dグラフィックモデルを提出し、設計の包括的なビューを提供しました(補足ファイル1)。3匹のげっ歯類を固定し、同時にEAを行うことができる装置です。ラットとマウスは覚醒状態で固定具に制限され、うつ伏せと仰臥位の両方をげっ歯類に損傷を与えることなくしっかりと固定することができました(図2および図3)。固定具の助けを借りて、MS6およびST25の経穴をげっ歯類で正常に特定し、針を刺しました(図4および図5)。

変数を制御し、この固定アプローチの有効性を検証するために、1人の実験者が3匹のラット(ビデオ1)または3匹のマウスを3回連続して固定した比較研究(表1)を行いました。その結果、このツールを用いた腹臥位および仰臥位での3匹のラットの固定の平均時間は、それぞれ77.1秒±7.8秒、74.9秒±8.6秒であった(平均±SD)。3匹のマウスについて、この固定具を用いた腹臥位と仰臥位での平均固定時間は、それぞれ10.5秒±72.0秒、4.2秒±62.3秒であった(平均±SD)。ラットとマウスの両方のグループは、デバイス上で正常に固定され、5分間のEA処理中に逃げませんでした(図2 および 図3)。1〜2mAのEA強度では、マウスとラットは快適に感じ、激しくもがきませんでした。マウスとラットの呼吸は安定しており、動物の突然死は発生しませんでした。治療後、マウスとラットは健康に保たれ、生存しました。

図 1.バッチげっ歯類固定具の間取り図。 (1)げっ歯類ホルダー装置、3つの部分に分かれています。(2,3)柱:マウスや若いラットの手足を固定するために使用されます。(4)洞窟:頭を固定するために使用されます。(5)穴:若いラットの首を固定するために使用されます。(6)穴:ボディを固定するために使用されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:うつ伏せと仰臥位の固定された若いラット。 (A-C)MS6経穴のEA治療。(D-F)ST25経穴のEA治療。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:マウスをうつ伏せと仰臥位に固定。 (A-C)MS6経穴のEA治療。(D-F)ST25経穴のEA治療。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:大脳領域のMS6。 MS6は頭部の外側に位置し、深空(Ex-hn1)と玄里(GB6)の間の接続点に位置し、前頭頂部(Du21)領域としても知られています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:赤色のST25両側点。 ST25は臍の高さにあります。げっ歯類にこの点を配置するには、まずげっ歯類の足の長さを測定する必要があります。ST25は、おへその隣の足の長さの2/3にあります。たとえば、げっ歯類の測定足が0.6cmの場合、ST25は臍の左右に0.4です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:ラットとマウスの腹臥位と仰臥位の固定に費やされた時間。 データ(秒単位の時間)は、3匹のラットと3匹のマウスをそれぞれ3回連続して固定した1人の実験者によって得られました。所要時間の平均は、3回の試行にかかった時間の平均と標準偏差を計算することによって決定された。

補足ファイル1:3Dプリントされた浴室げっ歯類固定具設計ファイル。 この3Dモデルをドラッグして、デザインを360°完全に表示することができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

動画1: 図2 の凡例に詳述されている、若いSDラットの腹臥位と仰臥位固定の動画。 このビデオでは、3匹のラットを仰臥位と腹臥位の両方で拘束する実験者を紹介しています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

電気鍼治療(EA)は、鍼に電気刺激を与える鍼治療の一種である¹¹。この技術では、特定の強度と周波数のマイクロパルス電流を使用して経穴を刺激し、治療効果を高めます³。しかし、EAの治癒メカニズムは限られており^、1,2,3を証明するには広範な基礎研究が必要です。げっ歯類モデルは、基本的なEA研究^8,12,13で一般的に使用されており、ラットおよびマウスでこれらの実験を実施するための迅速かつ効率的な方法を提供することを目指しています。

現在、EAの実験は多くの課題に直面しています。主な課題は、麻酔なしでげっ歯類を効果的に固定することです。動物の安定的な固定化は重要であり、動物実験の結果に大きな影響を与えます。そうでなければ、麻酔をかけた動物の生理学的機能は覚醒した動物の生理学的機能とは異なり、臨床鍼治療は常に覚醒した患者に対して行われます。したがって、覚醒した動物を用いた実験的研究は、臨床目的ではより実用的です。以前は、固定プレートによる固定化が好ましい方法であったが、時間がかかり、単一のげっ歯類¹⁴の操作にしか許可されなかった。また、従来のイモビライザーでは、げっ歯類の手足を縛る必要があり、これは時間のかかる作業であり、きつく締め付けるために痛みが生じることがよくありました。いくつかの研究でマウス用の粘着テープが実装されていますが、マウスが簡単に逃げる能力は、特に鍼治療^{の手順中に}大きな課題をもたらします8。実験対象が多い場合、^{時間と労力を節約する}ためにバッチ操作が必要になることがよくあります2。そこで、従来の固定方法に比べていくつかの利点を提供する3Dプリントされた小動物体バッチ固定装置を開発しました¹⁵:1)固定時間を短縮し、実験効率を大幅に向上させます¹⁶;2)シンプルで使いやすく、主観的な要因の影響を受けません^15,16。3)げっ歯類への害が少ない。4)固定後、複数の若齢ラットに同時にEA操作を行うことができるため、時間を節約し、治療結果を同時に観察することができます。

EAの実験的研究に3Dプリント技術を使用することは、鍼灸研究の分野における貴重な拡張です。この装置は、3Dプリント時に任意のサイズに調整できるため、実験的な鍼治療をより効果的に行うことができます。積層造形方法¹⁰である溶融フィラメント製造(FFF)としても知られる溶融堆積モデリング(FDM^)は、固定具の3Dプリンティングに使用される。この装置は、この実験だけでなく、げっ歯類のCTやMRIなどの実験にも適しています^17,18。さらに、EA研究を除いて、バルク固定が必要なあらゆる状況にも適用できます。3Dプリント技術の普及により、このデバイスは簡単に入手できます。地元の3Dプリントメーカーを通じて作成できます。さらに、この固定装置は、設計図に基づいて変更およびカスタマイズすることができます。本研究では、固定装置は3つのセクションで構成されており、それぞれが1匹のげっ歯類を固定することができる。追加のげっ歯類やその他の動物を含める必要がある場合は、デバイスを比例してスケーリングして、より多くの数を収容できます。例えば、5匹のマウスを固定できる装置として、あるいはウサギなど他の動物の固定装置として設計することもできる。

もう一つの課題は、ヒトに対応するげっ歯類のツボを見つけることです。MS6およびST25経穴は、腹臥位および仰臥位固定の効果を調べるために選択されました。さらに、これら2つのツボは多くの学者によって研究されてきました^6,7,19。MS6は、パーキンソン病、脳卒中後の機能障害などの脳疾患研究で最もよく使用されます^6,13,19。MS6は、以前の研究でIL-12によって媒介されるJAK / STATシグナル伝達経路の調節を介して、虚血性脳卒中に罹患しているラットの神経学的機能を強化する可能性があります¹³。ST25は通常、下痢や過敏性腸症候群(IBS)などの消化管の治療に用いられます^7,12。以前の研究では、ST25ポイントにのみ適用されたEAは、内臓過敏症を緩和すると同時に、IBSラットの正常な徐波周波数と結腸リズムを回復させる可能性を示したことが報告されています¹²。また、この2つのツボは、げっ歯類の仰臥位と腹臥位の影響を適切に示すことができます。また、これら2つのツボは表示^6,7,19の意義を持っています。これらの2つのツボは多くの学者によって研究されているため、げっ歯類でこれら2つのツボを見つける方法に関するプロトコルを提供します。MS6およびST25試験が実施されている動物実験に役立ちます。しかし、今回の研究にはいくつかの限界がある。例えば、針の位置や挿入深さは客観的に測定することはできず、オペレーターの経験レベルによって異なる場合があります。

私たちの実験は、動物倫理の「3R」の原則に準拠しており、陸軍医科大学の実験動物福祉および民族委員会によって承認されています。この実験で最も困難で重要なステップは、げっ歯類を安全に固定するための信頼性が高く効率的な方法を見つけることです。これは、5分間のEA刺激中にげっ歯類を逃がそうとしたり、死んだりすると、実験が失敗するためです。正面の洞窟のデザインは、げっ歯類が穴を掘るのを好むことを利用しています。げっ歯類の頭を洞窟の中に置くのは、心理的な快適さを提供することを目的としています。さらに、げっ歯類の頭と体を固定するために使用されるロープは、げっ歯類の脱出を防ぎ、呼吸困難を防ぐために、過度に緩んだり締めすぎたりしないように、適度に固定する必要があります。電気刺激後、げっ歯類の行動と反応を注意深く観察しました。理想的には、1〜2mAの電流を印加すると、げっ歯類は感電に反応して攻撃的なもがきや発声を示さない²⁰。固定具は、必要に応じて、仰臥位、腹臥位、その他のタイプの固定でげっ歯類を固定するためにも使用できます。さまざまな実験ニーズに適しており、固定操作が簡単に実行できます²¹。しかし、これは、さまざまなサイズの動物がさまざまなサイズの固定装置を必要とするという制限につながっています。わずかな大きさの不一致がある動物だけは、同じ装置を使用して拘束することができます。このプロトコルで使用されるバッチ固定具は、10〜40gの重量範囲内でげっ歯類を効率的かつ確実に固定化します。この体重範囲外の動物には、特定の要件に合わせてカスタマイズされたバッチ固定具が必要です。

さらに、げっ歯類の一括EA操作に使用される3Dプリントされたバッチげっ歯類固定は、げっ歯類の引っかき傷や咬傷に耐性があるため、安全性が向上します。げっ歯類のEAの研究は、ヒトにおけるこの治療法の潜在的な利点に関する貴重な洞察を提供しました1,2,3,6,7,11,14。このデバイスは、EAでの実験的科学研究の促進に役立ちます。この技術により、研究者は動物を固定化する必要がある動物実験を行うことができます。さらに、ST25とMS6の正確な位置を示しており、今後これら2つのツボを研究する人の参考になります。最終的には、この方法論がEA研究のための貴重な動物モデルにつながることが期待されています。

本論文で紹介する3Dプリントバッチマウス固定装置は、ラットやマウスでEA実験を行うための簡便で効率的な方法を提供する。その設計は、動物の快適さと安全性、および迅速かつ効率的な固定の必要性を考慮しています。この装置は、動物実験の時間と労力を節約し、電気鍼灸研究の進歩を促進し、最終的にはさまざまな病気のより良い治療法につながる可能性があります。

執筆者らは、競合する利益相反は存在しないと宣言した。

陸軍医科大学第二附属病院脳神経外科の現場サポートに感謝します。資金提供:この研究は、中国自然科学基金会(82104696)の支援を受けました。