Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Descrito aqui é um método simples para isolar e o grupo de camundongos fenótipo 1 células linfoides inatas uterinas (g1 uILCs) do útero gestante individual por citometria de fluxo. O protocolo descreve como configurar o acasalamento de tempo para obter múltiplas barragens síncronas, a digestão mecânica e enzimática do útero gestante, a coloração de suspensões unicelulares e uma estratégia FACS para fenótipo e discriminar g1 uILCs. Embora este método inevitavelmente perca as informações espaciais da distribuição celular dentro do tecido, o protocolo tem sido aplicado com sucesso para determinar a heterogeneidade do IILC, sua resposta a fatores maternos e fetais que afetam a gravidez, seu perfil de expressão genética e suas funções.

Descrito aqui é um método simples para obter um alto rendimento de linfócitos inatos uterinos do útero gestante individual. Este método preserva a expressão e funcionalidade da superfície proteica de linfócitos inatos uterinos e é adequado para aplicações subsequentes como fenotipagem FACS, RNAseq, proteômica ou ensaios funcionais. Aqui, o foco é o fenotipamento dos uILCs do grupo 1 por citometria de fluxo.

O útero é composto de três camadas: o endométrio, o miomerium e o perimétrio (Figura 1). O endométrio é a mucosa, forrando o lúmen do útero. A progesterona, produzida pelo corpus luteum, converte o endométrio em decidua. O miométrio é composto de duas camadas de músculo liso que compõem a parede uterina. O perimétrio é o serosa que envolve o útero e o conecta ao peritônio através do ligamento largo chamado mesometrium. Em uma seção transversal do útero, a parte oposta ao lúmen é chamada de lado mesometrial, enquanto a parte próxima ao lúmen é chamada de lado anti-mesometrial. Uma variedade de leucócitos maternos povoam o endométrio e o decidua, incluindo vários tipos de células, onde as células imunes inatas representam a grande maioria das células. Linfoides inatas (ILCs), macrófagos, células dendríticas (DC), bem como linfócitos T CD4⁺ e CD8⁺, células T regulatórias (Tregs) e células B raras, podem desempenhar papéis importantes na regulação do ambiente uterino ao longo da ^gravidez1,2. ILCs no útero são encontrados não só na mucosa, mas também no miométrio em camundongos. Incluindo todos os três grupos de ILCs, o útero é de fato o órgão mais densamente povoado pelos ILCs do grupo 1. Com a transformação estrutural dos tecidos uterinos ao longo da gestação, o número e a proporção de leucócitos uterinos também mudam (ver Figura 2A para um exemplo de variações no percentual dos subconjuntos do grupo 1 uILC)^3,4.

Quando os camundongos são referidos neste artigo, a cepa C57BL/6 de ratos de laboratório de raça é destinada. Camundongos de raça outbr (por exemplo, camundongos NMRI) são frequentemente usados em pesquisas reprodutivas devido à sua alta taxa reprodutiva. No entanto, o uso de cepas de raça é necessário para gerar resultados consistentes, e o fundo genético favorito do imunologista é C57BL/6, também conhecido como B6.

Aproximadamente 30% dos leucócitos uterinos nas barragens B6 na gestação média são g1 uILCs, que são definidas pela citometria de fluxo como células viável CD45⁺CD3-CD19-NK1.1⁺NKp46⁺ (Figura 2B): NK (trNK) residente em tecido pro-angiogênico, IFN-g produzindo NK convencional (cNK) e uILC14,5. A porcentagem de células uNK é ainda maior em humanos, atingindo cerca de 70% no primeiro ^trimestre6. Há mais semelhanças do que diferenças entre humanos e mouse uNK e ^uILC7,8. Embora seja importante ter as diferenças em mente, é útil integrar informações disponíveis sobre as duas espécies. Quando se combina informações obtidas da investigação do ILC em humanos e roedores de laboratório, é claro que as células NK auxiliam em mudanças homeosstáticas essenciais para a biologia do útero, incluindo manutenção da integridade ^arterial9 e remodelação da artéria ^espiral10, bem como invasão de trophoblast11,12. Eles também desempenham papéis específicos na defesa contra patógenos13,14. Em camundongos e ratos, além de preencher a decidua em torno do local de implantação, as células NK se acumulam entre as duas camadas musculares do miométrio das barragens em uma estrutura transitória conhecida como Agregado Linfoide Mesometrial da gravidez (MLAp)¹⁵ (Figura 1B), também conhecida no passado como a glândula metrial, função da qual ainda está para ser descoberta.

Descrito aqui é um protocolo detalhado do método utilizado em laboratório para isolar linfócitos do útero de camundongos gestantes usando uma combinação de desagregação mecânica e digestão enzimática. Como todo o útero é usado no método, linfócitos isolados do útero durante a gestação são uma mistura de células deciduais e miometriais. Mais dissecção da decidua da parede uterina e seu MLAp é possível, e foi descrita antes ^de16. O método descrito aqui foi desenvolvido para obter linfócitos uterinos, preservando a expressão da superfície proteica, funcionalidade celular e viabilidade. O resultado é uma suspensão de célula única com detritos celulares residuais mínimos e um rendimento tipicamente variando de 1 a 5 milhões de células na gestação média (10,5 dias) para um útero grávida. As aplicações deste método abrangem fenotítipo por citometria de fluxo, classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos subsequentes, estudos funcionais como produção de citocinas intracelulares, desgranulação, ELISPOT ou ensaios citotóxicos. O protocolo aqui apresentado se concentra na identificação de ILCs do grupo 1, mas pode ser adaptado para outros tipos de células, como outros ILCs, células T, células B, DC ou macrófagos com pequenas modificações do painel de anticorpos usado para análise FACS. O protocolo também pode ser usado para isolar células de outros tecidos e para uteri não-grávidas.

Todos os experimentos em animais descritos neste artigo foram conduzidos de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 sob PP2363781 emitida pelo Ministério do Interior do Reino Unido. O protocolo abaixo consiste em várias seções a partir da criação de camundongos e acabamento com coloração para análise FACS. A Figura 3 reflete os principais passos do protocolo. Os materiais utilizados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Pecuária geral de ratos, acasalamento e dissecção

1. Mantenha camundongos fêmeas de 7 a 14 semanas sob condições específicas sem patógenos (SPF) e agrupados (tipicamente 4-6 fêmeas de acordo com o tamanho da gaiola e peso animal), por 10-14 dias para desencadear o efeito Lee-Boot, que resulta em sincronização estrus17.
2. Mantenha os machos de garanhão em condições de FPS, sozinhos, e descansado por pelo menos 48 h entre cada acasalamento (tempo para regeneração de esperma). É preferível usar machos experientes de 3 a 4 meses de idade, pois eles são tipicamente mais performáticos do que os jovens.
3. Para aumentar a probabilidade de as fêmeas engravidarem, introduza a roupa de cama suja da gaiola masculina na gaiola feminina 3 dias antes do acasalamento. Isso desencadeia o efeito ^Whitten18 por exposição a feromônios de urina masculino, e resulta em estrus sincronizados, bem como maior receptividade para acasalamento.
4. No dia 0 (D0), configure os ratos para acasalamento usando um macho de garanhão por duas fêmeas; considerar uma taxa de plug de aproximadamente 20%-25%.
   NOTA: O acasalamento provavelmente ocorrerá à noite, já que os ratos são animais noturnos.
5. Pela manhã seguinte ao acasalamento (D0.5), verifique a presença de um plugue vaginal, que é um indicador de cópula (Figura 4). O plugue vaginal é um agregado da ejaculação masculina e normalmente persiste por até 8-24 h após o acasalamento. Verifique os plugues de manhã cedo.
6. Consolide as fêmeas plugadas em uma nova gaiola e as destine. Devolva os machos para suas gaiolas para descansar.
7. Em D9.5 ou 10,5 após o acasalamento, prepare tubos de 5 mL com HBSS 1x estéreis de 1 mL (com ^Mg2+ e ^Ca2+) para coleta de tecidos e coloque-os no gelo.
8. Prossiga para a eutanásia animal por deslocamento cervical, seguido de exsanguinação para confirmar a morte.
9. Trabalhe em um ambiente estéril se a aplicação a jusante exigir fazê-lo. Logo após a eutanásia, limpe o corpo do rato com 70% de etanol e prossiga para dissecção sob um gabinete de fluxo laminar com instrumentos estéreis.
10. Dissecar o útero gestante livre de gordura mesometrial (Figura 5) e colocar todo o útero em um tubo preparado e devidamente rotulado de 5 mL. Mantenha os tubos no gelo.

2. Digestão mecânica e enzimática do útero

1. Para preparar a solução de digestão enzimática, misture 3 mL por útero de HBSS estéril 1x com 30 μg/mL de DNAse e 0,1 unidade Wünsch (WU)/mL de Liberase DH ou 0,52 WU/mL de Liberase TM. Coloque a solução em um banho de água a 37 °C.
   NOTA: Pode-se utilizar o DH Liberase TM e a Liberase DH. A escolha de um sobre o outro deve ser guiada pelo seu potencial efeito sobre os epítopos reconhecidos por anticorpos utilizados para análise subsequente da citometria de fluxo.
   ATENÇÃO: Se usar enzimas liofilizadas, trabalhe sob o capô.
2. Prepare 20 mL de 5 mM EDTA em PBS (sem ^Ca2+/^Mg2+). Coloque metade da solução a 37 °C em um banho de água e a outra metade no gelo.
3. Sob um armário de fluxo laminar, remova suavemente a gordura ao redor do útero grávida com instrumentos estéreis em uma placa de Petri estéril. Não deixe o tecido secar.
4. Disseque cada local de implantação com instrumentos estéreis para remover os fetos (estrutura translucida em forma de cavalo marinho, cerca de 1 mm de comprimento) (Figura 6A). Descarte os fetos.
5. Devolva o útero à sua coleção original de tubo de 5 mL e pique o tecido usando tesouras diretamente no tubo de 5 mL e meio de coleta. Mantenha os tubos no gelo o tempo todo entre os procedimentos.
6. Coloque os tubos de 5 mL contendo o tecido picado em um banho de água a 37 °C.
7. Adicione 3 mL de mistura de digestão enzimática quente a cada amostra de modo que o volume total de líquido no tubo seja de 4 mL (1 mL de meio de coleta com o útero picado e 3 mL de solução de digestão enzimática). Incubar os tubos de 5 mL por 30 min a 37 °C com agitação para melhorar a atividade de digestão enzimática.
8. Vórtice os tubos de 5 mL e colocá-los no gelo para inibir a ação de enzimas. Em seguida, transfira o conteúdo para tubos de centrífugas de 15 mL devidamente rotulados.
9. Jogue tudo fora dos tubos de 5 mL nos tubos de centrífugas de 15 mL usando 10 mL de solução EDTA PBS gelada de 5 mM.
10. Centrifugar os tubos de centrífugas de 15 mL contendo os tecidos digeridos por 10 minutos a 400 x g.
11. Descarte o supernasce, aperte suavemente a pelota e, em seguida, resuspensá-la em 10 mL de solução quente (37 °C) 5 mM EDTA PBS.
12. Incubar as amostras nos tubos de centrífugas de 15 mL a 37 °C com agitação por 15 minutos para remover o meio de digestão que sobrou e reduzir a aglomeração celular.
13. Vórtice as amostras em alta para 10 s para facilitar ainda mais a dissociação tecidual.

3. Processamento do útero em uma única suspensão celular

1. Usando o êmbolo de uma seringa estéril de 1 mL, force o tecido digerido através de um coador de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL devidamente rotulado e estéril para remover os aglomerados celulares e o tecido não dissociado.
2. Lave o coador várias vezes com um total de 10 mL de PBS frio para coletar todas as células.
3. Gire o tubo de centrífugas de 50 mL por 10 min a 400 x g.
   NOTA: Execute as etapas adicionais usando a opção A ou a opção B. A opção A permite um melhor enriquecimento dos linfócitos com menos detritos e contaminação celular estrogonicamente do que a Opção B. No entanto, a Opção B dá um maior rendimento das células imunes devido à menor perda celular e menor variabilidade do rendimento celular entre as amostras. A opção B também é mais fácil de executar tecnicamente. Portanto, dependendo da preferência, proceda com a Opção A ou Opção B.
   1. Os passos para a Opção A são os seguintes.
      1. Rotule um tubo de centrífugo estéril de 15 mL por amostra contendo 5 mL de 80% (v/v) percoll isotônico diluído em PBS.
      2. Após o giro, descarte o supernatante do tubo centrífuga de 50 mL. Use um pipet boy para resuspensar cada pelota em 8 mL de 40% (v/v) percoll isotônico na PBS.
      3. Use um pipet boy em velocidade lenta para sobrepor cuidadosamente a pelota resuspended na solução Percoll de 40% em 80% solução Percoll. Pipeta devagar e continuamente; segure o tubo de 15 mL em um ângulo de 45° (Figura 6B).
      4. Sem perturbar a sobreposição, centrifugar os tubos de centrífugas de 15 mL por 20 minutos a 850 x g, em temperatura ambiente (aceleração média e quebra mínima).
      5. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem perturbar as camadas de Percoll (Figura 6C).
      6. Sem perturbar o anel de leucócitos na interface das duas soluções Percoll, use uma Pipeta Pasteur estéril para descartar tudo, exceto aproximadamente 0,5-1 mL da camada percoll superior.
      7. Enquanto tenta sugar uma quantidade mínima de solução Percoll (até 4-5 mL total), coletar cuidadosamente o anel de leucócitos e transferir as células para um novo tubo de centrífuga de 15 mL rotulado.
      8. Cubra cada amostra com 10 mL de meio RMPI-1640 estéril complementado com 10% de FBS inativados pelo calor.
      9. Centrifugar por 5 min a 500 x g a 4 °C.
      10. Descarte o supernatante e prossiga para a lise RBC.
   2. Os passos para a Opção B são os seguintes.
      1. Rotule um tubo de centrífugo estéril de 15 mL por amostra.
      2. Após o giro, descarte o supernatante do tubo centrífuga de 50 mL. Use um pipet boy para resuspend cada pelota com 8 mL de 35% (v/v) percoll isotônico em meio RPMI-1640.
      3. Transfira as amostras para tubos de centrífugas de 15 mL.
      4. Centrifugar as amostras a 940 x g por 10 minutos em temperatura ambiente com aceleração média e quebra mínima.
      5. Aspire o supernatante cuidadosamente usando um aspirador ou pipeta (não invertendo o tubo).
      6. Resuspenque a pelota em 14 mL de RPMI-1640 médio suplementado com FBS inativado a calor de 10% e, em seguida, centrifugar a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C.
      7. Descarte o supernatante por aspiração e prossiga para a lise RBC.

4.RBC lysis

1. Para lise os RBCs, resuspenque as amostras em 3 mL de solução de 1x RBC e incubar por 3 min a temperatura ambiente.
2. Adicione 10 mL de PBS nas amostras para parar a reação.
3. Centrifugar os tubos a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenante.
4. Adicione 10 mL de PBS e repita o passo 4.3.
5. Resuspenque cada pelota em 1 mL de RPMI-1640 médio suplementado com 10% de FBS inativados pelo calor.
6. Passe as amostras através de filtros celulares estéreis de 70 μm.
7. Realize a contagem de células usando azul trypan e uma Câmara de Neubauer de acordo com as instruções do fabricante.
8. Ajuste a concentração da suspensão celular para 1-2 milhões de células em 100 μL de PBS ou médio.

5. Estratégia e controles de design de painel

NOTA: O painel descrito neste artigo é adequado para a discriminação de células uILC1, trNK e cNK e foi projetado para ser usado em um BD LSRFortessa de 5 lasers. Pequenas modificações podem ser feitas para estudar diferentes populações celulares e usar fluorocromes alternativos. Recomenda-se verificar a configuração do instrumento, utilizando anticorpos titulados para uma separação ideal, consultando o índice de brilho do fabricante e usando os corantes mais brilhantes para antígenos de baixa expressagem, como nKp46, e seguindo diretrizes ^gerais19. Recomenda-se incluir um controle de Fluorescência Minus One (FMO) para NKp46.

6. Coloração de células linfoides inatas para fenotipagem FACS

1. Transfira 1-2 milhões de células por poço em uma placa de 96 poços.
2. Gire a placa a 400 x g por 3 min a 4 °C e descarte o supernatante, sacudindo-a em uma pia.
3. Resuspenda as pelotas celulares em 100 μL de PBS (proteína e sem azida) usando uma pipeta multicanal.
   NOTA: Certifique-se de que o PBS não contém azida de sódio, nem Tris ou quaisquer proteínas para a etapa subsequente.
4. Repita o passo 6.2.
5. Células resuspend em 50 μL de corante de viabilidade fixável diluído em PBS (proteína e sem azida) (1:1.000). Incubar as células à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.
   NOTA: Certifique-se de que o PBS não contém azida de sódio, nem Tris ou quaisquer proteínas como FBS ou BSA, pois isso pode resultar em diminuição da intensidade de coloração de células mortas e/ou aumento da coloração de fundo para as células vivas.
   ATENÇÃO: Se a viabilidade do corante estiver em pó, use sob o capô.
6. Adicione 150 μL de PBS, resuspense as células com uma pipeta multicanal e, em seguida, repita o passo 6.2.
7. Resuspense as células em 25 μL de Tampão FACS (PBS complementado com 1% de BSA ou 2% FBS) contendo reagente de bloqueio do receptor Fc. Incubar as células por 5 min a 4 °C.
8. Adicione 25 μL de um coquetel de anticorpos de superfície.
   NOTA: Sempre titule anticorpos e otimize o painel de anticorpos antes do experimento.
9. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.
10. Adicione 150 μL de tampão FACS a cada poço, misture bem e, em seguida, repita o passo 6.2.
11. Repita o passo 6.10.
    NOTA: Execute outras etapas usando a opção A ou a opção B. Use a opção A para colorar as células com marcadores de superfície. Use a opção B para estudar os marcadores intracelulares por citometria de fluxo.
    1. Os passos para a Opção A são os seguintes.
       1. Resuspenque as amostras em 100 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) por poço e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.
          ATENÇÃO: Use PFA sob o capô. Consulte a folha de segurança para descartar resíduos/objetos PFA que entraram em contato com pfa (por exemplo, pipetas) com segurança.
       2. Repita o passo 6.2, duas vezes.
          ATENÇÃO: Não descarte ao mexer na pia aqui, pois contém PFA. Aspire com uma pipeta e descarte os resíduos conforme a folha de segurança.
       3. Resuspend as amostras em 200 μL de PBS.
       4. Transfira as amostras para tubos FACS rotulados e cubra com 100 μL de PBS. Mantenha os tubos no gelo ou em uma geladeira até que o processamento com a análise FACS. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo dentro de 24 h.
    2. Os passos para a Opção B são os seguintes.
       1. Resuspenque as amostras em 100 μL de solução de fixação/permeabilização por poço (contendo paraformaldeído) e incubar por 20 min a 4 °C.
          ATENÇÃO: Use PFA sob o capô. Consulte a folha de segurança para descartar resíduos/objetos PFA que entraram em contato com pfa (por exemplo, pipetas) com segurança.
       2. Repita o passo 6.2.
          ATENÇÃO: Não descarte ao mexer na pia aqui, pois contém PFA. Aspire com uma pipeta e descarte os resíduos conforme a folha de segurança.
       3. Adicione 200 μL de 1x de permeabilização / tampão de lavagem, misture bem e, em seguida, repita o passo 6.2.
       4. Repita o passo 6.11.2.3.
       5. Resuspenha as células fixas e permeabilizadas em 50 μL de 1x permeabilização/tampão de lavagem contendo mistura de anticorpos para coloração intracelular.
       6. Incubar as amostras a 4 °C por 30 min no escuro.
       7. Adicione 200 μL de 1x solução de permeabilização/lavagem, misture bem e, em seguida, repita o passo 6.2.
       8. Repetia o passo 6.11.2.7.
       9. Resuspend as amostras em 200 μL de PBS.
       10. Transfira as amostras para tubos FACS rotulados e cubra com 100 μL de PBS. Mantenha os tubos no gelo ou em uma geladeira até que o processamento com a análise FACS. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo dentro de 24 h.
           NOTA: Após a execução deste protocolo, a suspensão celular decidetiva está pronta para análise FACS. Recomenda-se registrar o maior número possível de eventos por amostra; pelo menos 1.000-3.000 eventos de uma população parental devem ser obtidos para alcançar resultados confiáveis.

Os principais passos do método descrito para obter uma suspensão celular única de leucócitos uterinos são resumidos na Figura 3. Demonstrados na Figura 2B estão a estratégia básica de gating FACS utilizada para a identificação de três subconjuntos de ILCs g1 em camundongos B6: uILC1 (CD49a⁺Eomes^-), trNK (CD49a⁺Eomes⁺) e células cNK (CD49a-Eomes⁺). Uma análise mais aprofundada dessas populações pode ser realizada para estudar vários marcadores superficiais e intracelulares dos ILCs g1. Como exemplo, a co-expressão de receptores IFN-ɣ e auto-MHC pode ser avaliada em células YC1, TrNK e cNK após estimulação com anticorpo anti-NK1.1 (Figura 7).

Dependendo da questão da pesquisa, tanto o protocolo (Figura 3) quanto o painel de anticorpos podem ser adaptados. É importante ressaltar que recomenda-se usar anticorpos anti-NK1.1 e anti-NKp46 em um painel FACS para g1 ILC gating (Figura 2B e Tabela 1). Deve-se notar que os ILCs g1 obtidos a partir de sangue, baço ou fígado têm uma expressão maior de NKp46 em sua superfície do que a contraparte uterina (Figura 8). A coloração superficial para NK1.1 dá uma melhor separação e permite que ilCs uterinos g1 sejam fechados facilmente (Figura 8). Enquanto o NKp46 é expresso por todas as cepas de camundongos, o antígeno NKR-P1C reconhecido pelo anticorpo anti-NK1.1 PK136 só é expresso por algumas cepas de camundongos, incluindo C57BL/6 (ou seja, B6), FVB/N e NZB, mas não em AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL ou 129. Além disso, se o pesquisador pretende estudar receptores de células NK cruciais, como os receptores Ly49, é importante estar ciente das variações allelic em cepas de camundongos de laboratório, que recapitulam a alta variabilidade dos receptores semelhantes a imunoglobulinas-assassinas humanas (KIR). Além disso, se as células forem estimuladas com NK1.1 para um ensaio funcional, como descrito em Kim, S. et ^al.20, pode ser desejável manchar as células com anti-NKp46 em vez de anti-NK1.1, pois o antígeno NKR-P1C pode ser ocupado pelo anti-NK1.1 ou uma regulação receptora pode seguir a estimulação. Ou a ocupação do receptor ou a baixa regulação podem impedir a coloração com o mesmo anticorpo usado para estimular.

Um problema comum com a dissociação do tecido enzimático é a alteração de epítopos superficiais nas células por enzimas usadas para um meio de digestão. Por exemplo, a coloração para o receptor MHC CD94:NKG2A é ruim se o Liberase TM for usado. No entanto, a digestão com Liberase DH preserva o reconhecimento de NKG2A por clone de anticorpos 16A11 (Figura 9). Recomenda-se verificar a influência de enzimas em todos os epítopos no painel FACS. Para isso, utilize a suspensão de esplenócitos de rato obtidos por dissociação mecânica (passando o baço inteiro através de um coador de 70 μm). A amostra é então dividida em duas ou mais partes seguidas de incubação com um meio com ou sem enzimas.

Como mencionado anteriormente, as células derivadas do sangue estão presentes em amostras dissociadas por tecidos. Se necessário, os contaminantes sanguíneos podem ser excluídos usando um método de coloração intravascular, desenvolvido no laboratório ^Masopust21. A Figura 10 demonstra que cerca de 6,5% dos ILCs g1 presentes em amostras de tecido uterino no dia da gestação 8,5 são derivados do sangue. Anticorpos anti-CD45 usados para coloração intravascular podem ser conjugados com um fluorocromo usado para um canal de despejo; isso excluirá contaminantes sanguíneos sem usar um canal extra de fluorescência. Os problemas mais comuns e suas soluções são apresentados na Tabela 2.

Figura 1: Seção transversal de um útero de camundongo. (A) Seção transversal do útero do camundongo (não grávida) indicando uma variedade de leucócitos maternos que povoam o útero. (B) Seção transversal do útero do rato (dia de gestação 8.5). (C) Seção transversal do útero do camundongo (dia de gestação 13,5). (D) Comparação da formação de camundongos versus placenta humana a partir do estágio blastocisto em diante. Imagens criadas com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Subpopulações do g1 ILC1. (A) Percentuais de uterino cNK, ILC1 e trNK em camundongos durante a vida precoce e a gravidez. W - semanas, gd - dia de gestação. Gráfico modificado de Filipovic, I. et ^al.4. (B) Estratégia de gating para analisar subconjuntos ilc do grupo uterino 1 por citometria de fluxo. Os linfócitos foram isolados dos tecidos uterinos no dia da gestação 10.5. A digestão tecidual foi realizada utilizando-se um meio de digestão contendo Liberase TM. As celas foram fechadas com base em sua capacidade de dispersar a luz. Os doublets foram excluídos usando um enredo FSC-A versus FSC-H, e apenas células ^viáveis CD45^+CD3-CD19 foram analisadas. Dentro de células CD45^+CD3-CD19- viáveis, o portão ILC do grupo 1 foi identificado como células NK1.1⁺ NKp46⁺. Dentro dos ILCs do grupo 1, três subconjuntos podem ser identificados: células NK convencionais CD49a-Eomes⁺ (cNK), ^{células NK} residentes em tecido CD49a⁺Eomes +(trNK) e CD49a⁺Eomes^- uILC1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Um guia visual para os principais passos do protocolo. (1) Dissecar o útero gestante livre de gordura mesometrial. (2) Remover os fetos; devolver o útero ao tubo de 5 mL e picadinho o tecido. Proceda com a etapa de digestão da enzima: adicione 3 mL de mistura de digestão enzimática quente a cada amostra. Incubar os tubos de 5 mL por 30 min a 37 °C com agitação. (3) (i) Após a digestão, tire tudo dos tubos de 5 mL em tubos de 15 mL usando 10 mL de solução EDTA PBS gelada de 5 mM. (ii) Centrífuga tubos de 15 mL contendo tecidos digeridos por 10 min a 400 x g. (iii) Descartar o sobrenante; gire suavemente a pelota e resuspense-a em 10 mL de solução quente (37 °C) 5 mM EDTA PBS. (iv) Incubar amostras nos tubos de 15 mL a 37 °C com agitação, por 15 min. (4) Utilizando o êmbolo de uma seringa estéril de 1 mL, forçou o tecido digerido através de um coador de 70 μm sobre um tubo de 50 mL devidamente rotulado e estéril, e gire por 10 min a 400 x g. (5) Após o giro, proceda com a opção A (representada aqui em diagramas) ou B. Opção A: descarte o supernasce do tubo de 50 mL e, utilizando um menino pipeta, resuspenque cada pelota em 8 mL de 40% (v/v) percoll isotônico em PBS. (6) (i) Opção A continua: Utilizando um menino pipet em velocidade lenta, sobreponha cuidadosamente a pelota resuspended em solução Percoll de 40% para a solução de 5 mL de 80% percoll. Pipeta devagar e continuamente; segure o tubo de 15 mL em um ângulo de 45°. (ii) Sem perturbar a sobreposição, centrifugar os tubos de 15 mL a 850 x g por 20 min a temperatura ambiente, com aceleração média e quebra lenta. (7) Após o giro, enquanto tenta sugar uma quantidade mínima de solução Percoll (até 4-5 mL total), colete cuidadosamente o anel de leucócitos. (8) Realize etapas de lise de glóbulos vermelhos. (9) Conte célula usando azul trypan e uma Câmara de Neubauer. (10) Transfira 1-2 milhões de células por poço em uma placa de 96 poços. (11) Proceda com a vibilidade de corante e mancha de anticorpos. (12) Por fim, transfira as amostras para tubos FACS rotulados. Mantenha os tubos no gelo ou em uma geladeira até que o processamento com análise FACS dentro de 24 horas. Imagens criadas com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ficha vaginal (A) e ausência dele (B) em fêmeas C57BL/6 a 0,5 dias de acasalamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Dissecção para extrair o útero de um camundongo grávida. (A) A represa é fixada com agulhas em uma tábua macia para limpar o corpo com 70% de etanol. Duas incisões verticais são feitas, conforme indicado pelas linhas pontilhadas azuis. (B) A pele é levantada para expor órgãos internos. As alças intestinais são suavemente movidas para visualizar o útero. (C) O útero é amostrado por corte em três pontos: ao lado dos ovários e no colo do útero, como indicado pelas duas linhas pontilhadas azuis e a seta azul, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Preparação de suspensão unicelular. (A) Remoção mecânica de embriões de seu local de implantação. (B) Sobreposição de gradiente de pécoll; a camada superior contém a suspensão unicelular em 40% de Percoll e a camada inferior 80% de Percoll. (C) Formação do anel linfócito após centrifugação do gradiente percoll. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Análise representativa facs do ensaio funcional com ILCs do grupo 1. Detecção de IFN-ɣ e detecção de CD107a intracelulares no grupo 1 ILCs expressando receptores NK para auto-MHC (Ly49C, Ly49I e NKG2A) em comparação com aqueles que não o fazem, depois de cruzar NK1.1 com anticorpos ligados a placas. As células foram isoladas dos tecidos uterinos no dia da gestação 9.5. A digestão tecidual foi realizada utilizando-se um meio de digestão contendo DH Liberase. São mostrados os valores brutos dos quatro quadrantes (cantos), bem como a porcentagem relativa de respondentes entre as células que expressam receptores para auto-receptores que não possuem auto receptores (números ousados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Manchas de linfócitos esplênicos e uterinos com anticorpos anti-NKp46 e anti-NK1.1. (A) As suspensões celulares obtidas do baço do camundongo e do útero (B) no dia da gestação 10,5 foram separadas em duas; uma parte foi manchada com NKp46-APC (vermelho) e a outra com NK1.1-APC (azul). Observe que a coloração NKp46 de linfócitos uterinos não separa nKp46⁺ e NKp46^- células tão ordenadamente quanto linfócitos esplênicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Diminuição do NKG2A MFI (clone de anticorpos: 16A11) por incubação com meio de digestão. A suspensão celular dos esplenócitos do rato C56BL/6 foi dividida em três partes. Uma parte foi incubada em meio de digestão Liberase DH (HBSS contendo 0,13 WU/mL Liberase DH e 30 μg/mL de DNAse), e outra parte foi incubada com meio de digestão Liberase TM (HBSS contendo 0,52 WU/mL Liberase TM e 30 μg/mL de DNAse). A terceira parte foi tratada com HBSS puro por 30 min a 37 °C. A expressão do marcador NKG2A nos ILCs g1 foi avaliada por citometria de fluxo. Gráfico tirado de Shreeve N. O papel da inibição uterina das células NK na gravidez (Tese); Supervisor: Colucci F, 2020. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Coloração intravital com anticorpos anti-CD45 para exclusão de ILCs g1 derivados do sangue. Um rato da barragem C57BL/6 no dia da gestação 8.5 foi abatido 3 min após injeção intravenosa com 3 μg de CD45-AF647. O útero, o sangue inteiro e o timo foram colhidos e processados para análise facs. O eixo X mostra o sinal de coloração intravenosa com CD45-AF647, e o eixo Y demonstra sinal de CD45-BUV395 manchado in vitro . As porcentagens de subpopulações são mostradas em quadrantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Um exemplo do painel FACS para o cicímetro convencional de 5 lasers.

Tabela 2: Guia de solução de problemas.

O método contém várias etapas críticas discutidas a seguir. O primeiro passo crítico é obter múltiplas gestações síncrocas à medida que a frequência relativa das populações de leucócitos muda durante a gravidez. Ter várias barragens no mesmo dia gestacional permite que as repetições biológicas nos mesmos experimentos ou a junção de linfócitos de barragens individuais obtenham números maiores necessários para aplicações a jusante. O acasalamento cronometrado permite ao pesquisador identificar a concepção dentro de um período de 24h. Embora os camundongos vivam por cerca de 2,5 anos, eles terão idade reprodutiva de 4 a 7 semanas até 6-8 meses de idade. Como camundongos mais jovens geralmente produzem filhotes menores, camundongos fêmeas geralmente não são acasalados até que estejam entre 6-8 semanas, e camundongos machos até que estejam entre 8 e 10 semanas. Dado que estrus dura cerca de 15 h em camundongos e ocorre a cada 4-5 dias, a taxa típica de acasalamento (revelada por um plug vaginal, ver Figura 4) é em torno de 25%. Por isso, é importante usar camundongos em estrus e planejar números suficientes para obter o número necessário de barragens para um determinado experimento. A fase do ciclo estrus pode ser determinada por citologia de difamação ^vaginal22. A taxa de plugue pode ser melhorada descansando os machos 48 h antes do acasalamento e aproveitando o efeito ^Whitten18. Alternativamente, pode-se administrar soro de égua grávida, que imita o efeito do hormônio estimulante do folículo endógeno, induzindo a maturação do oócito e, 42-50 h depois, gonadotropina coriônica humana, que imita o efeito do hormônio luteína endógeno, induzindo a ovulação. Este tratamento hormonal ignora a exigência de estrus e torna praticamente todas as fêmeas tratadas receptivas.

Um segundo passo crítico é garantir a qualidade da coloração FACS. Os anticorpos utilizados na citometria de fluxo devem ser sempre titulados e utilizados na concentração ideal, e é necessário verificar se a digestão enzimática não corta epítopos antigênicos cruciais. Para avaliar se uma enzima irá cortar um epítope, pode-se manchar duas frações da mesma amostra em paralelo, uma submetida a digestão enzimática e outra mecânica. Da mesma forma, o uso de controles apropriados e manchas únicas é crucial para obter dados confiáveis. Para eventos raros, as contas podem ser usadas para gerar amostras de uma única mancha. Recomenda-se não usar contas para a instalação de tensões, mas sim uma população de células contendo linfócitos e outros leucócitos, como esplenócitos. Se as contas forem usadas, é necessário titular anticorpos para coloração de contas, de modo que a intensidade de fluorescência das contas manchadas será comparável à intensidade de fluorescência das células. Em caso de dificuldade em separar positivo de células negativas para um determinado marcador, um controle de FMO também pode ser usado para facilitar a gating para um marcador específico. No caso de marcadores intracelulares, um controle isótipo deve ser usado como coloração intracelular pode resultar em anticorpos residuais desvinculados, que ainda podem estar presentes dentro das células após as etapas de lavagem e, portanto, aumentar o sinal de fundo. Recomenda-se executar as amostras dentro de 24 horas de fixação das células para obter os melhores resultados em fenotipagem pela análise FACS, uma vez que a autofluorescência aumenta significativamente ao longo do tempo e a intensidade de fluorescência de alguns anticorpos pode diminuir ao longo do tempo.

Outro fator crucial a considerar é a aplicação a jusante da suspensão unicelular obtida com o protocolo. Para ensaios funcionais, é essencial trabalhar em condições estéreis. Da mesma forma, para estudos de omics subsequentes, é importante trabalhar em estéril e RNase, DNase e sem protease.

O protocolo aqui apresentado se concentra em ILCs do grupo 1 fenotipagem, mas pode ser adaptado para fenotipagem de outros tipos de células modificando o painel de anticorpos. Recomenda-se que todos os anticorpos sejam testados contra suspensão celular digerida e não digerida para detectar a perda/alteração de epítopos superficiais pelo tratamento enzimático. Da mesma forma, diferentes enzimas podem ser usadas para digerir o tecido e aumentar o rendimento celular, mas seu efeito sobre epítopos antigênicos cruciais deve ser cuidadosamente estudado. Enquanto nKp46 é um bom marcador para células NK esplênicas e funciona em todas as cepas de ratos de laboratório, a expressão de NKp46 em células uNK em camundongos C57BL/6 é consideravelmente menor do que em células NK de baço. É melhor manchar para NK1.1 e NKp46 simultaneamente. Se vários órgãos forem comparados diretamente, recomenda-se tratar todas as amostras de forma igual, mesmo que a digestão enzimática não seja necessária para tecidos como o baço ou a medula óssea. Embora o método aqui apresentado seja aplicável ao útero não gestante, o isolamento do anel linfócito por um gradiente percoll de duas fases será desafiador, e o rendimento de células isoladas pode ser muito baixo para análise confiável do FACS e, portanto, exigirá a junção de células isoladas do útero de camundongos individuais e não ^gestantes23.

Há limitações ao protocolo a considerar para a interpretação dos dados. Como é o caso de todos os tecidos, os linfócitos circulantes provenientes do sangue serão isolados ao lado de células residentes em tecidos. Se a exclusão dos linfócitos circulantes for essencial para a interpretação dos dados, a coloração intravital pode ser realizada para rotular células circulantes. Além disso, uma segunda limitação ao protocolo é que algumas células serão perdidas, pois nem todas as células podem ser extraídas do tecido. Os problemas mais comuns e sua solução de problemas são apresentados na Tabela 2.

Historicamente, o estudo das células nos tecidos tem se apoiado no exame histológico das seções teciduais. A excelente revisão de Sandra ^Peel24 resume o trabalho feito ao longo de mais de 100 anos até o final dos anos 80. Descrições de células mais tarde conhecidas como células uNK realmente aparecem em manuscritos publicados mais de meio século antes mesmo de linfócitos serem descobertos. Assim, antes da descoberta de células NK em 1975, e as células uNK foram indicadas como células glicogênio maternas ou células de glândulas metrial granuladas. Anne Croy fez grandes contribuições no ^campo25 e gentilmente ensinou à equipe a dissecção que ela havia ^otimizado3, e que é usada atualmente. Embora seja fundamental na descrição da morfologia e localização tecidual das células uNK, o exame histológico clássico limita-se à detecção de apenas alguns marcadores nas células de interesse. Em 2008, ^{foi descrito um} método baseado em citometria de fluxo para detectar simultaneamente vários marcadores em linfócitos uterinos. Este é essencialmente o método que foi descrito neste artigo. Tecnologias mais recentes, como transcrição espacial e imagem por citometria em massa, combinam o poder da histologia e da citometria de fluxo, permitindo tanto a detecção simultânea de múltiplos genes ou proteínas, respectivamente, quanto a preservação da arquitetura tecidual normal.

As aplicações do método descrito aqui são múltiplas e incluem fenotipagem FACS, ensaio funcional (como ELISPOT, degranulação ou ensaios citotóxicos), classificação celular e transcrição ou proteômica subsequente. Outras aplicações que poderiam ser desenvolvidas com base neste método incluem a cultura e a expansão de células NK deciduais após a classificação celular ou enriquecimento por esgotamento negativo. Atualmente, não há protocolo para cultivar e expandir as células uNK do mouse e preservar sua viabilidade e funcionalidade por um período prolongado, de forma semelhante às células NK humanas que podem ser cultivadas e expandidas por 7-14 dias por adição de IL-2 ou uma combinação IL-12 e IL-15. A otimização de tal método para células uNK do mouse proporcionaria mais flexibilidade ao realizar ensaios funcionais e permitiria que múltiplas condições fossem testadas com um número de células mais alto. Por outro lado, as condições culturais são conhecidas por modificar o fenótipo único de linfócitos e potencialmente sua função também.

Os autores não têm nada a revelar e nem conflitos de interesse.

Agradecemos aos membros anteriores e atuais da equipe que ajudaram a desenvolver esse método, incluindo Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic e Anita Qualls. Esta pesquisa foi financiada pelo fundo Wellcome [Número de subvenção 200841/Z/16/Z ] e pelo Conselho de Pesquisa Médica (MR/P001092/1). Para fins de acesso aberto, o autor solicitou uma licença de direitos autorais pública CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.