유동 세포측정에 의한 분석을 위한 자궁 내 선천 림프구 세포의 격리

이것은 임신과 비 임신 마우스 둘 다에서 자궁 림프세포를 격리하는 방법입니다. 이 방법은 FACS phenotyping, 세포 선별, 기능 적 작용, RNA-seq 및 프로테오믹스와 같은 여러 다운스트림 응용 제품에 사용할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 혈류 세포측정에 의한 표현형 그룹 1 자궁선천성 림프구 세포를 전파한다.

여기에 설명된 간단한 방법은 유동 세포법에 의한 개별 임신 자궁으로부터 1 자궁성 마우스 군 1 자궁선천성 림프구 세포(g1 uILC)를 분리하는 간단한 방법이다. 이 프로토콜은 여러 동기 댐, 임신 한 자궁의 기계적 및 효소 소화, 단일 세포 서스펜션의 염색 및 g1 uILC를 차별하는 FACS 전략을 얻기 위해 시간 결합을 설정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 필연적으로 조직 내의 세포 분포의 공간 정보를 분실하더라도, 프로토콜은 성공적으로 uILC 이질성, 임신에 영향을 미치는 모계 및 태아 요인에 대한 그들의 반응, 그들의 유전자 발현 프로필 및 그들의 기능을 결정하기 위하여 적용되었습니다.

여기에 설명된 간단한 방법은 개별 임신 한 자궁으로부터 자궁 내 임포세포의 높은 수율을 얻는 간단한 방법입니다. 이 방법은 자궁 내 선천성 림프구의 단백질 표면 발현 및 기능을 보존하고 FACS 페노티핑, RNAAeq, 프로테오믹스 또는 기능적 작용과 같은 후속 응용 분야에 적합합니다. 여기서, 초점은 혈류 세포측정에 의한 그룹 1 uILC의 phenotyping에 있습니다.

자궁은 3개의 층으로 이루어지다: 자궁 내막, 근막, 및 perimetrium (도 1). 자궁 내막은 자궁의 루멘을 감싸는 점막입니다. 코퍼스 루테움에 의해 생성 된 프로게스테론, 데시두아로 자궁 내메터를 변환합니다. 근막은 자궁 벽을 구성하는 부드러운 근육의 두 층으로 구성되어 있습니다. 회리메트리움은 자궁을 감싸고 심술관이라고 불리는 넓은 인대를 통해 회막에 연결하는 세로사입니다. 자궁의 단면에서 루멘과 반대되는 부분은 심술문 측이라고 하며, 루멘에 가까운 부분은 항음절 측이라고 합니다. 다양한 모계 백혈구는 내메타리움과 데시두아를 채우고, 여러 종류의 세포를 포함하고, 여기서 선천성 면역 세포는 세포의 대부분을 나타낸다. 선천성 림프구 세포(ILC), 대식세포, 수지상 세포(DC), CD4⁺ 및 CD8⁺ T 림프구, 규제 T 세포(Tregs), 및 희귀 B 세포^{는 모두 임신 1,2}에 걸쳐 자궁 환경의 조절에 중요한 역할을 할 수 있다. 자궁에 있는 IlCs는 점막에서 뿐만 아니라, 마우스에 있는 근막에서 또한 있습니다. IlC의 모든 3개의 단을 포함하여, 자궁은 실제로 그룹 1 IlCs에 의해 가장 인구밀도가 높은 기관입니다. 임신 기간 동안 자궁 조직의 구조적 변화와 함께 자궁 백혈구의 수와 비율도 변경됩니다(그룹 1 uILC 하위 집합의 비율에 대한 변동의 예는 그림 2A 참조)^3,4.

마우스가 이 논문에서 언급될 때, 근친 실험실 마우스의 C57BL/6 균주는 의미된다. 외종 마우스 (예를 들어, NMRI 마우스)는 종종 그들의 높은 생식 속도 때문에 생식 연구에서 사용 됩니다. 그러나, 근친 긴장의 사용은 일관된 결과를 생성하기 위하여 필요하고, 면역학자의 마음에 드는 유전 배경은 B6로 알려져 있는 C57BL/6입니다.

임신 중반 B6 댐의 자궁 백혈구의 약 30%는 g1 uILC이며, 이는 가능한 CD45⁺CD3-CD3-CD19-NK1.1+NKp46⁺ 세포(그림 2B): 친혈관형성 조직 거주자 NK(trNK), IFN-tNK(cNK), IFN-g 생산 형 전자 식 NK(cNK), 기존 GC(CNK4C) 및 기존 GC(CC4) 및 기존 GC(CC4C), IFN-g 생산형 CNK(cNK4C) 및 기존 GC(cNKC4C) 및 기존 GCC(cNKC4C) 및 기존 GC(cNKC4C) 및 기존 GC(cNK)를 생산하는 데 사용 가능한 CD45+CD3-CD19-NK19-Nk19-NKp46+ 세포(그림 2B): IFN-t-g 의 기존 G CC(cNKC)을 생산하는 IFN-g. uNK 세포의 백분율은 첫번째 ^삼보격6에 있는 대략 70%에 도달하는 인간에서 더 높습니다. 인간과 마우스 uNK와 uILC7,8 사이의 차이보다 더 많은 유사점이 있습니다. 차이점을 염두에 두는 것이 중요하지만 두 종에서 사용할 수있는 정보를 통합하는 것이 유용합니다. 인간과 실험실 설치류에서 uILC를 조사하여 얻은 정보를 결합하면 NK 세포가 동맥 무결성⁹ 및 나선형 동맥 리모델링¹⁰의 유지 보수를 포함하여 자궁의 생물학에 필수적인 동종 성 변화를 지원하고 트로피후 블라스트 침공^11,12를 지원합니다. 그(것)들은 또한 병원체에 대하여 방어에 있는 특정 역할을 ^13,14. 마우스와 쥐에서, 이식 부위 주위의 데시두아를 채우는 것 외에도, NK 세포는 과거에 메심선으로 알려진 임신 림프구 골재(MLAp)¹⁵(도 1B)로 알려진 과도 구조에서 댐의 근막의 두 근육 층 사이에 축적되며, 그 기능은 아직 발견되지 않고 있다.

여기에 기술된 기계적 분리및 효소 소화의 조합을 사용하여 임신한 마우스의 자궁으로부터 림프구를 분리하는 실험실에서 사용되는 방법의 상세한 프로토콜이다. 전체 자궁이 이 방법으로 사용되기 때문에 임신 중 자궁으로부터 분리된 림프구는 데시및 심근세포의 혼합물이다. 자궁 벽과 MLAp로부터 데시두아의 추가 해부가 가능하고, ¹⁶ 전에 설명되었다. 여기에 설명된 방법은 단백질 표면 발현, 세포 기능 성 및 생존가능성을 유지하면서 자궁 림프구를 얻기 위해 개발되었다. 결과는 임신한 자궁을 위한 중간 임신 (10.5 일)에 있는 1-5 백만 세포에서 전형적으로 구역 수색하는 최소한의 잔류 세포 파편 및 수율을 가진 단 하나 세포 현탁액입니다. 이 방법의 응용 프로그램은 흐름 세포측정에 의한 페노티핑, 후속 전사 또는 프로테오믹 연구를 위한 세포 분류, 세포 내 세포 사화학 생산, 탈과화, ELISPOT 또는 세포 독성 분석과 같은 기능적 연구를 포함한다. 여기에 제시된 프로토콜은 그룹 1 IlCs를 식별하는 데 중점을 두지만 FACS 분석에 사용되는 항체 패널의 사소한 수정을 통해 다른 IlCs, T 세포, B 세포, DC 또는 대식세포와 같은 다른 세포 유형에 적응할 수 있다. 프로토콜은 또한 그밖 조직에서 그리고 풀로 풀이 된 비 임신 자궁에 대한 세포를 격리하기 위하여 이용될 수 있습니다.

이 논문에 설명된 모든 동물 실험은 영국 본사에서 발행한 PP2363781에 따라 동물(과학 절차) 법 1986에 따라 수행되었습니다. 아래 프로토콜은 마우스 축산에서 시작하여 FACS 분석을 위해 염색으로 마무리하는 여러 섹션으로 구성됩니다. 그림 3 은 프로토콜의 주요 단계를 반영합니다. 프로토콜에 사용되는 재료는 재료 표에 나열됩니다.

1. 일반 마우스 축산, 짝짓기 및 해부

1. 7-14주 된 암컷 마우스는 특정 병원체가 없는(SPF) 조건과 그룹 수용(케이지 크기 및 동물 체중에 따라 일반적으로 4-6암컷)을 10-14일 동안 유지하여 이부트 효과를 유발하여 에스트러스 동기화¹⁷을 초래한다.
2. SPF 조건에서 스터드 수컷을 유지하고, 단일 보관하고, 각 짝짓기(정자 재생 시간)사이에 적어도 48시간 동안 쉬게 됩니다. 그들은 일반적으로 젊은 사람 보다 더 수행 으로 경험 입증 된 3-4 개월 오래 된 스터드 남성을 사용 하는 것이 좋습니다.
3. 여성이 임신할 가능성을 높이기 위해 짝짓기 3일 전에 여성 케이지에 있는 수컷의 새장에서 더러운 침구를 소개합니다. 이것은 남성 소변 페로몬에 노출해서 휘튼 효력¹⁸ 을 트리거하고, 결합을 위한 향상된 수용성 뿐만 아니라 동기화된 estrus귀귀착됩니다.
4. 0일째 (D0)에, 2명의 여성 당 1개의 스터드 남성을 사용하여 짝짓기 마우스를 설치; 약 20%-25%의 플러그 비율을 고려하십시오.
   참고: 마우스는 야행성 동물이기 때문에 짝짓기는 밤에 발생할 가능성이 높습니다.
5. 다음 아침에 짝짓기 (D0.5), 교화의 지표인 질 플러그의 존재를 확인하십시오 (그림 4). 질 플러그는 남성 사정의 집계이며 일반적으로 짝짓기 후 최대 8-24 시간 동안 지속됩니다. 이른 아침에 플러그를 확인하십시오.
6. 새로운 케이지에 연결된 암컷을 통합하고 이를 표시합니다. 휴식을 위해 수컷을 케이지로 돌려놓습니다.
7. D9.5 또는 10.5 후 짝짓기에서 조직 수집을 위해 1mL 멸균 HBSS 1x (^{Mg2 +} 및 ^{Ca2 +})로 5 mL 튜브를 준비하고 얼음위에 놓습니다.
8. 자궁 경부 탈구에 의해 동물 안락사로 진행하고, 죽음을 확인하기 위해 흥분.
9. 다운스트림 응용 프로그램이 필요한 경우 멸균 환경에서 작업합니다. 안락사 직후, 70% 에탄올로 마우스 본체를 닦아내고 멸균 기기로 라미나르 플럭스 캐비닛 아래 해부를 진행한다.
10. 임신한 자궁을 심방 지방(그림 5)이 없는 해부하고 전체 자궁을 준비하고 적절하게 라벨이 부착된 5mL 튜브에 배치합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

2. 자궁의 기계적 및 효소 소화

1. 효소 소화 용액을 준비하려면 멸균 HBSS 1x의 자궁당 3mL을 DNAse 30 μg/mL, Liberase DH0.52 WU/mL의 30 μg/mL와 혼합하십시오. 37 °C에서 수조에 용액을 넣습니다.
   참고: 리베라제 TM과 리베라제 DH를 모두 사용할 수 있습니다. 다른 위에 하나의 선택은 후속 흐름 세포 분석에 사용되는 항체에 의해 인식 된 전형에 대한 잠재적 인 효과에 의해 유도되어야한다.
   주의: lyophilized 효소를 사용 하는 경우, 후드 에서 작동.
2. PBS에서 5mM EDTA의 20mL를 준비하십시오(^Ca2+/^Mg2+없음). 용액의 절반을 37°C의 수조에 놓고 나머지 절반은 얼음위에 놓습니다.
3. 라미나르 플럭스 캐비닛 아래에서 멸균 페트리 접시에 멸균 기구로 임신 한 자궁을 둘러싼 지방을 부드럽게 제거하십시오. 조직이 건조하도록 허용하지 마십시오.
4. 태아 (해마 모양의 투명 구조, 길이 약 1mm)를 제거하기 위해 멸균 기구로 각 이식 부위를 해부합니다 (그림 6A). 태아를 버리십시오.
5. 자궁을 원래 컬렉션 5mL 튜브로 되돌리고 5mL 튜브 및 수집 배지에서 직접 가위를 사용하여 조직을 다진다. 절차 사이의 항상 얼음에 튜브를 유지합니다.
6. 37°C에서 수조에 다진 조직을 포함하는 5mL 튜브를 놓습니다.
7. 각 시료에 따뜻한 효소 소화 믹스 3mL을 추가하여 튜브내의 총 액체 부피가 4mL(다진 자궁을 함유한 수집 배지 1mL, 효소 소화 용액 3mL)입니다. 효소 소화 활성을 향상시키기 위해 교반과 함께 37 °C에서 30 분 동안 5 mL 튜브를 배양하십시오.
8. 5mL 튜브를 소용돌이치며 효소의 작용을 억제하기 위해 얼음위에 놓습니다. 이어서, 내용물들을 15mL 원심분리기 튜브로 적절히 분류한다.
9. 얼음 차가운 5m EDTA PBS 용액10mL를 사용하여 5mL 튜브에서 15mL 원심분리기 튜브에 모든 것을 플러시하십시오.
10. 400 x g에서 10 분 동안 소화 된 조직을 포함하는 15 mL 원심분리기 튜브 원심 분리기 튜브원심분리기.
11. 상체를 버리고 펠릿을 부드럽게 쓸어 넘은 다음 따뜻한 (37 °C) 5m EDTA PBS 용액의 10 mL로 다시 놓습니다.
12. 15mL 원심분리기 튜브에서 37°C에서 15분 동안 교반하여 좌측 소화 배지를 제거하고 세포 응집을 감소시다.
13. 조직 해리를 더욱 용이하게 하기 위해 10초 동안 높은 샘플을 소용돌이시다.

3. 자궁을 단일 세포 현탁액으로 가공

1. 멸균 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여, 70 μm 스트레이너를 통해 소화된 조직을 제대로 표지된 50mL 원심분리기 튜브에 강제로 밀어 세포 덩어리와 비소화 조직을 제거합니다.
2. 모든 세포를 수집하기 위해 총 10mL의 차가운 PBS로 여과기를 여러 번 세척하십시오.
3. 50mL 원심분리기 튜브를 400 x g에서 10분 간 회전 시합니다.
   참고: 옵션 A 또는 옵션 B. 옵션 A를 사용하여 추가 단계를 수행하면 옵션 B보다 이물질과 기질 세포 오염이 적은 림프구를 더 잘 농축할 수 있습니다. 그러나, 옵션 B는 견본 사이 세포 수율의 더 적은 세포 손실 및 더 적은 가변성 때문에 더 높은 면역 세포 수율을 줍니다. 옵션 B는 기술적으로 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 따라서 기본 설정에 따라 옵션 A 또는 옵션 B를 진행합니다.
   1. 옵션 A의 단계는 다음과 같습니다.
      1. PBS에서 희석된 80%(v/v) 이소토닉 퍼콜의 5mL를 포함하는 샘플당 멸균 15mL 원심분리기 튜브를 라벨링합니다.
      2. 스핀 후 50 mL 원심 분리관에서 상체를 폐기하십시오. 파이펫 보이를 사용하여 PBS에서 40 %(v / v) 동위 원소 Percoll의 8 mL에서 각 펠릿을 재연하십시오.
      3. 느린 속도로 파이프 보이를 사용하여 40% Percoll 솔루션에서 재중단된 펠릿을 80% Percoll 솔루션에 조심스럽게 오버레이합니다. 파이펫은 천천히 지속적으로; 15mL 튜브를 45°(그림 6B)의 각도로 유지합니다.
      4. 오버레이를 방해하지 않고 실온(중간 가속 및 최소 브레이크)에서 850 x g에서 20분 동안 15mL 원심분리기 튜브를 원심분리합니다.
      5. 조심스럽게 퍼콜 층을 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 제거합니다(도 6C).
      6. 두 Percoll 솔루션의 인터페이스에서 백혈구의 링을 방해하지 않고 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상단 퍼콜 층의 약 0.5-1 mL을 제외한 모든 것을 폐기하십시오.
      7. 최소량의 Percoll 용액(총 4-5mL)을 빨아들이는 동안, 백혈구의 고리를 조심스럽게 수집하고 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
      8. 열 비활성화 FBS의 10%로 보충된 멸균 RMPI-1640 배지 10mL로 각 시료를 위로 합니다.
      9. 4 °C에서 500 x g 에서 5 분 동안 원심 분리기.
      10. 상체를 버리고 RBC 리시스로 진행합니다.
   2. 옵션 B의 단계는 다음과 같습니다.
      1. 시료당 멸균 15mL 원심분리기 튜브를 라벨로 지정합니다.
      2. 스핀 후 50 mL 원심 분리관에서 상체를 폐기하십시오. 파이펫 보이를 사용하여 RPMI-1640 배지에서 35%(v/v) 이소토닉 퍼콜의 8mL로 각 펠릿을 재보페한다.
      3. 샘플을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기습니다.
      4. 심정지는 중간 가속과 최소 휴식과 실온에서 10 분 동안 940 x g 의 샘플을 원심 분리합니다.
      5. (튜브를 반전하지 않음) 흡인기 또는 파이펫 소년을 사용하여 신중하게 슈퍼 나위를 흡인.
      6. 14mL의 RPMI-1640 배지에서 펠릿을 10% 열 비활성화 FBS로 보충한 다음 4°C에서 5분 동안 500 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
      7. 열망에 의해 상체를 버리고 RBC 리시스로 진행합니다.

4.RBC 리시스

1. RBC를 lyse하려면 1x RBC 용액의 3mL로 샘플을 다시 중단하고 실온에서 3 분 동안 인큐베이션하십시오.
2. 반응을 중지시 샘플에 PBS 10 mL을 추가합니다.
3. 튜브를 400 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
4. PBS 10mL을 추가하고 4.3 단계를 반복합니다.
5. 열 비활성화 FBS의 10%로 보충된 RPMI-1640 배지의 1mL에서 각 펠릿을 재연합니다.
6. 멸균 70 μm 세포 스트레이너를 통해 샘플을 전달합니다.
7. 제조업체의 지침에 따라 트라이판 블루와 노이바우어 챔버를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다.
8. PBS 또는 배지의 100 μL에서 세포 현탁액의 농도를 1-2백만 세포로 조정합니다.

5. 패널 설계 전략 및 제어

참고: 본 백서에 기재된 패널은 uILC1, trNK 및 cNK 세포의 차별에 적합하며 5레이저 BD LSRFortessa에 사용되도록 설계되었습니다. 사소한 수정은 다른 세포 인구를 연구하고 대체 형광을 사용하기 위해 이루어질 수 있습니다. 계측기의 구성을 확인하고, 최적의 분리를 위해 적정항체를 사용하고, 제조업체의 밝기 지수를 컨설팅하고, NKp46과 같은 낮은 발현 항원에게 가장 밝은 염료를 사용하고, 일반적인 지침¹⁹에 따르는 것이 좋습니다. NKp46에 대한 형광 마이너스 하나(FMO) 제어를 포함하는 것이 좋습니다.

6. FACS 페노티핑을 위한 선천성 림프구 세포 염색

1. 잘 1-2백만 개의 셀을 라운드 하단 96웰 플레이트로 옮기습니다.
2. 4°C에서 3분 동안 400 x g 로 플레이트를 회전시키고 싱크대에 쓸어 넘기면 상체를 버립니다.
3. 다중 채널 파이펫을 사용하여 세포 펠릿을 PBS(단백질 및 아지드 프리)의 100 μL로 재보페합니다.
   참고: PBS에 후속 단계에 대한 나트륨 아지드, 트리스 또는 단백질이 포함되어 있지 않은지 확인합니다.
4. 6.2 단계를 반복합니다.
5. PBS (단백질 및 아지드 프리)(1:1,000)에서 희석된 고착 가능한 생존성 염료의 50 μL에서 세포를 재중단합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 세포를 배양하십시오.
   참고: PBS에 나트륨 아지드, 트라이스 또는 FBS 또는 BSA와 같은 단백질이 포함되어 있지 않은지 확인하여 죽은 세포의 염색 강도감소 및/또는 살아있는 세포에 대한 배경 염색이 증가할 수 있습니다.
   주의: 생존성 염료가 가루가 되면 후드 아래에 사용하십시오.
6. PBS의 150 μL을 추가하고 다중 채널 파이펫으로 셀을 다시 일시 중지한 다음 6.2 단계를 반복합니다.
7. FC 수용체 차단 시약을 포함하는 FACS 버퍼 (PBS는 1 % BSA 또는 2 % FBS로 보충)의 25 μL에서 세포를 다시 중단합니다. 4°C에서 5분 동안 세포를 배양한다.
8. 표면 항체 칵테일의 25 μL을 추가합니다.
   참고: 항상 항체를 격자화하고 실험 전에 항체 패널을 최적화합니다.
9. 어둠 속에서 20 분 동안 실온에서 샘플을 배양하십시오.
10. 각 우물에 150 μL의 FACS 버퍼를 넣고 철저히 섞은 다음 6.2 단계를 반복합니다.
11. 반복 단계 6.10.
    참고: 옵션 A 또는 옵션 B. 사용 옵션 A를 사용하여 추가 단계를 수행하여 표면 마커로 셀을 얼룩지게 합니다. 옵션 B를 사용하여 세포 내 마커를 유동 세포측정에 의한 세포 내 마커를 연구합니다.
    1. 옵션 A의 단계는 다음과 같습니다.
       1. 100 μL에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 샘플을 재일시 중단하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
          주의: 후드 아래에서 PFA를 사용하십시오. PFA(예: 파이펫)와 안전하게 접촉한 PFA 폐기물/물체를 폐기하려면 안전 시트를 참조하십시오.
       2. 6.2 단계를 두 번 반복합니다.
          주의: PFA가 포함되어 있으므로 여기에 싱크대에 깜박여 버리지 마십시오. 파이펫으로 흡인하고 안전 시트에 따라 폐기물을 폐기하십시오.
       3. PBS의 200 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.
       4. 라벨이 부착된 FACS 튜브로 샘플을 전송하고 PBS의 100 μL을 위로 합니다. FACS 분석을 통해 처리될 때까지 튜브를 얼음이나 냉장고에 보관하십시오. 24시간 이내에 유동 사이토미터에서 샘플을 획득합니다.
    2. 옵션 B의 단계는 다음과 같습니다.
       1. 100μL의 고정/투과성용액(파라포름알데히드 포함)으로 시료를 재일시 중단하고 4°C에서 20분 동안 배양한다.
          주의: 후드 아래에서 PFA를 사용하십시오. PFA(예: 파이펫)와 안전하게 접촉한 PFA 폐기물/물체를 폐기하려면 안전 시트를 참조하십시오.
       2. 6.2 단계를 반복합니다.
          주의: PFA가 포함되어 있으므로 여기에 싱크대에 깜박여 버리지 마십시오. 파이펫으로 흡인하고 안전 시트에 따라 폐기물을 폐기하십시오.
       3. 1배 의 200 μL을 1배 의 충류/세척 버퍼를 넣고 잘 섞은 다음 6.2단계를 반복합니다.
       4. 반복 단계 6.11.2.3.
       5. 세포 내 염색을 위한 항체 혼합을 포함하는 항체 혼합을 포함하는 1x permeabilization/세척 완충제의 50 μL에서 고정 및 투과성 세포를 재중단합니다.
       6. 어둠 속에서 30 분 동안 4 °C에서 샘플을 배양하십시오.
       7. 1x 투과/ 세척 용액의 200 μL을 넣고 잘 섞은 다음 6.2 단계를 반복합니다.
       8. 반복 단계 6.11.2.7.
       9. PBS의 200 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.
       10. 라벨이 부착된 FACS 튜브로 샘플을 전송하고 PBS의 100 μL을 위로 합니다. FACS 분석을 통해 처리될 때까지 튜브를 얼음이나 냉장고에 보관하십시오. 24시간 이내에 유동 사이토미터에서 샘플을 획득합니다.
           참고: 이 프로토콜을 수행한 후 데시듀얼 셀 서스펜션은 FACS 분석을 수행할 준비가 되었습니다. 샘플당 가능한 한 많은 이벤트를 기록하는 것이 좋습니다. 적어도 1,000-3,000명의 부모 인구의 사건은 믿을 수 있는 결과를 달성하기 위하여 얻어져야 합니다.

자궁 류코낭의 단일 세포 현탁액을 얻기 위하여 기술되는 방법의 주요 단계는 도 3에 요약된다. 도 2B에서 입증된 것은 B6 마우스에서 g1 IlC의 3개의 하위 집합을 식별하는 데 사용되는 기본 FACS 게이팅 전략입니다: uILC1(CD49a⁺Eomes^-), trNK(CD49a⁺Eomes⁺), cNK(CD49a-Eomes⁺) 셀. 이러한 집단의 추가 분석은 g1 IlC의 다양한 표면 및 세포 내 마커를 연구하기 위해 수행 될 수있다. 예를 들어, IFN-ɣ 및 자가 MHC 수용체의 공동 발현은 항-NK1.1 항체를 통한 자극 후 uILC1, trNK 및 cNK 세포에서 평가될 수 있다(도 7).

연구 질문에 따라 프로토콜(도 3)과 항체 패널을 모두 조정할 수 있다. 중요 한 것은, g1 ILC 게이팅에 대 한 하나의 FACS 패널에 안티-NK1.1 및 안티 NKp46 항체를 모두 사용 하는 것이 좋습니다 (그림 2B 및 표 1). 혈액, 비장 또는 간에서 얻은 g1 ILC는 자궁 대응(도 8)보다 표면에 NKp46의 더 높은 발현을 가지고 있다는 점에 유의해야 한다. NK1.1의 표면 염색은 더 나은 분리를 제공하고 자궁 g1 IlC를 쉽게 게이트할 수 있게 합니다(그림 8). NKp46은 모든 마우스 균주에 의해 표현되지만, 항NK1.1 항체 PK136에 의해 인식되는 NKR-P1C 항원은 C57BL/6(즉, B6), FVB/N 및 NZB를 포함한 일부 마우스 균주에 의해서만 표현되지만 AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOJ, 1, DBA/2D, NOJ, 1, DBA/2D, 1, DBA/2D, NOJ, 1, DBA/2D, NOJJ, 1, DBA/2D, NOJJ, 1, DBA/2D, 1, DBA/2D, 1, DBA/2D, 1, DBA/2D, 1, DBA/2D, NOJ, SDJ, 또한, 조사자가 MHC 수용체 Ly49와 같은 중요한 NK 세포 수용체를 연구하려는 경우, 인간 킬러 세포 면역글로불린과 같은 수용체(KIR)의 높은 가변성을 회수하는 실험실 마우스 균주의 동종 변이를 인식하는 것이 중요하다. 더욱이, 세포가 기능적 분석을 위해 NK1.1로 자극될 경우, 김, S. 등.²⁰에 기술된 바와 같이, NKR-P1C 항원항이 교차연결 항NK1.1 또는 수용체 조절에 의해 점유될 수 있기 때문에 안티-NK1.1이 아닌 안티-NKp46로 세포를 얼룩지게 하는 것이 바람직할 수 있다. 수용체 점유 또는 다운 규제 중 자극하는 데 사용되는 동일한 항체로 얼룩을 방해할 수 있습니다.

효소 조직 해리의 일반적인 문제는 소화 매체에 사용되는 효소에 의해 세포에 표면 전형의 변경입니다. 예를 들어, MHC CD94:NKG2A 수용체에 대한 염색은 Liberase TM이 사용되는 경우 불량하다. 그러나, Liberase DH를 통한 소화는 16A11 항체 클론에 의한 NKG2A 인식을 보존한다(도 9). FACS 패널의 모든 전형에 효소의 영향을 확인하는 것이 좋습니다. 이를 위해, 기계적 해리에 의해 얻어진 마우스 비장세포의 현탁액을 사용하십시오(70 μm 스트레이너를 통해 전체 비장을 전달). 그 때 견본은 효소의 유무에 관계없이 매체를 가진 잠복식 에 선행된 2개 이상의 부분으로 나뉩니다.

앞에서 언급했듯이, 혈액 유래 세포는 조직 해리샘플에 존재한다. 필요한 경우, 혈액 오염 물질은 마소푸스 실험실에서 개발 된 바와 같이 내트라바스 내 염색 방법을 사용하여 제외 될 수있다²¹. 도 10 은 임신일 8.5에서 자궁 조직 샘플에 존재하는 g1 IlC의 약 6.5%가 혈액 유래임을 보여줍니다. 내래 염색에 사용되는 항 CD45 항체는 덤프 채널에 사용되는 플루오로크롬으로 공각될 수 있다; 이것은 여분의 형광 채널을 사용하지 않고 혈액 오염 물질을 제외합니다. 가장 일반적인 문제와 해당 솔루션은 표 2에 표시됩니다.

그림 1: 마우스 자궁의 단면. (A) 마우스 자궁 단면 (비 임신) 자궁을 채우는 다양한 모계 백혈구를 나타낸다. (B) 마우스 자궁 단면 (임신 일 8.5). (C) 마우스 자궁 단면 (임신 일 13.5). (D) 배반성 단계에서 인간 태반 형성에 비해 마우스의 비교. BioRender.com 만든 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 자궁 g1 ILC1. (A) 초기 생활 과 임신 중 마우스에서 자궁 cNK, ILC1 및 trNK의 백분율. W - 주, gd - 임신 일. 필리포비치, I. 외.⁴에서 수정된 그래프. (B) 유동 세포측정에 의한 자궁군 1 ILC 서브세트를 분석하는 게이팅 전략. 림프구는 임신 일 10.5에서 자궁 조직에서 격리되었다. 조직 소화는 Liberase TM을 함유하는 소화 배지를 사용하여 수행하였다. 세포는 빛을 산란하는 능력에 기초하여 문이 되었습니다. 이중은 FSC-A 대 FSC-H 플롯을 사용하여 제외되었고, CD45^+CD3-CD19-실행 가능한 세포만 더 분석하였다. CD45^+CD3-CD19-실행 가능한 셀 내에서, 그룹 1 ILC 게이트는 NK1.1⁺ NKp46⁺ 셀로 확인되었다. 그룹 1 ILC 내에서 CD49a-Eomes⁺ 기존 NK 셀(cNK), CD49a⁺Eomes⁺ 조직 거주자 NK 셀(trNK), CD49a⁺Eomes-uILC1 의 세 가지 하위 집합을 식별할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 프로토콜의 주요 단계에 대한 시각적 가이드입니다. (1) 임신한 자궁을 심술지방이 없는 해부한다. (2) 태아를 제거; 자궁을 5mL 튜브로 돌려보내 조직을 다진다. 효소 소화 단계를 진행하십시오: 각 샘플에 따뜻한 효소 소화 믹스 3mL를 추가합니다. 교반과 함께 37 °C에서 30 분 동안 5 mL 튜브를 배양합니다. (3) (i) 소화 후, 얼음 차가운 5mM EDTA PBS 용액의 10mL를 사용하여 15mL 튜브에 5mL 튜브의 모든 것을 플러시. (ii) 400 x g에서 10 분 동안 소화 된 조직을 포함하는 원심 분리기 15 mL 튜브. (iii) 상체를 폐기; 펠릿을 부드럽게 쓸어내고 10mL의 따뜻한 (37°C) 5m EDTA PBS 용액으로 재보설한다. (iv) 교반과 함께 37°C에서 15mL 튜브에서 시료를 배양하고, 15분 동안 멸균 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여, 70 μm 스트레이너를 통해 소화된 조직을 제대로 라벨이 부착된 50mL 튜브에 강제로 넣고 400x40x00x00에서 10분 동안 회전한다. (5) 스핀 후, 옵션 A (다이어그램에 여기에 표현) 또는 B. 옵션 A : 50 mL 튜브에서 상퍼를 버리고, 파이펫 소년을 사용하여, PBS에서 40 %(v / v) 등소 페르콜의 8 mL에서 각 펠릿을 다시 중단합니다. (6) (i) 옵션 A 계속: 느린 속도로 파이프 보이를 사용하여, 조심스럽게 80 % Percoll 솔루션의 5 mL에 40 % Percoll 용액에 다시 중단 펠릿을 오버레이. 파이펫은 천천히 지속적으로; 15mL 튜브를 45°의 각도로 유지합니다. (ii) 오버레이를 방해하지 않고, 15mL 튜브를 실온에서 20분 동안 850 x g의 원심분리하여 중간 가속과 느린 브레이크를 제공합니다. (7) 스핀 후, 최소량의 Percoll 용액(총 4~5mL)을 빨아들이려고 노력하면서 백혈구의 고리를 조심스럽게 수집한다. (8) 적혈구 리시스 단계를 수행합니다. (9) 트라이판 블루와 노이바우어 챔버를 사용하여 셀카운트. (10) 라운드 하단 96 웰 플레이트로 잘 당 1-2 백만 세포를 전송합니다. (11) 생존성 염료 및 항체 염색을 진행한다. (12) 마지막으로, 라벨이 부착된 FACS 튜브로 샘플을 전송합니다. 24시간 이내에 FACS 분석을 통해 처리될 때까지 튜브를 얼음이나 냉장고에 보관하십시오. BioRender.com 만든 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 질 플러그 (A) 및 그것의 부재 (B) C57BL/6 여성에서 0.5 일 포스트 짝짓기.

그림 5: 임신한 마우스로부터 자궁을 추출하기 위해 해부. (A) 댐은 70% 에탄올로 몸을 닦아 부드러운 보드에 바늘로 고정된다. 파란색 점선으로 표시된 두 개의 수직 절개는 만들어집니다. (B) 피부가 들어 올려 내부 장기를 노출합니다. 장 루프는 자궁을 시각화하기 위해 부드럽게 위로 이동됩니다. (C) 자궁은 각각 두 개의 파란색 점선과 파란색 화살표로 표시된 바와 같이 난소 옆과 자궁 경부에서 세 가지 지점에서 절단하여 샘플링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 단일 세포 현탁액의 준비. (A) 이식 부위에서 배아의 기계적 제거. (B) 퍼콜 그라데이션 오버레이; 상단 층에는 Percoll의 40%와 Percoll의 하단 층 80%의 단일 셀 서스펜션이 포함되어 있습니다. (C) 퍼콜링 그라데이션의 원심분리 후 림프구 고리 형성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 그룹 1 IlC를 가진 기능 분석의 대표적인 FACS 분석. 세포내 IFN-ɣ 및 표면 CD107a 검출은 자기 MHC(Ly49C, Ly49I 및 NKG2A)에 대한 NK 수용체를 발현하는 그룹 1 IlCs에서 검출되며, 그렇지 않은 것과 비교하여, NK1.1을 플레이트 바운드 항체와 교차링크한 후. 세포는 임신 일 9.5에 자궁 조직에서 격리되었습니다. 조직 소화는 Liberase DH를 함유하는 소화 배지를 사용하여 수행하였다. 4개의 사분면(corners)의 원시 값뿐만 아니라 자가 수용체가 없는 자가 및 응답자에 대한 수용체를 표현하는 세포 중 응답자의 상대적 백분율(굵은 숫자)이 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 안티 NKp46 및 항 NK1.1 항체를 가진 염색 비장 및 자궁 림프구. (A) 임신일 10.5에서 마우스 비장 및 (B) 자궁으로부터 얻은 세포 현탁액은 2개로 분리되었다; 한 부분은 NKp46-APC(빨간색)와 NK1.1-APC(파란색)로 염색되었습니다. 자궁 림프구의 NKp46 염색은 NKp46⁺ 및 NKp46^- 세포를 비장 림프구만큼 깔끔하게 분리하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 9: 소화 배지를 가진 배양에 의한 NKG2A MFI(항체 클론: 16A11)의 감소. C56BL/6 마우스 비장세포의 세포 현탁액은 3부분으로 나뉘었다. 한 부분은 리베라제 DH 소화 매체(0.13 WU/mL Liberase DH 및 DNAse의 30 μg/mL함유 HBS)에서 배양되었고, 또 다른 부분은 Liberase TM 소화 매체(HBSS 함유 0.52 WU/mL Liberase TM 및 30 μg/mL/ML)로 배양되었다. 세 번째 부분은 37°C에서 30분 동안 깔끔한 HBSS로 처리하였다. g1 IlC에 대한 NKG2A 마커의 발현은 유동 세포측정에 의해 평가되었다. 슈리브 N에서 가져온 그래프. 임신 중 자궁 NK 세포 억제의 역할 (테시스); 감독자: 콜루치 F, 2020. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 10: 혈액 유래 g1 IlC의 배제를 위한 항 CD45 항체를 가진 인트라바이탈 염색. 임신 일 8.5에서 C57BL/6 댐 마우스는 CD45-AF647의 3 μg와 정맥 주사 후 3 분 컬링되었다. 자궁, 전혈 및 흉부가 FACS 분석을 위해 수확되고 처리되었습니다. X축은 CD45-AF647로 정맥 염색으로부터 의 신호를 나타내고 Y축은 체외 염색 CD45-BUV395로부터 신호를 보여줍니다. 하위 채우기의 백분율은 사분면에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 기존의 5레이저 사이토미터용 FACS 패널의 예.

표 2: 문제 해결 가이드.

이 메서드에는 이후에 설명된 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 백혈구 인구의 상대적 빈도가 임신을 통해 변화함에 따라 다중 동기 임신을 얻는 것입니다. 같은 임신 일에 여러 댐을 갖는 것은 동일한 실험에서 생물학적 반복을 허용하거나 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 더 큰 숫자를 얻기 위해 개별 댐에서 림프구를 풀링 할 수 있습니다. 시간 조정된 짝짓기는 연구원이 24 시간 기간 안에 개념을 정확하게 찾아낼 수 있습니다. 마우스는 약 2.5 년 동안 살고 있지만, 그들은 6-8 개월까지 4-7 주에서 생식 연령이 될 것입니다. 젊은 마우스는 일반적으로 더 작은 새끼를 생성하기 때문에, 여성 마우스는 일반적으로 사이 6-8 주, 그리고 남성 마우스 사이 8-10 주 사이 때까지 교제되지 않습니다. 에스드루가 마우스에서 약 15시간 동안 지속되고 4-5일마다 발생한다는 점을 감안할 때, 일반적인 짝짓기 비율(질 플러그에 의해 드러난 그림 4 참조)은 약 25%입니다. 따라서 에스루에서 마우스를 사용하고 주어진 실험에 필요한 댐 수를 얻기에 충분한 숫자를 계획하는 것이 중요합니다. 에스루러스 사이클 단계는 질 얼룩 세포학²²에 의해 결정될 수 있다. 플러그 속도는 결합 하기 전에 48 시간 남성 휴식 하 고 휘튼 효과 활용 하 여 향상 될 수 있습니다¹⁸. 또는, 하나는 내인성 여포 자극 호르몬의 효과를 모방 임신 암말 혈청을 관리 할 수 있습니다, oocyte 성숙을 유도하고, 42-50 h후, 인간의 chorionic gonadotropin, 이는 내인성 황테인화 호르몬의 효과를 모방, 배반유도. 이 호르몬 치료는 estrus에 대한 요구 사항을 우회하고 거의 모든 치료 된 여성을 수용하게합니다.

두 번째 중요한 단계는 FACS 염색의 품질을 보장하는 것입니다. 유동 세포측정에 사용되는 항체는 항상 최적의 농도에서 적정화되고 사용되어야 하며, 효소 소화가 중요한 항원 성 전형을 갈라지지 않는다는 것을 확인해야 합니다. 효소가 에피토프를 갈라질지 여부를 평가하기 위해 동일한 샘플의 두 분획을 병렬로 얼룩지게 할 수 있으며, 하나는 효소와 다른 기계적 소화를 겪고 있습니다. 마찬가지로, 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 적절한 제어 및 단일 얼룩을 사용하는 것이 중요합니다. 드문 경우 비드를 사용하여 단일 얼룩 샘플을 생성할 수 있습니다. 전압을 설정하는 데 구슬을 사용하지 말고 림프구와 다른 백혈구를 포함하는 세포의 인구(예: 비장 세포와 같은)를 사용하는 것이 좋습니다. 구슬을 사용하는 경우 비드 염색을 위해 항체를 격자화할 필요가 있으므로 얼룩진 구슬의 형광 강도는 세포의 형광 강도와 비슷합니다. 특정 마커에 대한 음의 세포로부터 양성을 분리하는 어려움의 경우, FMO 제어는 특정 마커에 대한 게이팅을 용이하게하기 위해 사용될 수 있다. 세포 내 마커의 경우, 세포 내 염색으로 이소형 대조군이 잔류 되지 않는 항체를 초래할 수 있으므로, 세척 단계 후에도 세포 내에 존재하여 배경 신호를 증가시킬 수 있다. 시간이 지남에 따라 자가 형광이 크게 증가하고 일부 항체의 형광 강도가 시간이 지남에 따라 감소 할 수 있으므로 FACS 분석에 의해 페노티핑에서 최상의 결과를 얻기 위해 세포를 고정하는 24 시간 이내에 샘플을 실행하는 것이 좋습니다.

고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 프로토콜로 얻은 단일 셀 서스펜션의 다운스트림 적용입니다. 기능적 인 소의를 위해 멸균 조건에서 작업하는 것이 필수적입니다. 마찬가지로, 후속 omics 연구에 대 한, 멸 균 및 RNase에서 작동 하는 것이 중요 하다, DNase 및 protease 무료.

여기에 제시된 프로토콜은 phenotyping 그룹 1 ILC에 초점을 맞추고 있지만 항체 패널을 수정하여 다른 세포 유형을 표현하기 위해 적응될 수 있다. 모든 항체는 효소 치료에 의한 표면 전형의 손실/변경을 검출하기 위해 소화 및 비소화세포 현탁액에 대해 테스트되는 것이 좋습니다. 유사하게, 다른 효소는 조직을 소화하고 세포 수율을 증가시키기 위하여 이용될 수 있습니다, 그러나 중요한 항원 성 전형에 그것의 효력은 주의 깊게 공부되어야 합니다. NKp46은 비장 NK 세포에 대한 좋은 마커이며 실험실 마우스의 모든 균주에서 작동하지만, C57BL/6 마우스의 uNK 세포에 대한 NKp46의 발현은 비장 NK 세포보다 상당히 낮습니다. NK1.1과 NKp46 모두에 대해 동시에 염색하는 것이 가장 좋습니다. 여러 장기를 직접 비교해야 하는 경우, 비장이나 골수와 같은 조직에 효소 소화가 필요하지 않더라도 모든 샘플을 동등하게 치료하는 것이 좋습니다. 여기에 제시된 방법은 임신하지 않은 자궁에 적용가능하지만, 2상 Percoll 그라데이션에 의한 림프구 고리 절연은 어려울 것이며, 격리된 세포의 수율은 신뢰할 수 있는 FACS 분석을 위해 너무 낮을 수 있으므로 개별, 비임신 마우스²³의 자궁으로부터 분리된 세포를 함께 풀링해야 합니다.

데이터 해석을 고려해야 하는 프로토콜에는 제한이 있습니다. 그것은 모든 조직에 대 한 경우, 혈액에서 오는 순환 림프구 조직 거주자 세포와 함께 격리 될 것 이다. 순환 림프구의 배제가 데이터 해석에 필수적인 경우, 인트라바이탈염색은 순환 세포에 라벨을 붙이기 위해 수행될 수 있다. 더욱이, 프로토콜에 대한 두 번째 제한은 일부 세포가 조직으로부터 추출될 수 있는 것은 아니기 때문에 손실될 것이라는 것이다. 가장 일반적인 문제와 문제 해결은 표 2에 표시됩니다.

역사적으로, 조직에 있는 세포의 연구 결과는 조직 단면도의 조직학 검사에 의지했습니다. 산드라 필의 우수한 리뷰²⁴ 는 80 년대 후반까지 100 년 이상 수행 된 작업을 요약합니다. 나중에 uNK 세포로 알려진 세포의 설명은 실제로 림프구가 발견되기 전에 반세기 이상 간행된 원고에 나타납니다. 따라서, 1975년에 NK 세포의 발견하기 전에, uNK 세포는 모계 글리코겐 세포 또는 과립된 심방 동맥 세포로 표시되었습니다. 앤 크로이는 필드에서 큰 공헌을 해왔으며^{, 팀에 최적화한} 해부를 친절하게 가르쳤으며, 현재 사용됩니다. uNK 세포의 형태와 조직 위치를 설명하는 데 중요한 역할을 하지만, 고전적인 조직학적 검사는 관심 있는 세포에 대한 몇 가지 마커만 검출하는 것으로 제한됩니다. 2008년, 자궁 림프구상에 대한 다중 마커를 동시에 검출하는 유동 세포계 기반 방법이 설명되었다²⁶. 이것은 본질적으로 이 백서에 설명된 방법입니다. 질량 세포측정에 의한 공간 전사및 이미징과 같은 최근의 기술은 조직학과 유동 세포측정의 힘을 결합하여 각각 다중 유전자 또는 단백질의 동시 검출과 정상 조직 아키텍처의 보존을 가능하게 한다.

여기에 설명된 방법의 응용 은 다중 및 FACS 페노티핑, 기능 분석 (예 : ELISPOT, 탈과화 또는 세포 독성 분석서), 세포 분류 및 후속 전사학 또는 프로테오믹스를 포함한다. 이 방법에 기초하여 개발될 수 있는 추가 응용은 음의 고갈에 의한 세포 분류 또는 농축 후에 데시듀얼 NK 세포의 배양 및 확장을 포함한다. 현재, IL-2 또는 IL-12 및 IL-15를 첨가하여 7-14일 동안 재배 및 확장될 수 있는 인간 NK 세포와 유사한 방식으로 마우스 uNK 세포를 배양 및 확장하고 생존력과 기능을 장기간 보존하는 프로토콜이 없다. 마우스 uNK 셀에 대한 이러한 방법의 최적화는 기능적 인 애법을 수행 할 때 더 많은 유연성을 제공하고 더 높은 세포 수로 여러 조건을 테스트 할 수 있습니다. 한편, 문화 조건은 림프구의 독특한 표현형과 잠재적으로 그들의 기능을 수정하는 것으로 알려져 있다.

저자는 공개 할 것이 없으며 이해 상충이 없습니다.

장 마크 도이스네, 노먼 슈리브, 이바 필리포비치, 아니타 퀄스 등 이 방법을 개발하는 데 도움을 준 이전 팀과 현재 의팀원들에게 감사드립니다. 이 연구는 웰컴 신탁 [그랜트 수 200841/Z/16/Z]와 의학 연구 위원회(MR/P001092/1)에 의해 지원되었습니다. 공개 액세스를 위해 저자는 이 제출에서 발생하는 작성자 수락 원고 버전에 CC BY 공용 저작권 라이선스를 적용했습니다.