Fabricação de substrato Raman Flexível Surface-Enhanced Raman (SERS) à base de polidimetilsiloxano (PDMS) para detecção ultrassensível

Este protocolo descreve um método de fabricação de um substrato flexível para espalhamento Raman intensificado por superfície. Este método tem sido utilizado na detecção bem sucedida de baixas concentrações de R6G e Thiram.

Este artigo apresenta um método de fabricação de um substrato flexível projetado para espalhamento Raman Intensificado por Superfície (SERS). Nanopartículas de prata (AgNPs) foram sintetizadas através de uma reação de complexação envolvendo nitrato de prata (AgNO₃) e amônia, seguida de redução usando glicose. As AgNPs resultantes exibiram uma distribuição de tamanho uniforme variando de 20 nm a 50 nm. Posteriormente, 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) foi empregado para modificar um substrato de PDMS que havia sido tratado superficialmente com plasma de oxigênio. Esse processo facilitou a automontagem das AgNPs no substrato. Uma avaliação sistemática do impacto de várias condições experimentais no desempenho do substrato levou ao desenvolvimento de um substrato SERS com excelente desempenho e um Enhanced Factor (EF). Utilizando este substrato, foram alcançados impressionantes limites de detecção de 10-10 M para R6G (Rodamina 6G) e ^10-8 M para Thiram. O substrato foi empregado com sucesso na detecção de resíduos de agrotóxicos em maçãs, com resultados altamente satisfatórios. O substrato flexível SERS demonstra grande potencial para aplicações no mundo real, incluindo detecção em cenários complexos.

O espalhamento Raman aprimorado por superfície (SERS), como um tipo de espalhamento Raman, oferece as vantagens de alta sensibilidade e condições de detecção suaves, podendo até mesmo alcançar a detecção de uma única molécula 1,2,3,4. Nanoestruturas metálicas, como ouro e prata, são tipicamente usadas como substratos SERS para permitir a detecção de substâncias ^5,6. O aprimoramento do acoplamento eletromagnético em superfícies nanoestruturadas desempenha um papel significativo em aplicações de SERS. Nanoestruturas metálicas com tamanhos, formas, distâncias interpartículas e composições variadas podem se agregar para criar inúmeros "hotspots" gerando intensos campos eletromagnéticos devido a ressonâncias localizadas de plásmons de superfície ^7,8. Muitos estudos têm desenvolvido nanopartículas metálicas com diferentes morfologias como substratos do SERS, demonstrando sua eficácia na obtenção do realce do SERS ^9,10.

Substratos SERS flexíveis encontram amplas aplicações, com nanoestruturas capazes de produzir efeitos SERS depositados em substratos flexíveis para facilitar a detecção direta em superfícies curvas. Substratos flexíveis SERS são empregados para detectar e coletar analitos em superfícies irregulares, não planas ou curvas. Os substratos flexíveis SERS comuns incluem fibras, filmes poliméricos e filmes de óxido de grafeno^11,12,13,14. Dentre eles, o polidimetilsiloxano (PDMS) é um dos materiais poliméricos mais utilizados e oferece vantagens como alta transparência, alta resistência à tração, estabilidade química, não toxicidade e adesão^15,16,17. O PDMS tem uma baixa seção Raman transversal, tornando seu impacto sobre o sinal Raman insignificante¹⁸. Como o pré-polímero PDMS está na forma líquida, ele pode ser curado por calor ou luz, proporcionando um alto grau de controlabilidade e conveniência. Substratos SERS baseados em PDMS são substratos SERS flexíveis relativamente comuns, tendo sido utilizados em estudos anteriores para incorporar várias nanopartículas metálicas para detecção de diferentes substâncias bioquímicas com desempenho exemplar^19,20.

Na preparação de substratos SERS, a fabricação de estruturas nanogap é crucial. A tecnologia de deposição física oferece vantagens como alta escalabilidade, uniformidade e reprodutibilidade, mas normalmente requer boas condições de vácuo e equipamentos especializados, limitando suas aplicações práticas²¹. Além disso, a fabricação de nanoestruturas em escala de poucos nanômetros permanece desafiadora com as técnicas convencionais de deposição²². Consequentemente, nanopartículas sintetizadas através de métodos químicos podem ser adsorvidas em filmes transparentes flexíveis através de várias interações, facilitando a auto-montagem de estruturas metálicas na nanoescala. Para garantir o sucesso da adsorção, as interações podem ser ajustadas modificando física ou quimicamente a superfície do filme para alterar sua hidrofilicidade superficial²³. As nanopartículas de prata, em comparação com as nanopartículas de ouro, exibem melhor desempenho do SERS, mas sua instabilidade, particularmente sua suscetibilidade à oxidação no ar, resulta em uma rápida diminuição do SERS Enhancement Factor (EF), afetando o desempenho do substrato²⁴. Assim, é essencial desenvolver um método de partículas estáveis.

A presença de resíduos de agrotóxicos tem atraído atenção significativa, criando uma necessidade premente de métodos robustos capazes de detectar e identificar rapidamente várias classes de produtos químicos perigosos em alimentos no campo^25,26. Os substratos flexíveis SERS oferecem vantagens únicas em aplicações práticas, particularmente no domínio da segurança alimentar. Este artigo apresenta um método para preparar um substrato flexível SERS através da ligação de nanopartículas de prata revestidas com glicose sintetizadas (AgNPs) em um substrato PDMS (Figura 1). A presença de glicose protege as AgNPs, atenuando a oxidação da prata no ar. O substrato demonstra excelente desempenho de detecção, capaz de detectar Rodamina 6G (R6G) tão baixa quanto 10-10 M e pesticida Thiram tão baixo quanto ^10-8 M, com boa uniformidade. Além disso, o substrato flexível pode ser empregado para detecção através de colagem e amostragem, com inúmeros cenários potenciais de aplicação.

1. Síntese de nanopartículas

1. Preparação de solução de nitrato de prata
   1. Usando uma balança de pesagem de precisão, meça 0,0017 g de nitrato de prata grau AR, (AgNO₃, ver Tabela de Materiais) e adicione-o a 10 mL de água deionizada (DI). Agite a mistura para criar uma solução de AgNO 3 ^10-3 mol/L.
2. Preparação do complexo prata-amônia
   1. Tomar 1 mL de água de amônia grau AR (NH₃. H₂O, ver Tabela de Materiais) usando uma seringa, e adicioná-la gota a gota na solução de nitrato de prata enquanto agita. Pare a adição gota a gota quando a solução ficar clara.
3. Preparo da solução de glicose
   1. Usando uma balança de pesagem precisa, meça 0,36 g de pó de glicose grau AR, (ver Tabela de Materiais) e adicione-o a 10 mL de água DI. Mexa bem a mistura para criar uma solução de glicose 0,2 M.
4. Síntese de nanopartículas de prata (AgNPs)
   1. Utilizar uma pistola de pipetas para adicionar 30 μL do complexo prata-amoníaco (preparado no passo 1.2) à solução de glicose (preparada no passo 1.3) a intervalos de 30 minutos. Repita este processo 4-6 vezes enquanto mexe até que a solução fique amarela.

2. Preparação de substratos flexíveis

1. Preparação do substrato PDMS
   1. Para sintetizar o substrato PDMS, pegue aproximadamente 5 g de solução de PDMS A e adicione solução B (de um kit disponível comercialmente, consulte Tabela de Materiais) na proporção de 1:10.
   2. Mexa e misture bem as soluções PDMS A e B.
   3. Transfira o PDMS misturado para um prato quadrado e leve ao forno a 80 °C por 2 h.
   4. Após a cura pelo processo acima, use um bisturi para cortar o PDMS ao longo da grade escura da placa de Petri, criando pequenos cubos de PDMS com dimensões de aproximadamente 1 cm x 1 cm.
2. Modificação de superfície
   1. Submeter as pequenas peças de PDMS acima mencionadas ao tratamento com plasma. Use um processador de plasma portátil (consulte a Tabela de Materiais) e mova-o para frente e para trás aproximadamente 5-10 cm acima da superfície do PDMS para realizar o tratamento de plasma de superfície.
   2. Utilizar o processador de plasma para modificar a superfície, induzindo a formação de grupos hidroxila na superfície do PDMS, tornando-a hidrofílica²⁷.
3. Modificação com APTES
   1. Preparar uma solução APTES a 10% (ver Tabela de Materiais).
   2. Imergir o PDMS modificado superficialmente obtido na etapa 2.2 na solução APTES e deixá-lo descansar por 10 h. Isso permite que o APTES se ligue aos grupos hidroxila na superfície do PDMS.
4. Automontagem de AgNPs
   1. Imergir o substrato PDMS obtido na etapa 2.3 na solução de AgNPs sintetizada na etapa 1.4 por 10 h. Isso auto-monta as AgNPs no substrato PDMS, criando o substrato final flexível de detecção de SERS.

Neste estudo, um substrato flexível SERS composto por AgNPs sintéticas envoltas em glicose e auto-montadas em PDMS usando APTES foi desenvolvido, alcançando excelente desempenho de detecção para aplicações práticas de detecção de pesticidas. Os limites de detecção para R6G e Thiram foram atingidos em 10-10 M e ^10-8 M, respectivamente, com um Enhancement Factor (EF) de 1 x ^{10 5}. Além disso, o substrato demonstrou uniformidade.

As AgNPs envoltas em glicose foram sintetizadas pelo método de Tollens aprimorado^28,29. Este conjunto de AgNPs não só gerou um forte sinal SERS mas também protegeu efetivamente a prata nos AgNPs da oxidação, preservando o desempenho de detecção. A partir das imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura Ambiental (MEES) da Figura 2, as partículas sintetizadas mostraram-se relativamente uniformes, com a maioria apresentando diâmetros entre 40-50 nm. A camada externa das AgNPs foi envolta por uma camada de glicose. Essa estrutura forneceu uma camada dielétrica para a camada externa das AgNPs e protegeu as partículas de prata da oxidação após a exposição ao ar, preservando o desempenho do SERS.

É evidente que um forte campo elétrico aumentado se forma entre as lacunas das AgNPs, servindo como a causa primária do sinal SERS. Portanto, o substrato é densamente imobilizado com AgNPs em substratos flexíveis para obter melhor desempenho (Figura 3). O substrato flexível SERS auto-montado desenvolvido neste estudo é simples, de alta qualidade e livre de substâncias tóxicas ou nocivas, tornando-o ecologicamente correto.

O substrato flexível SERS preparado neste estudo apresentou excelente desempenho de detecção. Para avaliar um substrato SERS, o aspecto crítico é sua capacidade de detecção. Aqui, o Enhancement Factor (EF) foi definido para avaliar o desempenho de realce do substrato, e R6G (ver Tabela de Materiais) foi usado para determinar o limite de detecção. A FE foi descrita por³⁰:

EF = (I SERS / I_Raman) × (N_Raman / N_SERS)

As posições de pico³¹ do R6G e seus valores correspondentes são apresentados na Tabela 1.

Neste estudo, o espectro Raman foi obtido utilizando-se um laser de 633 nm com objetivas de 10x e 50x. O tempo de integração foi fixado em 10 s para aquisição do espectro durante a medição, com a potência do laser incidente em 3,7 mW. Ao adicionar 30 μL de soluções R6G com concentrações variáveis no substrato e observar o sinal Raman através de detecção direta, a Figura 4 ilustra que o substrato exibiu excelente capacidade de detecção, atingindo um limite de detecção de 10-10 M para R6G, indicativo de forte desempenho de detecção. Posteriormente, usando ^10-5 M R6G como sonda de teste, o Enhancement Factor (EF) do substrato foi calculado como sendo 1 x 10 5 (o processo de cálculo está detalhado no Arquivo Suplementar 1), demonstrando um notável efeito de realce (Figura 5).

O substrato flexível SERS possibilitou a detecção de agrotóxicos. O thiram, pesticida ditiocarbamato (DTC) amplamente utilizado no cultivo de frutas e hortaliças, tem como objetivo controlar doenças fúngicas e prevenir a deterioração durante o armazenamento e transporte³². No entanto, a exposição repetida ou ingestão de resíduos de Thiram pode resultar em problemas de saúde como letargia, perda de tônus muscular e malformações fetais graves^33,34. Portanto, alcançar a detecção de Thiram em nível de traço nas superfícies de frutas e vegetais é crucial. Os picos Raman³⁵ de Thiram e suas causas estão descritas na Tabela 2.

Várias concentrações de Thiram foram aplicadas ao substrato flexível para avaliar seu desempenho de detecção. A Figura 6 demonstra que, para a detecção de Thiram, seus três picos característicos primários são claros, e o limite de detecção é atingido em ^10-8 M.

O substrato flexível permitiu detecções práticas. No dia a dia, resíduos de agrotóxicos às vezes persistem nas superfícies das frutas. O consumo de frutas não lavadas pode oferecer riscos à saúde. Neste estudo, o substrato flexível SERS foi aplicado pelo método "paste and peel-off", fixando-se o substrato à superfície de uma maçã e, em seguida, retirando-o para inspeção.

A Figura 7 ilustra que, sob esse método, a detecção de ^10-7 M Thiram foi obtida, com linhas espectrais relativamente claras. Assim, o substrato flexível SERS preparado pode facilitar o método de detecção de "pasta e casca", identificando efetivamente resíduos de pesticidas na superfície dos frutos e oferecendo valiosas aplicações práticas.

O substrato flexível SERS apresentado neste estudo não só exibiu notável desempenho de detecção, mas também ofereceu cenários práticos de aplicação.

Figura 1: Projeto esquemático do substrato flexível SERS do PDMS. Ilustração descrevendo o planejamento do substrato flexível PDMS (Polydimethylsiloxane) usado para experimentos de espalhamento Raman Surface-Enhanced (SERS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem ESEM das AgNPs sintetizadas. Imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura Ambiental (ESEM) mostrando as AgNPs (nanopartículas de prata) sintetizadas. A barra de escala na imagem é de 2 μm, e o diâmetro das AgNPs varia de aproximadamente 20 nm a 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Simulação de AgNPs. Simulação mostrando AgNPs (nanopartículas de prata) com significativo aumento de campo localizado ocorrendo no intervalo entre as partículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Sinais SERS de diferentes concentrações de R6G. Sinais de espalhamento Raman aprimorados por superfície (SERS) obtidos para várias concentrações de R6G (Rodamina 6G). As posições de pico na figura alinham-se com as da Tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Sinais SERS de R6G no substrato flexível. Sinais de espalhamento Raman aprimorados por superfície (SERS) de R6G (Rodamina 6G) coletados de 10 pontos aleatórios no substrato flexível para demonstrar uniformidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Sinais SERS de diferentes concentrações de Thiram. Sinais de espalhamento Raman aprimorados por superfície (SERS) obtidos para várias concentrações de Thiram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Sinais SERS de Thiram na superfície do fruto. Sinais de espalhamento Raman aprimorados por superfície (SERS) de Thiram obtidos da superfície de uma maçã usando o método "pasta e descascamento". O limite de detecção atingiu ^10-7 M de Thiram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Deslocamento Raman e atribuição do modo de frequência no espectro R6G SERS. Tabela listando valores de deslocamento Raman e suas atribuições de modo de frequência correspondentes no espectro SERS (Surface-Enhanced Raman Scattering) de R6G (Rhodamine 6G).

Tabela 2: Deslocamento Raman e atribuição do modo de frequência no espectro Thiram SERS. Tabela listando valores de deslocamento Raman e suas atribuições de modo de frequência correspondentes no espectro SERS (Surface-Enhanced Raman Scattering) de Thiram.

Arquivo Suplementar 1: Cálculo do Fator de Aprimoramento (ER). Clique aqui para baixar este arquivo.

Neste estudo, foi introduzido um substrato SERS flexível, que ligou AgNPs ao PDMS através de modificação química e obteve excelente desempenho. Durante a síntese de partículas, especificamente na síntese do complexo amônia de prata (etapa 1.2), a cor da solução desempenha um papel crucial. A adição de muita água de amônia em gotas pode afetar adversamente a qualidade da síntese de AgNPs, potencialmente levando a resultados de detecção malsucedidos. Deve-se atentar para a modificação do substrato (etapa 2.2) durante o processo de síntese; caso contrário, os AgNPs podem não se ligar adequadamente ao PDMS, resultando em desempenho de detecção enfraquecido.

Em preparações práticas, o desempenho de detecção do substrato SERS pode apresentar instabilidade²². Isso pode ser otimizado alterando o solvente da substância. Por exemplo, o uso de acetonitrila como solvente para Thiram produz melhores resultados do que o uso de etanol. Além disso, a qualidade do Thiram pode afetar o sinal SERS detectado, enfatizando a importância de garantir que os reagentes utilizados estejam dentro de seus prazos de validade durante a detecção.

Comparado a outros^{estudos36,37,38,} o método de detecção do substrato flexível SERS proposto neste estudo é simples. As AgNPs podem ser facilmente sintetizadas através de um método simples, evitando a necessidade de condições e ambientes experimentais complexos, bem como processos de fabricação intrincados. O substrato é ecologicamente correto e não introduz poluentes nocivos. No entanto, deve-se notar que, devido à camada de glicose ao redor das AgNPs, ela pode enfraquecer o efeito de realce das partículas de prata, sugerindo que é necessário melhorar ainda mais o Fator de Realce (FE) do substrato SERS. O substrato flexível SERS, preparado usando o método neste estudo, também requer maior exploração na detecção de biomoléculas.

O substrato flexível SERS proposto neste estudo demonstra aplicabilidade em cenários reais, enriquecendo os métodos de detecção de resíduos de agrotóxicos e trazendo implicações significativas. Além disso, em aplicações futuras, o substrato flexível SERS tem grande potencial para aplicações biomédicas.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

A pesquisa é apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 61974004 e 61931018), bem como pelo National Key R&D Program of China (Grant No. 2021YFB3200100). O estudo reconhece o Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Pequim por fornecer acesso a microscópios eletrônicos. Além disso, a pesquisa se estende graças a Ying Cui e à Escola de Ciências da Terra e do Espaço da Universidade de Pequim por sua assistência nas medições Raman.