Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
Apresentamos aqui um protocolo para o uso de nanopartículas de prata para melhorar efetivamente os sintomas agudos de camundongos com osteoartrite induzida por colagenase tipo II, incluindo inflamação sinovial, hiperplasia sinovial, hiperplasia vascular, etc.
A osteoartrite do joelho (KOA) é uma das doenças degenerativas das articulações mais comumente encontradas em pessoas com mais de 45 anos de idade. Atualmente, não há nenhuma terapêutica eficaz para OA de joelho, e a única estratégia de desfecho é a artroplastia total do joelho (ATJ); portanto, a KOA está associada a encargos econômicos e custos sociais. A resposta imune inflamatória está envolvida na ocorrência e desenvolvimento de KOA. Nós previamente estabelecemos um modelo de camundongo de KOA usando colágeno tipo II. Hiperplasia do tecido sinovial estava presente no modelo, ao lado de um grande número de células inflamatórias infiltradas. As nanopartículas de prata têm efeitos anti-inflamatórios substanciais e têm sido amplamente utilizadas na terapia tumoral e na liberação cirúrgica de fármacos. Portanto, avaliamos os efeitos terapêuticos das nanopartículas de prata em um modelo de KOA induzido por colagenase II. Os resultados experimentais mostraram que as nanopartículas de prata reduziram significativamente a hiperplasia sinovial e a infiltração de neutrófilos no tecido sinovial. Assim, este trabalho demonstra a identificação de uma nova estratégia para AT e fornece uma base teórica para prevenir o progresso de OA.
A osteoartrite do joelho (OA) é uma das formas mais frequentes de osteoartrite e envolve um complexo processo patológico em toda a articulaçãosinovial1. À medida que a população mundial está envelhecendo gradualmente, a incidência de OA está aumentando substancialmente. A dor consistente na articulação do joelho geralmente leva os pacientes com OA a procurar tratamento médico. A etiologia da dor na OA pode estar relacionada à resposta inflamatória, hiperplasia sinovial e degeneração da cartilagem2. Os tecidos da sinóvia são compostos por dois tipos de células: fibroblastos sinoviais e macrófagos 3,4,5. Os fibroblastos sinoviais produzem líquido sinovial. Os macrófagos sinoviais são normalmente dormentes e ativados pela resposta inflamatória. A inflamação inicial da sinóvia causa dor articular no joelho6.
A resposta imune inflamatória tecidual da sinóvia desempenha um papel crucial na patogênese da OA. Estudos prévios confirmaram que há respostas inflamatórias nos tecidos da sinóvia na OA de joelho, conhecida como sinovite, e que o grau de sinovite da OA está intimamente relacionado à infiltração de células inflamatórias dos tecidos sinóvios 7,8,9. A sinovite é uma reação inflamatória da sinóvia, e suas características patológicas são a proliferação de células sinoviais, a formação de novos vasos e a infiltração de células inflamatórias5,10,11.
O objetivo do tratamento com OA é aliviar a reação inflamatória da sinóvia e retardar a progressão da doença. Atualmente, as principais drogas clínicas para o tratamento da OA são os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs); entretanto, apresentam efeitos colaterais significativos, como nefrotoxicidade12,13. Injeções intra-articulares de glicocorticoides são outra opção para o tratamento de OA hospitalar; no entanto, o glicocorticoide se espalha rapidamente e pode ser rapidamente metabolizado pelo derrame articular. Enquanto isso, pacientes diabéticos com hiperglicemia subjacente devem ser cautelosos quanto às injeções contínuas de esteroides14. Em resumo, não há estratégia terapêutica medicamentosa disponível para OA de joelho. Portanto, a exploração de novas drogas para o tratamento de OA é extremamente urgente.
O tamanho das nanopartículas de prata é inferior a 100 nm. Devido aos seus proeminentes efeitos anti-inflamatórios, antibacterianos e antioxidantes, têm sido amplamente utilizados em vários aspectos da saúde e da medicina, como cicatrização de feridas e queimaduras 15,16. Também são utilizados na liberação de fármacos direcionados, exames de imagem e diagnóstico molecular17. A prata (Ag) tem maior ação anti-inflamatória e antibacteriana do que outras nanopartículas metálicas, como cobre (), zinco (Zn) e ferro (Fe)15. As nanopartículas de prata, um novo tipo de nanomaterial, têm propriedades antimicrobianas potentes e de amplo espectro. Um estudo anterior verificou que, em modelos de queimaduras e peritonites18,19, as nanopartículas de prata poderiam efetivamente inibir a produção de fatores inflamatórios e promover a cicatrização de feridas. Estudo anterior também demonstrou que nanopartículas de prata melhoraram a cicatrização de feridas diabéticas por promoverem a síntese de fatores de crescimento e deposição de colágeno20.
Com base nos efeitos anti-inflamatórios das nanopartículas de prata, nosso objetivo foi usar nanopartículas de prata para tratar KOA induzido por colágeno tipo II em camundongos. Os resultados sugeriram que o número de células de infiltração inflamatória da articulação sinovial em camundongos foi significativamente reduzido com este tratamento. Os resultados também sugeriram que as nanopartículas de prata poderiam aliviar significativamente os sintomas de KOA em camundongos. Portanto, a aplicação de nanopartículas de prata pode subsidiar o desenvolvimento de novas opções de tratamento para OA clínica.
Todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal (AEWC) do Guangzhou Forevergen Medical Laboratory Animal Center (2018-0186).
1. Estabelecimento do modelo de mouse KOA
2. Síntese de nanopartículas de prata
NOTA: A preparação de nanopartículas de prata foi descrita anteriormente em detalhes19. Todo o processo de formulação é realizado em gelo. Após a preparação, a mistura é armazenada a 4 °C; caso contrário, a mistura solidifica-se facilmente à temperatura ambiente.
3. Tratamento com nanopartículas de prata em camundongos KOA induzidos por colagenase tipo II
4. Coleta da articulação do joelho e tecido sinovial
5. Coloração hematoxilina-eosina
6. Safranin O/Verde Rápido
7. Coloração imunoistoquímica (IHQ)
O modelo de camundongo KOA foi induzido usando colagenase tipo II. A partir de 1 semana após a indução do modelo, a mistura preparada de colágeno de nanopartículas de prata foi injetada na cavidade articular uma vez por semana durante 4 semanas (Figura 1). Os pesos dos camundongos em cada grupo foram observados e registrados diariamente. Os resultados mostraram que o peso corporal médio dos camundongos KOA foi significativamente menor do que o dos camundongos do grupo controle normal. Entretanto, o peso corporal médio dos camundongos do grupo colagenase tipo II + AgNPs foi maior em relação aos camundongos KOA, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significativa (Figura 2). Após 30 dias, os tecidos sinoviais das articulações do joelho foram coletados dos camundongos e submetidos ao exame anatomopatológico. Foram analisados a hiperplasia, proliferação vascular, infiltrado inflamatório da sinóvia e dano cartilaginoso 5,10,11. Os resultados mostraram que a espessura sinovial dos camundongos do grupo OA foi significativamente maior em comparação com o grupo controle normal. No grupo tratado com a mistura de colágeno nanoparticulado de prata, a espessura da membrana sinovial foi reduzida em relação ao grupo KOA (Figura 3). Houve hiperplasia vascular na sinóvia dos camundongos KOA em relação ao grupo controle normal, e a hiperplasia vascular foi significativamente reduzida na sinóvia dos camundongos tratados com a mistura de colágeno nanoparticulado de prata (Figura 4). Os resultados da coloração Safranina-O mostraram que a matriz cartilaginosa dos camundongos KOA foi destruída, enquanto os camundongos tratados com a mistura de colágeno nanoparticulado de prata apresentaram uma matriz cartilaginosa significativamente melhor (Figura 5). Os escores de características morfológicas em cada grupo foram avaliados conforme descrito anteriormente22. Os resultados foram 0 ± 0 para o grupo salina, 7 ± 0,63 para o grupo colágeno tipo II e 4,2 ± 1,17 para o grupo colagenase tipo II + AgNPs (Figura 6). CD177 é um importante marcador neutrofílico25. CD177 é expresso em 40%-60% dos neutrófilos em condições normais. No entanto, a expressão de CD177 em neutrófilos aumenta significativamente durante a inflamação aguda. Os resultados da coloração por IHQ demonstraram que os neutrófilos infiltrados na região sinovial foram significativamente reduzidos no grupo tratado com AgNPs em comparação com o grupo KOA (Figura 7), o que sugere que o tratamento com AgNPs poderia melhorar os sintomas de OA de joelho.
Figura 1: Local de injeção. (A) Imagens representativas da injeção de colagenase tipo II. (B) Imagens representativas após a injeção de colagenase tipo II. (C) Imagens representativas da injeção da mistura de colágeno nanoparticulado de prata no modelo de camundongo KOA. (D) Imagens representativas após a injeção da mistura de colágeno de nanopartículas de prata em camundongos modelo KOA. A linha pontilhada vermelha representa a linha paralela aos ligamentos do joelho do rato. A seta preta representa o ângulo entre a agulha da seringa de insulina e a pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações do peso corporal dos camundongos em cada grupo. Este painel mostra o peso médio dos camundongos em cada grupo em diferentes pontos de tempo; o eixo x indica o número de dias após a injeção da colagenase tipo II e o eixo y indica a mudança de dobra no peso corporal. Grupo salina (n = 7), grupo colagenase tipo II (n = 5), grupo colagenase tipo II + AgNPs (n = 5). *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coloração hematoxilina-eosina (H&E) representando hiperplasia sinovial. Os tecidos sinoviais de cada grupo de camundongos foram coletados, fixados, seccionados e corados com H&E aos 30 dias após a cirurgia. As setas duplas representam a espessura sinovial detectada. Barra de escala = 0,1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem representativa da hiperplasia vascular perissinovial. As setas indicam os vasos. Barra de escala = 0,05 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coloração de safranina O da articulação do joelho em cada grupo de camundongos. Barra de escala = 0,2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Escores das características morfológicas em cada grupo. O tecido sinovial foi utilizado para medir o escore de características morfológicas dos camundongos de cada grupo. Cinco cortes teciduais em cada grupo foram selecionados para analisar o grau de hiperplasia/alargamento da camada celular de revestimento sinovial, o grau de infiltração neutrofílica no tecido sinovial e o grau de ativação do estroma sinovial (Tabela 1). O valor médio foi utilizado como escore final. **p < 0,01 e ***p < 0,001 com um teste t de Student para cada coorte em comparação com o grupo KOA não tratado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Coloração imunoistoquímica para um marcador neutrofílico no tecido sinovial em cada grupo de camundongos. A coloração imunoistoquímica foi utilizada para detectar a expressão do marcador neutrófilo CD177 no tecido sinovial dos camundongos de cada grupo. As setas indicam neutrófilos. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Características morfológicas de pontuação. Clique aqui para baixar esta tabela.
As nanopartículas de prata exibem efeitos anti-inflamatórios, antibacterianos, antioxidantes e imunomoduladores, o que significa que poderiam proteger células e tecidos de danos, reduzindo a produção de espécies reativas de oxigênio26. Alguns pesquisadores estão preocupados com a toxicidade das nanopartículas de prata27. A toxicidade das nanopartículas de prata está diretamente relacionada à presença de íons de prata livre. Devido ao tamanho nanométrico das nanopartículas de prata, elas poderiam facilmente interferir em biomoléculas, células e órgãos humanos 15,28,29. Vários estudos têm relatado que nanopartículas de prata podem induzir estresse oxidativo e prejudicar a função mitocondrial em células humanas30. Além disso, o Ag pode ser detectado em órgãos humanos, especialmente no fígado e baço, após o uso de grandes quantidades de nanopartículas de prata. Pesquisadores também relataram que nanopartículas de prata têm a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica via transporte transsináptico e se acumular no cérebro31. Um relato sistemático da biotoxicidade das nanopartículas de prata não foi realizado, embora alguns pesquisadores reconheçam a segurança das nanopartículas de prata32.
Neste estudo, preparamos uma mistura de colágeno nanoparticulado de prata. De fato, o período de duração das nanopartículas de prata em tecidos humanos é breve, mas o período de duração das nanopartículas de prata pode ser prolongado quando aplicado com uma mistura de colágeno; Isso não só reduz o trauma, mas também a dose das drogas. Considerando a toxicidade das nanopartículas de prata, a dose de nanopartículas de prata aplicada neste estudo foi de 30 mg/kg, em consonância com pesquisas anteriores33.
Algumas considerações vitais da operação experimental são as seguintes. A colagenase tipo II deve ser armazenada a -20 °C após a preparação para evitar a degradação devido à clivagem enzimática. A preparação da mistura de colágeno de nanopartículas de prata deve ser realizada no gelo continuamente à temperatura ambiente, porque a mistura de colágeno de nanopartículas de prata torna-se um gel semissólido rapidamente e, em seguida, não pode ser usada para injeção. A solução deve ser conservada a 4 °C após a preparação. Uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha menor deve ser escolhida para administração intra-articular, o que poderia efetivamente evitar o vazamento dos medicamentos injetáveis. A agulha deve ser inserida em um ângulo de 15° para injetar a mistura de colágeno de nanopartículas de prata. Quando a agulha não é resistente, isso indica que a agulha atingiu a cavidade articular do joelho. Após a injeção, o ângulo da injeção deve ser alterado e a agulha deve ser retirada lentamente para evitar vazamento do medicamento injetado.
Neste estudo, as nanopartículas de prata efetivamente melhoraram os sintomas de KOA induzida pela colagenase tipo II em camundongos, demonstrando o efeito anti-inflamatório das nanopartículas de prata. Vários estudos têm relatado a presença de apoptose em células incubadas in vitro com nanopartículas de prata 34,35,36. A redução da hiperplasia sinovial pode ter sido causada pelas nanopartículas de prata devido ao seu envolvimento no comprometimento da função mitocondrial, ou esses desfechos podem ter sido mediados por espécies reativas de oxigênio. Hiperplasia vascular foi observada na sinóvia de camundongos do grupo modelo KOA. Foi possível que as quimiocinas tenham levado os neutrófilos dos vasos sanguíneos para o tecido sinovial durante esse processo e que a explosão da inflamação fez com que as células consumissem mais oxigênio, levando à hiperplasia vascular. Assim, novos experimentos são necessários para comprovar a confiabilidade dessa hipótese. Este estudo fornece benefícios teóricos para a pesquisa no tratamento clínico da OA clínica. Em estudos futuros, pretendemos combinar o método do ligamento cruzado anterior (LCA) com o método do modelo de KOA quimicamente induzido para observar o efeito das nanopartículas de prata. Os resultados experimentais mostram que as nanopartículas de prata podem diminuir significativamente a infiltração de células inflamatórias na sinóvia em camundongos KOA, mas os mecanismos desse efeito ainda necessitam de mais estudos, o que pode desvendar a patogênese da KOA.
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (Número: 2019A1515010209) e pelo Projeto de Ciência e Tecnologia da Cidade de Guangzhou, China (Número: 202102010164).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL insulin syringe | BD | 305932 | None |
CD177 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | PA5-98759 | None |
Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 302-17-0 | None |
DAB | MCE | HY-15912 | None |
Eosin | Beyotime Biotechnology | C0109 | None |
Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | None |
Hematoxylin | Beyotime Biotechnology | C0107 | None |
Light Microscopy | Leica | DM500 | None |
Silver nanoparticle | Wolcacvi | S-10-20 | Store product in the dark at 4°C |
Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | 90-15-3 | None |
Type II collagen | Sigma-Aldrich | C6885-500mg | None |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados