Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Gliomas são tumores cerebrais primários caracterizados por sua invasividade e heterogeneidade. Padrões histológicos específicos como pseudopalisades, proliferação microvascular, transformação mesenquimal e necrose caracterizam a heterogeneidade histológica de gliomas de alto grau. Nosso laboratório demonstrou que a presença de altas densidades de células mesenquimais, denominadas oncostreams, se correlacionam com a malignidade tumoral. Desenvolvemos uma abordagem única para entender os mecanismos que estão por trás do crescimento e da invasão de Glioma. Aqui, descrevemos um protocolo abrangente que utiliza microdissecção de captura a laser (LMD) e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial de mRNA de estruturas multicelulares heterogêneas intratumorais (ou seja, áreas mesenquimais ou áreas de invasão de tumor). Este método mantém boa histologia tecidual e integridade do RNA. Perfusão, congelamento, incorporação, secção e coloração foram otimizadas para preservar a morfologia e obter amostras de microdissecção a laser de alta qualidade. Os resultados indicam que a perfusão de camundongos portadores de glioma usando 30% de sacarose fornece boa morfologia e qualidade de RNA. Além disso, as seções de tumor de coloração com 4% de cresípia violeta e 0,5% de eosina resultam em boa coloração nuclear e celular, preservando a integridade do RNA. O método descrito é sensível e altamente reprodutível e pode ser utilizado para estudar a morfologia tumoral em vários modelos tumorais. Em resumo, descrevemos um método completo para realizar ODL que preserva a morfologia e a qualidade do RNA para sequenciamento para estudar as características moleculares de estruturas multicelulares heterogêneas dentro de tumores sólidos.

Gliomas são os tumores primários mais agressivos do sistema nervoso central. São altamente invasivos e heterogêneos¹. A análise dos componentes celulares e moleculares do tumor revelará novos alvos terapêuticos.

Entre os diferentes métodos disponíveis atualmente, a microdissecção de captura a laser (DLM) do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável que permite o isolamento de áreas anatômicas discretas ou populações celulares específicas de tecidos tumorais para estudar seu perfil molecular^2,3. O LMD permite a análise de perfis de expressão genética mRNA de células individuais selecionadas ou estruturas multicelulares^4,5. O LMD pode ser utilizado para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor. A melhoria no processamento dos tecidos tumorais é necessária para obter a resolução óptica ideal da morfologia tecidual e da qualidade do RNA⁶. Embora a fixação do paraformaldeído seja a melhor opção para a análise morfológica, a qualidade do RNA é afetada e degradada nessas condições, resultando em má qualidade do RNA para análise de RNA-seq. O uso de seções de tecido congelado evita a formação de cristais de gelo, que poderia quebrar membranas celulares e produzir buracos dentro das células, e continua sendo a melhor opção para a análise de RNA-Seq⁷.

Aqui, descrevemos um método otimizado de fixação e coloração de seção para processar tecidos tumorais cerebrais congelados para LMD. Para evitar que cristais de gelo se formassem no tecido, perfundamos camundongos com uma solução de 30% de sacarose. Esta solução interrompe as interações entre moléculas de água polar e impede a formação de cristais de gelo, preservando a morfologia tecidual. A coloração tecidual é necessária para diferenciar e obter população específica de células ou áreas anatomicamente distintas dentro do tumor. É essencial fixar e manchar o tecido com corantes inócuos para manter a integridade do RNA. Foi demonstrado anteriormente que o tecido de coloração com hematoxilina/eosina (H&E) deteriora a integridade do RNA⁸. Corrigimos e manchamos o tecido de juros com etanol, cresyl violeta 4% e eosiny y 0,5% soluções. Cresyl violeta é um corante acidofílico que mancha o núcleo celular com uma cor azul escuro. EosinY é um tine basofílico que mancha componentes básicos das células, proporcionando uma distinção entre citoplasma e outras estruturas celulares⁸. Ambos os corantes são solúveis em etanol e não deterioram a qualidade do RNA. Para evitar danos teciduais e manter alta resolução óptica das estruturas celulares, montamos as seções teciduais antes do LMD⁹.

Todos os métodos descritos aqui que utilizam animais experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Michigan.

NOTA: As neuroesferas glioma geradas a partir de um GEMM ou linhas estáveis podem ser usadas para enxerto de tumor intracraniano em camundongos¹⁰ e processadas para sequenciamento de LMD e RNA. Essas células expressam constitutivamente a luciferase de vagalume e as proteínas GFP, que serão ainda mais utilizadas para análise e localização do crescimento do tumor.

1. Geração de modelo de glioma de camundongos intracraniano a partir de neuroesferas derivadas de modelos de glioma geneticamente modificados

1. Para gerar uma cultura primária de células neurosferas a partir de um modelo de rato geneticamente modificado (GEMM), utilize o protocolo descrito anteriormente^10,11.
2. Prepare o meio de cultura da neurosfera como descrito: 500 mL dos suplementos de cultura neuronal De Dulbecco Modified Eagle F-12 (DMEM/F12) complementados com 10 mL de 50x B-27 e 5 mL de suplementos de cultura neuronal N-2 de 100x, 5 mL de 100x antibiótico-antimicocético e 1 mL de Normocin. Antes de emplacar as neuroesferas, adicione 20 ng/mL recombinantes humanos EGF e FGF ao meio de cultura.
3. Neuroesferas de glioma de cultura em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C e 5% de CO₂ por 2-3 dias antes do enxerto de tumor intracraniano.
4. No dia da cirurgia, colete as neuroesferas do glioma e gire-as a 550 x g por 5 min em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pelota celular.
5. Para dissociar as neuroesferas, resuspenda a pelota celular em 1 mL de solução de descolamento celular e incuba a 37 °C e 5% CO₂ por 2-4 min. Após o período de incubação, pipeta as neuroesferas para cima e para baixo com uma micropipete de 1 mL para garantir uma única suspensão celular.
6. Inativar a solução de descolamento celular diluindo a suspensão da neurosfera com 10 mL de mídia DMEM/F12 não suplementada. Gire as neuroesferas a 550 x g por 5 min em temperatura ambiente. Com cuidado, remova o sobrenadante.
7. Resuspender a pelota celular em 100 μL de mídia DMEM/F12 sem suplementos. Faça uma diluição de 1:50 da suspensão celular e adicione 50 μL de Trypan Blue para contar células viáveis. Use a seguinte fórmula para determinar a concentração das células:
   células/mL = [(((((),células contadas por quadrado) / # de quadrados contados) x 50 x 10.000 células/mL]
8. Depois de determinar a contagem celular, para alcançar uma concentração-alvo de 30.000 células/μL em volume de 100 μL, gire as neuroesferas para baixo e resuspenda-as no volume apropriado de DMEM/F12 sem suplementos.
9. Coloque as neuroesferas em um tubo pré-rotulado de 0,6 mL no gelo.
10. Preparar soluções de trabalho de anestesia, análgese e reversão da anestesia antes da implantação: Para a anestesia cetamina/dexmedetomidina, adicione 0,6 mL de 100 mg/mL de cloridrato de cetamina e 0,8 mL de 0,5 mg/mL de dexmedetomidina cloridrato a 8,6 mL estéril de 0,9% de NaCl contendo vial. Para analgésica buprenorfina, adicione 1 mL de 0,3 mg/mL de buprenorfina a 9 mL de 0,9% de NaCl contendo frasco. Para reversão da anestesia de atipamezol, adicione 1 mL de 5 mg/mL de atipamezol a 9 mL de 0,9% de NaCl contendo frasco.
11. Use camundongos fêmeas C57BL/6J de 6-8 semanas de idade para enxerto de tumor intracraniano.
12. Em uma sala aprovada para cirurgia de sobrevivência de roedores, configure suprimentos estéreis para enxerto de tumor intracraniano. Realizar cirurgias em uma estrutura estereotaxica de roedor equipada com uma seringa Hamilton esterilizada de 10 μL com uma agulha 33G removível. Utilize um esterilizador de abelhas para esterilizar ferramentas entre cirurgias.
13. Anestesios com uma única injeção intraperitoneal (i.p.) da solução anestéstica preparada na etapa 1.11 (cetamina:75,0 mg/kg e dexmedetomidina:0,5 mg/kg). Aproximadamente, um volume de 250 μL da solução anestésica será entregue a um mouse pesando 20 g. Certifique-se de que o mouse não responde ao reflexo do pedal antes de prosseguir.
14. Uma vez que o camundongo esteja em um estado profundamente anestesiado, aplique lubrificante oftálmico de petrolato estéril nos olhos para evitar a secagem. Raspe a pele do crânio do rato. Aplique 10% de solução tópica de povidone-iodo na área raspada para desinfetar.
15. Fixe o crânio do rato em uma moldura estereotática. Primeiro, abra cuidadosamente a boca com fórceps e puxe suavemente a língua e mova-a para um lado da boca para evitar engasgos. Mantenha a boca aberta com os fórceps e coloque os incisivos superiores no orifício da barra dentária na moldura estereotática.
16. Segurando a cabeça do rato pelas orelhas, coloque as barras de ouvido contra os ossos pós-orbitais e fixe-os. Certifique-se de que o crânio do rato está nivelado com a mesa cirúrgica. Fixar as barras das orelhas cuidadosamente não aplicando pressão contra o crânio. Em seguida, segure cuidadosamente a barra do nariz.
17. Usando uma lâmina de bisturi tamanho 15, faça uma incisão ao longo da cabeça do rato, expondo o crânio. Retraia a pele no local da incisão usando retráteis Colibri. Use um aplicador estéril para remover todo o tecido pericranial.
18. Identifique a brecha e abaixe a agulha da seringa Hamilton diretamente sobre ela. Com a moldura, posicione a agulha 1 mm anterior do bregma e 1,5 mm lateral. Usando uma agulha 26G, marque este ponto marcando o crânio.
19. Use uma broca de força sem fio equipada com uma broca de 0,45 mm para criar um orifício de rebarba no local alvo. Fure até atingir a dura-máter subjacente. Extrair cuidadosamente o osso restante no orifício de rebarba com uma agulha 26G.
20. Usando uma pipeta, homogeneize as células completamente e elabore 7 μL da suspensão da neurosfera na seringa. Para garantir que a seringa esteja funcionando corretamente, distribua 1 μL da suspensão em uma almofada 70% encharcada de álcool.
21. Abaixe a agulha para a superfície da dura-máter. Abaixe a seringa de 3,5 mm ventral e retraia 0,5 mm. Isso criará um espaço de 0,5 mm no cérebro para as neuroesferas depositarem quando injetadas.
22. Deixe a agulha no lugar por 2 min para o equilíbrio da pressão. Leve mente e suavemente 1 μL das células ao longo de 1 min. Permita que as células se acomodem por 6 min. Remova a seringa lentamente e suavemente do cérebro ao longo de 2 min.
23. Utilizando solução salina estéril, lave a superfície do crânio três vezes. Distribua o excesso de células na seringa em uma almofada de álcool de 70% e limpe a agulha com outra almofada de álcool de 70%. Enxágüe a seringa com PBS estéril para evitar entupimento da agulha.
24. Remova os retráteis e retire cuidadosamente o mouse da estrutura estereotática. Feche a incisão usando suturas de nylon 3-0, fórceps e um driver de agulha.
25. Administrar atipamezol (1,0 mg/kg), aproximadamente 100 μL para um mouse de 20 g. Administrar a buprenorfina (0,1mg/kg subcutânea) subcutâneamente, aproximadamente 70 μL para um rato de 20 g. Coloque os ratos pós-cirúrgicos em uma gaiola de recuperação limpa e monitore-os até ficarem alertas e ativos.

2. Perfusão animal e preservação cerebral

1. Para monitorar a progressão do tumor, determine a bioluminescência in vivo usando um sistema de imagem in vivo até que os animais apareçam sinais de sobrecarga tumoral. Eutanie camundongos quando atingem um sinal entre 10⁶ a 10⁷ fótons/s.
2. Anestesiar camundongos que apresentam sinais de carga tumoral com injeção intraperitoneal (i.p.) de cetamina (75,0mg/kg) e solução de dexmedetomidina (0,5 mg/kg). Entregar aproximadamente 250 μL a um rato pesando 20 g. Em seguida, certifique-se de que o mouse não responde ao reflexo do pedal.
3. Usando fórceps, segure a pele acima da cavidade peritoneal, e usando um grande par de tesouras de dissecção faça uma incisão "Y" penetrando na parede peritoneal, perfure o diafragma e, em seguida, corte a caixa torácica.
4. Insira uma cânula de 20G no ventrículo esquerdo do coração do rato. Em seguida, corte o átrio certo do coração para permitir a exsanguinação.
5. Permitir solução de Tyrode oxigenada (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glicose, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) para fluir através do sistema circulatório do camundongo até que o fígado e os pulmões tenham completamente limpo devido à remoção de sangue (~ 5 min).
6. Continue permeando o animal com 30% de solução de sacarose dissolvida na solução de Tyrode por mais 15 min. Para avaliar o sucesso da perfusão, confirme que o pescoço, cauda e pernas são rígidos após 30% de circulação de sacarose.
7. Usando uma pequena tesoura de dissecção, corte o couro cabeludo na linha média. Começando pelo osso occipital e trabalhando para a frente em direção ao focônho. Isso vai expor o crânio.
8. Usando um par de rongeurs, rompa o crânio começando pelo osso occipital e continue para a frente para expor totalmente as superfícies do cérebro. Em seguida, gire o lado da cabeça para cima e disseque os nervos na base do cérebro para liberá-lo do crânio.
9. Prepare a solução de sacarose de 30% com água livre de RNase e filtre-a através de um filtro de malha de nylon de 40 μm para reduzir a degradação do RNA.
10. Para maximizar a infiltração da solução de sacarose, coloque os cérebros dissecados em uma solução de sacarose de 30% e armazene-os a 4 °C durante a noite. Antes de mais processamento, certifique-se de que o cérebro atinja o fundo dos tubos que contêm a solução de sacarose.

3. Criopreservação de cérebros que abrigam tumores glioma

1. Antes de criopreservar o cérebro, prepare um frasco cheio de isopentano frio/2-metilbutano e coloque o frasco em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Deixe o solvente esfriar.
2. Remova o cérebro da solução de 30% de sacarose e enxugando-o em um papel filtro.
3. Rotular o criomolde com um marcador permanente. Cuidadosamente, adicione aproximadamente 5 mL de OCT (composto de temperatura de corte ideal) no centro do criomold evitando bolhas de ar.
4. Coloque o cérebro em criomold contendo OCT na orientação desejada. Encha o molde com OCT até que o cérebro esteja totalmente submerso. Usando fórceps limpos, coloque rapidamente o criomold com OCT e o cérebro no isopentane frio/2-metilbutano.
5. Uma vez que o ÓSSe se solidifique (~30-40 s), remova o criomolde com o cérebro e coloque-o em gelo seco. Não deixe o molde contendo o cérebro em 2-metilbutano passado 2 min, pois isso pode causar rachaduras em oct sólido. Envolva o criomold com o cérebro em papel alumínio e armazene-o a -80 °C.

4. Secção de tecidos tumorais cerebrais congelados

1. O naftalato de polietileno de 2 μm (PEN) desliza com as informações da amostra. As seções de tecido serão colocadas diretamente nestas lâminas após a secção.
2. Coloque a temperatura da câmara criostato entre -20 a -24 °C. Antes da secção, coloque o bloco de amostra na câmara criostato e deixe-o equilibrar-se à temperatura na câmara por 30-60 min.
3. Limpe a câmara de criostato e o suporte da faca com 100% de etanol e pulverize os pincéis a serem usados com solução de limpeza RNase. Trabalhando dentro da câmara criostato, remova o molde e anexe o bloco OCT contendo o cérebro ao disco da amostra criostato com OCT. Coloque o bloco no suporte do disco e alinhe o bloco com a lâmina da faca.
4. Instale uma lâmina descartável no suporte de secção.
5. Seção do cérebro a 10 μm de espessura. Certifique-se de que não há listras ou linhas de arranhão no tecido. Usando um pincel, achate e desenrole o tecido na superfície de corte.
6. Monte cuidadosamente o tecido que contém as seções cerebrais em lâminas de vidro PEN livres de RNase. Gire as lâminas de vidro carregadas positivas com os dedos em direção ao tecido e pressione suavemente o deslizamento de vidro para baixo em direção à seção de tecido.
   NOTA: A temperatura das mãos ajudará o tecido a se prender ao vidro.
7. Depois de montar as seções cerebrais nos slides, mantenha os slides em uma caixa dentro da câmara criostata e, em seguida, armazene-os a -80 °C. Nunca mantenha os slides em temperatura ambiente.
   NOTA: Dobrar o tecido e rasgar são comuns. Para uma análise posterior precisa, é importante minimizar esses artefatos.

5. Fixação e coloração de seções de tecido cerebral criopreservado

1. Para preservar a integridade do RNA, limpe todos os instrumentos a serem usados com solução de limpeza RNase. Proceda com o protocolo de fixação e coloração dentro de uma coifa de fumaça.
2. Prepare as soluções fixativas descritas em tubos de 50 mL livres de RNase limpos. Faça todas as soluções com água grátis RNase no dia da coloração.
3. No mesmo dia será realizada a microdissecção a laser, prepare 100%, 95%, 70% e 50% soluções de etanol. Mantenha as soluções em tubos bem fechados à temperatura ambiente.
4. Prepare 4% cresyl violeta e 0,5% eosin Y em solução de 75% de etanol. Vórtice a solução vigorosamente para 1 min e filtra-los através de um filtro de nylon de 0,45 μm para eliminar traços de pó não dissolvido.
5. Coloque o tecido desliza em um recipiente com 95% de etanol para 30 s. Transferir lâminas para o tubo contendo 75% de etanol; Deixe slides lá por 30 s.
6. Transfira os slides para 50% de etanol e deixe-os lá por 25 s. Neste ponto, o ÓC será dissolvido. Transfira o slide para 4% de solução violeta Cresyl para 20 s e, em seguida, transfira para 0,5% eosin Y solução para 5 s.
7. Tire o slide da solução de tintura e enxugar o slide seco com um papel filtro. Em seguida, coloque os slides em 50% de etanol para 25 s. Transfira os slides para 75% de etanol para 25 s. Transfira os slides para 95% de etanol para 30 s. Transfira os slides para 100% de etanol para 60 s.
8. Enxágüe o slide com xileno. Transfira-os para um recipiente com xileno e espere 3 min.
9. Prepare o meio de montagem (por exemplo, goma de ponto) em água sem RNase. Para montar as seções cerebrais do rato, diluir o meio de montagem em água livre de RNase a uma proporção de 1:10.
10. Seque os slides em uma superfície livre de RNase à temperatura ambiente por 10 s. Antes que o xileno seque, continue a montar as lâminas com as seções teciduais.
11. Disperse suavemente a solução de montagem em cima do tecido no slide com um pincel fino estéril e sem RNase. Espere 10-20 s, e então transfira imediatamente os slides de tecido para a plataforma de microdissecção do microscópio.
    NOTA: A proporção de água média de montagem para água livre de RNase utilizada para montagem varia dependendo do tecido de interesse. A relação entre o meio/água de montagem preserva a morfologia do tecido glioma para microdissecção a laser sem afetar a integridade do RNA.

6. Microdissecção de captura a laser

NOTA: Um microscópio de microdissecção de captura a laser precisa ser utilizado para microdissecção a laser de áreas específicas de interesse dentro do tecido tumoral. Para minimizar o tempo de microdissecção a laser tecidual, tenha o microscópio LMD preparado antes da fixação e coloração.

1. Para iniciar o sistema, primeiro ligue a tira de alimentação, seguido de ligar o laser. Em seguida, ligue o controlador de microscópio e o computador. Inicie o software LMD.
2. Sob o controle do microscópio,selecione a ampliação de 10x. Em controle a laser,defina os parâmetros do laser para dissecção de tecido. Defina uma freqüência laser de 120 Hz para obter melhores resultados de corte. Sempre coloque a corrente do laser em 100%.
3. Para uma microdissecção a laser precisa, ajuste a velocidade em 10 e uma configuração de abertura em 2,0-10,0 μm. Ajuste a potência para 53. Ter a potência do laser em um ajuste mais alto pode causar gravura de vidro.
4. Carregue o coletor de tecidos que capturará o tecido após a dissecção. Clique no segundo botão de descarga. Remova o coletor vazio e coloque os tubos de cabeça planas DNase/RNase livres de 0,5 mL PCR contendo 30 μL de tampão de lysis no coletor. Coloque o coletor de volta na máquina e clique em Continuar no software para prosseguir.
5. Carregue a amostra processada (fixa e manchada) no microscópio. Primeiro, clique em descarregar no software LMD. Em seguida, monte a amostra no suporte de slides e coloque o suporte de deslizamento no palco. Clique em Continuar no software para prosseguir.
6. Em Janelas de formas cortadas, selecione Draw + Cut. Use os controles do microscópio para encontrar a área de interesse. Desenhe a região de interesse (ROI) e selecione um tubo coletor de destino. É possível desenhar vários ROIs para micro dissecar áreas diferentes de um único slide ao mesmo tempo.
7. Clique em Iniciar corte para proceder à micro dissecção tecidual. Após a secção, retire os tubos de coletor do suporte e coloque os tubos em gelo seco. Transfira as amostras de tecido RNA coletadas para -80 °C para armazenamento a longo prazo.

7. Isolamento de RNA do tecido glioma microdisseca

1. Para a extração de RNA do LMD use um kit de isolamento de RNA otimizado para pequenas amostras e baixo rendimento de RNA (ver Tabela de Materiais). Siga as instruções de fabricação. Realize todas as etapas de isolamento à temperatura ambiente (25 °C). Para manter a qualidade do RNA, trabalhe rapidamente. Prepare todas as soluções conforme indicado pelo fabricante.
2. Ajuste o volume amostral para 350 μL com tampão de lyse com 1% β-mercaptoetanol. Vórtice a amostra para 40 s, a fim de reduzir a viscosidade da amostra e aumentar a eficiência da coluna de rotação de elução de RNA.
3. Transfira a totalidade da amostra para uma coluna de giro eliminador de gDNA colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar o tubo para 30 s a 8.000 x g. Guarde o fluxo e certifique-se de que nenhum líquido seja deixado na coluna após a centrifugação.
4. Adicione 350 μL de 70% de etanol ao fluxo e misture bem, pipetando para cima e para baixo. Transfira a amostra para uma coluna de rotação de elução de RNA colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa suavemente, e centrífuga para 15 s a 8.000 x g. Descarte o fluxo, salvando a coluna.
5. Adicione 700 μL de tampão de lavagem de RNA 1 (20% etanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) à coluna de rotação de elução de RNA. Feche a tampa suavemente e centrífuga por 15 s a 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de giro. Descarte o fluxo.
6. Após a centrifugação, remova cuidadosamente a coluna de rotação de elução de RNA do tubo de coleta para que a coluna não entre em contato com o fluxo.
7. Adicione 500 μL do segundo tampão de lavagem de RNA (etanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) à coluna de giro. Feche a tampa da coluna e gire 8.000 x g por 20 s para lavar a membrana da coluna. Descarte o fluxo.
8. Para lavar a coluna de elução de RNA, adicione 500 μL de 80% de etanol, feche a tampa da coluna e centrífuga a 8000 x g por 2 min. Jogue fora os tubos com a solução de elução.
9. Use um novo tubo de coleta, abra a tampa da coluna de giro e centrífuga a 8000 x g por 5 min para secar a coluna. Descarte o tubo de elução.
10. Coloque a coluna de rotação de elução de RNA em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 12 μL de água sem RNase aquecida a 37 °C diretamente ao centro da membrana da coluna de giro. Espere 4 min e centrífuga por 1 min a toda velocidade para eluir RNA.

8. Controle de qualidade do RNA, preparação da biblioteca e análise de RNA-Seq

1. Após a extração e purificação do RNA, amplie o RNA e crie uma biblioteca de cDNA usando um kit especial adequado para isolamento de RNA em concentrações pico-molar seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Siga as instruções do fabricante. Estação de trabalho limpa, a fim de evitar contaminação com outros produtos PCR e degradação de nuclease de amostras.
2. Se o RNA tiver um valor de RIN maior que 4, o que significa que o RNA é de boa qualidade ou apenas parcialmente degradado, proceda com a etapa de fragmentação. Prepare todos os itens no gelo.
3. Criar uma mistura mestre conforme indicado(Tabela 1). Crie uma mistura de reação em um tubo PCR de 0,2 mL sem nuclease. Incubar os tubos a 94 °C em um ciclotérmico de tampa quente. O tempo de incubação da fragmentação depende da qualidade do RNA. RIN ≥ 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Após a incubação, coloque os tubos em um refrigerador PCR que foi previamente resfriado a -20 °C e deixe-o sentar por 2 min.
5. Para cada tubo de amostra de RNA, prepare a primeira mistura mestre de reação de síntese de fios(Tabela 2). Incubar os tubos em um ciclotérmico de tampa quente nas condições descritas na Tabela 3. Os produtos cDNA podem ser congelados a -20 °C até duas semanas antes de seguir para a próxima etapa.
6. Crie o mix mestre PCR conforme indicado na Tabela 4. Coloque os tubos em um ciclador térmico de tampa quente e execute a reação de PCR sob as configurações indicadas na Tabela 5.
7. Deixe as contas, que serão usadas para purificar o DNA, para aquecer à temperatura ambiente. Uma vez aquecido, adicione 40 μL das contas a cada amostra. Vórtice os tubos para misturar e girar para baixo brevemente para coletar líquido na parte inferior do tubo. Deixe os tubos incubarem em temperatura ambiente por 8 min para permitir que o DNA se ligue às contas.
8. Coloque os tubos em um dispositivo de separação magnética e deixe-se sentar por cerca de 5 min, ou até que a solução fique completamente clara. Mantendo os tubos no dispositivo de separação, use uma pipeta para remover o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar as contas.
9. Mantendo os tubos no dispositivo de separação, adicione 200 μL de etanol recém-feito às contas para lavar sem perturbar as contas. Aguarde 30 s antes de remover os 80% de etanol. Repita este passo.
10. Gire brevemente os tubos e coloque os tubos de volta no dispositivo de separação. Remova qualquer resíduo de 80% de etanol sem perturbar as contas.
11. Deixe os tubos secarem com as tampas abertas por 5 min. Não deixe que fique mais tempo, pois as contas vão secar.
12. Mantendo os tubos no dispositivo de separação, adicione 52 μL de água sem nuclease para cobrir as contas. Remova os tubos do dispositivo de separação e a pipeta para cima e para baixo até que todas as contas estejam resuspensas. Incubar a 5 min em temperatura ambiente.
13. Coloque os tubos de volta no dispositivo de separação até que a solução fique clara, cerca de 1 min. Transfira 50 μL do sobrenadante resultante para os poços de uma tira de 8 poços. Adicione 40 μL de novas contas a cada amostra. Vórtice completamente para misturar. Permita que as contas se liguem ao DNA incubando à temperatura ambiente por 8 min.
14. Durante este período de incubação, comece a descongelar os componentes a serem utilizados para qualquer rRNA presente nas amostras. Uma vez descongelados, coloque-os no gelo. Além disso, pré-aqueça um ciclotérmico a 72 °C.
15. Coloque as amostras no dispositivo de separação magnética até que a solução se limpe (cerca de 5 min). Alíquota 1,5 μL de sondas por amostra para um tubo PCR refrigerado. Coloque o tubo no ciclatário térmico pré-aquecido sob as configurações de 72 °C para 2 min e 4 °C.
16. Mantendo os tubos de amostra no dispositivo de separação magnética, remova o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar as contas. Em seguida, adicione 200 μL de etanol recém-feito às contas para lavar sem perturbar as contas. Espere 30 s antes de remover o 80% de etanol. Repita este passo.
17. Gire brevemente os tubos e coloque os tubos de volta no dispositivo de separação. Remova qualquer resíduo de 80% de etanol sem perturbar as contas. Deixe os tubos secarem com as tampas abertas por 2 min. Não deixe ficar mais tempo, pois as contas vão secar.
18. Prepare a mistura mestre para todas as amostras combinando os seguintes componentes na ordem apresentada (Tabela 6).
19. Misture a mistura mestre por vórtice e adicione 22 μL da mistura às contas secas de cada amostra e misture completamente para resuspender. Deixe incubar em temperatura ambiente por 5 min.
20. Gire os tubos e coloque-os no dispositivo de separação magnética por 1 minuto ou até que as amostras fiquem claras. Transfira 20 μL do sobrenadante, sem perturbar as contas para novos tubos PCR. Coloque os tubos em um ciclotérmico pré-aquecido em configurações na Tabela 7.
21. Prepare uma mistura mestre pcr para reações suficientes para cada amostra. Adicione os seguintes componentes à mistura mestre na Tabela 8indicada . Adicione 80 μL da mistura mestre PCR a cada um dos tubos de amostra a partir da etapa 8.20 e coloque no ciclador térmico nas seguintes configurações(Tabela 9).
22. Permitir contas, que serão usadas para purificar o DNA, para aquecer à temperatura ambiente. Uma vez aquecido, adicione 100 μL das contas a cada amostra. Deixe os tubos incubarem em temperatura ambiente por 8 min para permitir que o DNA se ligue às contas.
23. Coloque os tubos em um dispositivo de separação magnética e deixe-se sentar por cerca de 5 min, ou até que a solução fique completamente clara.
24. Mantendo os tubos no dispositivo de separação, use uma pipeta para remover o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar as contas.
25. Mantendo os tubos no dispositivo de separação, adicione 200 μL de etanol recém-feito às contas para lavar sem perturbar as contas. Aguarde 30 s antes de remover os 80% de etanol. Repita este passo.
26. Resumidamente, gire os tubos e coloque os tubos de volta no dispositivo de separação. Remova qualquer resíduo de 80% de etanol sem perturbar as contas.
27. Deixe os tubos secarem com as tampas abertas por 5 min. Não deixe ficar mais tempo, pois as contas se carimarão demais. Pipeta 20 μL de Tris Buffer para a pelota seca. Retire o tubo do dispositivo de separação e misture completamente com uma tubulação para resuspender as contas. Deixe incubar em temperatura ambiente por 5 min.
28. Coloque os tubos no dispositivo de separação por 2 min ou até que a solução fique clara. Adquira o sobrenadante e transfira-o para novos tubos. Em seguida, armazene a solução coletada a -20 °C.
29. Verifique as bibliotecas finais que precisam para controle de qualidade e quantidade. Junte as amostras, agrupadas e seqüenciadas, conforme leituras de 50 nt de extremidade emparelhada, de acordo com os protocolos recomendados pelo fabricante.

Nosso laboratório gerou um modelo de rato geneticamente modificado (GEMMs) usando o sistema de transposase da beleza adormecida (Figura 1A). Este sistema incorpora alterações genéticas específicas no genoma de células progenitoras neurais em camundongos neonatais. Estas células progenitoras alteradas formam tumores de glioma endógenos. As sequências plasmáticas utilizadas para gerar os tumores foram: (1) pT2C-LucPGK-SB100X para Transposon & expressão da luciferase, (2) pT2-NRASSV12 para expressão NRAS, (3) pT2-shp53-GFP4 para knock-down p53 e expressão proteica GFP, e (4) pT2-shATRx-GFP4 para knock-down ATRX. Plasmídeos foram injetados no ventrículo lateral de filhotes neonatais de 1 dia de idade, conforme descrito anteriormente¹¹. A captação plasmídea e a formação de tumores foram monitoradas via sistema de imagem de bioluminescência in vivo. Uma vez que os camundongos portadores de tumores apresentavam sinais de carga tumoral, eles foram sacrificados. Os tumores foram usados para gerar culturas neurosferas ou diretamente criopreservados para o processamento de LMD (Figura 1A).

Culturas celulares iniciadas a partir do GEMM foram utilizadas para gerar um modelo de glioma traduzível(Figura 1B). As neuroesferas glioma derivadas dos tumores GEMM foram cultivadas e implantadas intracranialmente no estriado de camundongos imuno-competentes. As suspensões unicelulares obtidas da cultura das neuroesferas foram utilizadas para gerar tumores glioma por implantação intracraniana, conforme descrito anteriormente pelo nosso laboratório^10,,11,12. Esta metodologia permite a cuidadosa quantificação do número de células a serem implantadas por camundongo (30.000 células/1 μL/rato). Este protocolo permite a reprodutibilidade dos resultados entre diferentes implantações experimentais. No entanto, a implantação de neuroesferas pode ser uma opção alternativa para gerar tumores de glioma de camundongos e posterior análise de LMD e RNA-Seq. No entanto, este método é considerado mais preciso. A progressão do tumor foi monitorada pelo sistema de imagem de espectro de bioluminescência in vivo. Os camundongos que apresentavam sinais de carga tumoral foram transcardialmente perfundidos e o cérebro foi preservado criocrata para o processamento de LMD(Figura 1C).

As seções teciduais foram microdissecadas a laser para caracterizar a transcrição de estruturas multicelulares dentro de gliomas. Os procedimentos de perfusão, congelamento e incorporação descritos foram otimizados para preservar a morfologia tecidual e obter RNA de boa qualidade após a microdissecção a laser. Diferentes abordagens de perfusão foram avaliadas a fim de adquirir tecidos com morfologia superior e integridade do RNA (Tabela 10). Para dissecar as áreas de interesse, foi necessário colorir o tecido com corantes inócuos para RNA (Figura 2). Observou-se que a perfusão do camundongo com portador de tumor com solução de Tyrode por 5 min e, em seguida, 30% de sacarose por 15 min, seguida pelo armazenamento noturno do cérebro dissecado em 30% de sacarose preserva a morfologia e a integridade do RNA do tecido tumoral(Figura 3D). A perfusão com solução de sacarose de 30% impediu a formação de cristais de gelo dentro do tecido. Embora, a fixação do tecido paraformaldeído resultou em morfologia tecidual de alta qualidade, a integridade do RNA foi afetada negativamente(Figura 3B). Outras abordagens como a solução de Tyrode para 5 min ou a solução de Tyrode para 5 min + 30% solução de sacarose por 15 min(Figura 3A e C) não afetaram a qualidade do RNA. Nessas condições, os cérebros não foram preservados em 30% de sacarose durante a noite; observamos resolução reduzida na morfologia tecidual.

Realizamos várias técnicas de coloração seguidas pela análise de controle de qualidade de integridade do RNA. Observou-se que 4% de cresil violeta e 0,5% de eosina Y foram suficientes para identificar estruturas multicelulares glioma e manter a integridade do RNA. Cresyl violeta é um corante acidofílico que mancha o núcleo das células com uma cor azul escuro. Eosiny y é um tine basofílico que mancha componentes básicos das células.

Observou-se que se o tecido não fosse montado com meio de montagem, as seções ficavam desidratadas e a morfologia se deteriorava (Figura 4A). Para manter a morfologia tecidual de alta qualidade, montamos o tecido com meio de montagem. Observou-se que 15% do meio de montagem dissolvido em água (30 μL em 200 μL de água) manteve a morfologia tecidual de alta qualidade(Figura 4B).

Na Figura 5A,são mostradas áreas de heterogeneidade do glioma. As imagens foram adquiridas usando um microscópio de microdissecção de captura a laser que precede a dissecção. Linhas vermelhas retratam áreas com células mesenquimais abundantes (células alongadas). As linhas azuis retratam áreas sem células mesenquimais (células arredondadas) (Figura 5A, imagem média). A Figura 5B mostra imagens de áreas tumorais microdissecadas a laser (linhas vermelhas) e áreas normais de tecido cerebral (linhas azuis). A seleção de ROI é feita para dissecar áreas de interesse (Figura 5A e B, imagens inferiores). Podemos observar nessas imagens o sucesso na dissecção das áreas selecionadas.

A extração de RNA foi realizada por meio de kit comercial. Foi determinado que uma área total de tecido dissecado entre 2,5 x 10⁶ - 7 x 10⁶ μm² foi necessária para a extração de mRNA e preparação da biblioteca de CDNA para sequenciamento subsequente do RNA. O controle de qualidade do RNA determinou um RIN entre 6 e 7 no tecido glioma após a microdissecção a laser. Um RIN de 6 foi determinado para ser apropriado para a preparação da biblioteca de CDNA. Após a extração do RNA, um kit para isolamento de RNA em concentrações picomolar foi utilizado para gerar uma biblioteca de CDNA adequada para o sequenciamento da próxima geração.

Tabela 1: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Preparação do Master Mix para a etapa 8.3.

Tabela 2: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Preparação do Master Mix para a etapa 8.5.

Tabela 3: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Condições do termociclador para a etapa 8.5.

Tabela 4: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Preparação do Master Mix para a etapa 8.6.

Tabela 5: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Condições do termociclador para a etapa 8.6.

Tabela 6: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Preparação do Master Mix para a etapa 8.18.

Tabela 7: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Condições do termociclador para a etapa 8.20.

Tabela 8: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Preparação do Master Mix para a etapa 8.21.

Tabela 9: Controle de qualidade do RNA e preparação da biblioteca: Condições do termociclador para a etapa 8.21.

Tabela 10: Métodos para diferentes abordagens de perfusão.

Figura 1: Modelos de glioma de rato usados para microdissecção a laser. (A)A bela adormecida GEMM usada para desenvolver de novo glioma. As imagens mostram a progressão do tumor: (i) injeção de plasmídeos no ventrículo lateral de recém-nascidos, (ii) carga tumoral. (B) Geração de modelo de glioma transplantável utilizando culturas celulares glioma. Células neurosferas cultivadas a partir de GEMM são implantadas intracranialmente no estriado. (C) Representação da criosecção do cérebro embutida na orientação coronal após a perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação esquemática do método utilizado para colorir seções de tecido preservadas criopreservadas com Cresyl violeta e Eosin. Slides utilizados para coloração foram manuseados com ferramentas limpas com água sem RNase. Todas as soluções foram preparadas com água livre RNase/DNase no dia da coloração. Cresyl violeta manchas núcleos violeta e eosiny manchas de citoplasma rosa. Os corantes foram dissolvidos em 70% de etanol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação de várias abordagens de perfusão para preservar a morfologia tecidual e a integridade do RNA. As imagens de H&E representam a morfologia comparativa do tecido cerebral que foi submetida à perfusão sob diferentes métodos: (A) A solução de Tyrode por 15 min, (B) Solução de Tyrode para 5 min, 4% PFA por 10 min, (C) Solução de Tyrode para 5 min, 30% sacarose por 15 min, e(D) Solução de Tyrode para 5 min, 30% sacarose por 15 min com imersão durante a noite em 30% de sacarose. A avaliação da qualidade do RNA é exibida para cada método de perfusão. As parcelas retratam picos de rRNA de 18 e 28 e o pico inicial do marcador. A razão de rRNA de 18s e 28 s é usada para determinar a qualidade do RNA. Uma imagem em gel dos fragmentos de RNA é exibida à direita das parcelas. A qualidade do RNA foi avaliada utilizando-se os valores de RIN. A qualidade do RNA foi alta nos métodos A, C e D. A morfologia tecidual foi superior nos métodos C e D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas do tecido glioma montado e não montado. (A) Imagens representativas de tecidos manchados com H&E. Este tecido foi deixado desmontado e ficou desidratado exibindo má morfologia com fraturas no tecido. (B) Imagens representativas de tecidos manchados com H&E e montados com meio de montagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens representativas do tecido glioma usado para microdissecção a laser. (A-B) Imagens representativas de tecidos manchados com H&E e áreas de estruturas multicelulares selecionadas para LMD. ( A)À esquerda, foram selecionadas áreas de células alongadas (vermelhas) e áreas de controle (azul) para LMD. (B)À direita, foram selecionadas áreas de invasão coletiva (vermelha) e áreas de controle (azul). (C) Controle de qualidade representativo do RNA para áreas microdisseced a laser. Uma área total de 6,5 x 10⁶ μm² foi microdisseccada. A análise mostra concentração de RNA de 2.346 pg/μL e Número de Integridade de RNA (RIN): 6,8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade e invasão do glioma são de importância crítica para descobrir novos alvos terapêuticos¹³. Neste manuscrito, descrevemos um método detalhado e otimizado para analisar a paisagem molecular da heterogeneidade e invasão de glioma usando microdissecção de captura a laser (LMD) seguida de análise transcritiva.

A microdissecção de captura a laser (DMD) pode ser usada para identificar diferentes áreas ou células únicas dentro do tumor, fornecendo uma amostra específica para analisar melhor o padrão molecular mantendo o contexto espacial do tumor¹⁴. Esta técnica é confiável e de baixo preço em comparação com outros métodos utilizados para analisar o transcriptome espacial em tumores sólidos¹⁵. Analisamos a heterogeneidade e invasão de glioma em modelos de tumor de camundongos geneticamente modificados ou modelos implantáveis intracranianos usando LMD. Estes modelos recapitulam as características mais marcantes dos gliomas humanos, permitindo o estudo da heterogeneidade e invasão do glioma^10,12.

Manter a morfologia do tecido tumoral de alta qualidade e a integridade do RNA é uma das limitações para o LMD. Para melhorar a morfologia tecidual, perfundimos camundongos com a solução de Tyrode por 5 minutos, seguidos de 30% de sacarose dissolvida na mesma solução. Uma vez que o cérebro foi dissecado, preservamos-o em 30% de sacarose dissolvida em água livre de RNase/DNase durante a noite ou até que o cérebro chegasse ao fundo do recipiente de armazenamento. Essas etapas melhoram significativamente a morfologia do tecido e reduziram a formação de cristais de gelo no tecido durante a criopreservação. Embora o tecido glioma humano não tenha sido utilizado para este protocolo, a incubação de amostras humanas em solução de sacarose de 30% da noite para o dia pode ser uma metodologia viável para melhorar a morfologia criosessecção. Outra possível limitação para o LMD é a preservação da integridade do RNA após a coloração⁸. Embora outras equipes de pesquisa tenham realizado microdissecção a laser no tecido glioma seguido da análise RNA-seq, elas não ilustram nenhum RNA e/ou morfologia nem comentam sobre a qualidade morfológica, ou controles particulares para as seções congeladas glioma¹⁶. Neste protocolo, a identificação morfológica precisa foi essencial para microdissecção a laser de estruturas macrocelulares precisas dentro de gliomas. Observou-se que a fixação do tecido glioma com solução de etanol e a coloração com 4% de Cresyl violeta e 0,5% de eosina Y dissolvida na qualidade de RNA mantida pelo etanol e possibilitou a identificação microscópica de células únicas e estruturas multicelulares. Demonstramos que a montagem de seções de glioma com solução de montagem é um passo crítico que evita a fissura e a formação de fissuras no tecido. Observe que o meio de montagem precisa ser preparado na água, pois usar o meio de montagem dissolvido em etanol resultará em morfologia tecidual ruim. A microdissecção a laser deve ser realizada o mais rápido possível em um ambiente livre de RNase. Também recomendamos a secção de até 2,5 x 10⁶ μm² área total de tumor/tecido, a fim de obter quantidades adequadas de RNA, tanto para controle de qualidade de RNA quanto para análise transcriômica.

O LMD permite a análise das vias de sinalização molecular que regulam a heterogeneidade e a invasão do glioma. Esta análise poderia revelar novos potenciais alvos para diagnóstico, prognóstico e desenvolvimento translacional futuro em modelos de glioma pré-clínicos.

Todos os autores deste artigo não declaram conflitos potenciais de interesse.

O trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, (NIH/NINDS) Subsídios: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subsídios R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; o Departamento de Neurocirurgia, O Centro de Câncer rogel na Universidade de Michigan, ChadTough Foundation, e Leah's Happy Hearts Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 para M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) grant, Projeto F049768 para A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, um Prêmio Médico-Cientista de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Inc. (RPB), subvenção R01 EY022633 do NEI do NIH (AK), e uma subvenção irrestrita da RPB para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais. Esta pesquisa utilizou o Vision Research Core (P30 EY007003) e o Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK é apoiada pelo Prêmio Acadêmico Emergente Mrs. William Davidson do A. Alfred Taubman Medical Research Institute.