Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Los gliomas son tumores cerebrales primarios caracterizados por su invasividad y heterogeneidad. Patrones histológicos específicos como pseudopalisades, proliferación microvascular, transformación mesenquimal y necrosis caracterizan la heterogeneidad histológica de los gliomas de alto grado. Nuestro laboratorio ha demostrado que la presencia de altas densidades de células mesenquimales, llamadas oncostreams, se correlacionan con la neoplasia tumoral. Hemos desarrollado un enfoque único para entender los mecanismos que subyacen al crecimiento y la invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo integral que utiliza microdisección de captura láser (LMD) y secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de estructuras multicelulares heterogéneas intratumorales (es decir, áreas mesenquimales o áreas de invasión tumoral). Este método mantiene una buena histología tisular y la integridad del ARN. La perfusión, la congelación, la incrustación, la seccionamiento y la tinción se optimizaron para preservar la morfología y obtener muestras de microdisección láser de alta calidad. Los resultados indican que la perfusión de ratones portadores de glioma utilizando 30% de sacarosa proporciona una buena morfología y calidad de ARN. Además, la tinción de secciones tumorales con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina da como resultado una buena tinción nuclear y celular, preservando al mismo tiempo la integridad del ARN. El método descrito es sensible y altamente reproducible y se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral en varios modelos tumorales. En resumen, describimos un método completo para realizar LMD que preserva la morfología y la calidad del ARN para la secuenciación para estudiar las características moleculares de las estructuras multicelulares heterogéneas dentro de tumores sólidos.

Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central. Son altamente invasivos y heterogéneos¹. El análisis de los componentes celulares y moleculares del tumor revelará nuevas dianas terapéuticas.

Entre los diferentes métodos disponibles actualmente, la microdisección de captura láser (LMD) del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y fiable que permite el aislamiento de áreas anatómicas discretas o poblaciones celulares específicas de los tejidos tumorales para estudiar su perfil molecular^2,,3. LMD permite el análisis de perfiles de expresión génica mRNA de células individuales seleccionadas o estructuras multicelulares^4,5. LmD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico en profundidad sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión del tumor. La mejora en el procesamiento de los tejidos tumorales es necesaria para obtener una resolución óptica óptima de la morfología tisular y la calidad del ARN^6. Aunque la fijación de paraformaldehído es la mejor opción para el análisis morfológico, la calidad del ARN se ve afectada y degradada en estas condiciones, lo que resulta en una mala calidad del ARN para el análisis de ARN-seq. El uso de secciones de tejido congelado evita la formación de cristales de hielo, que podrían romper las membranas celulares y producir agujeros dentro de las células, y sigue siendo la mejor opción para el análisis de ARN-Seq⁷.

Aquí, describimos un método optimizado de fijación y tinción de sección para procesar tejidos tumorales cerebrales de ratón congelados para LMD. Para evitar que se formen cristales de hielo en el tejido, perfundimos ratones con una solución de 30% de sacarosa. Esta solución interrumpe las interacciones entre las moléculas de agua polar y evita la formación de cristales de hielo, preservando la morfología del tejido. La tinción de tejido es necesaria para diferenciar y obtener población específica de células o áreas anatómicamente distintas dentro del tumor. Es esencial fijar y manchar el tejido con colorantes inocuos para mantener la integridad del ARN. Se ha demostrado previamente que la tinción de tejido con hematoxilina/eosina (H&E) deteriora la integridad del ARN⁸. Fijamos y tiñimos el tejido de interés con etanol, Cresyl violeta 4% y eosina Y 0.5% soluciones. Cresyl violeta es un tinte acidofílico que tiñe el núcleo celular con un color azul oscuro. EosinY es un tinte basófilo que tiñe los componentes básicos de las células, proporcionando una distinción entre el citoplasma y otras estructuras celulares^8. Ambos tintes son solubles en etanol y no deterioran la calidad del ARN. Para evitar daños tisulares y mantener una alta resolución óptica de las estructuras celulares, montamos las secciones de tejido antes de LMD^9.

Todos los métodos descritos aquí que utilizan animales experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan.

NOTA: Las neuroesferas de Glioma generadas a partir de un GEMM o líneas estables se pueden utilizar para el injerto de tumor intracraneal en ratones¹⁰ y procesarse para la secuenciación de LMD y ARN. Estas células expresan constitutivamente la luciferasa de la luciérnaga y las proteínas GFP, que se utilizarán aún más para el análisis del crecimiento tumoral y la localización.

1. Generación de modelo de glioma de ratón intracraneal a partir de neuroesferas derivadas de modelos de glioma genéticamente modificados

1. Para generar un cultivo primario de células de la neuroesfera a partir de un modelo de ratón genéticamente diseñado (GEMM), utilice el protocolo descrito anteriormente^10,11.
2. Preparar el medio de cultivo de la neurosfera como se describe: 500 mL de Medio águila modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) complementado con 10 mL de 50x B-27 y 5 mL de 100x N-2 suplementos de cultivo neuronal, 5 mL de 100x Antibiótico-Antimético, y 1 mL de Normocin. Antes de enchapar las neuroesferas, agregue 20 ng/ml de EGF recombinante humano y FGF al medio de cultivo.
3. Cultivo de neuroesferas de glioma en una incubadora de cultivos de tejidos a 37 oC y 5% de CO₂ durante 2-3 días antes del injerto tumoral intracraneal.
4. El día de la cirugía, recoger las neuroesferas del glioma y girarlas a 550 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
5. Para disociar las neuroesferas, resuspenda el pellet celular en 1 ml de solución de desprendimiento celular e incuba a 37oC y 5%_CO2 durante 2-4 min. Después del período de incubación, pipetear las neuroesferas hacia arriba y hacia abajo con un micropipeta de 1 ml para asegurar una suspensión de una sola célula.
6. Inactivar la solución de desprendimiento celular diluyendo la suspensión de la neurosfera con 10 ml de medios DMEM/F12 no suplementados. Gire las neuroesferas a 550 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Con cuidado, retire el sobrenadante.
7. Resuspenda el gránulo celular en 100 ml de medios DMEM/F12 sin suplementos. Haga una dilución 1:50 de la suspensión celular, y luego agregue 50 éL de Trypan Blue para contar células viables. Utilice la siguiente fórmula para determinar la concentración de celdas:
   cells/mL á [(células contadas por cuadrado) / á de los cuadrados contados) x 50 x 10.000 celdas/ml]
8. Después de determinar el recuento de células, para lograr una concentración objetivo de 30.000 células/ L en un volumen de 100 l, gire las neuroesferas hacia abajo y resuspenda en el volumen adecuado de DMEM/F12 que no contenga suplementos.
9. Coloque las neuroesferas en un tubo pre-etiquetado de 0,6 ml sobre hielo.
10. Preparar soluciones de trabajo de anestesia, analgésico y reversión de la anestesia antes de la implantación: Para la anestesia de ketamina/dexmedetomidina, agregue 0,6 ml de 100 mg/ml de clorhidrato de ketamina y 0,8 ml de 0,5 mg/ml de hidrocloruro de dexmedetomidina a un vial estéril de 8,6 ml de NaCl de 0,9%. Para buprenorfina analgésica, añadir 1 ml de 0,3 mg/ml de buprenorfina a 9 ml de 0,9% de NaCl que contiene el vial. Para la reversión de la anestesia con atipamezol, agregue 1 ml de 5 mg/ml de atipamezol a 9 ml de 0,9% de NaCl que contiene el vial.
11. Use ratones hembra C57BL/6J de 6-8 semanas de edad para el injerto de tumor intracraneal.
12. En una sala aprobada para la cirugía de supervivencia de roedores, establezca suministros estériles para el injerto de tumor intracraneal. Realice cirugías en un marco estereotaxócico de roedores equipado con una jeringa Hamilton esterilizada de 10 l con una aguja extraíble de 33G. Utilice un esterilizador de cuentas para esterilizar herramientas entre cirugías.
13. Anestetizar ratones con una sola inyección intraperitoneal (i.p.) de la solución anestésica preparada en el paso 1.11 (ketamina:75,0 mg/kg y dexmedetomidina:0,5 mg/kg). Aproximadamente, un volumen de 250 l de la solución anestésica se entregará a un ratón con un peso de 20 g. Asegúrese de que el ratón no responde al reflejo del pedal antes de continuar.
14. Una vez que el ratón esté en un estado profundamente anestesiado, aplique lubricante oftálmico de petrolato estéril en los ojos para evitar el secado. Afeitar el pelaje en el cráneo del ratón. Aplicar 10% de solución tópica de povidona-yodo en la zona de afeitado para desinfectar.
15. Asegure el cráneo del ratón en un marco estereotáctico. Primero, abre cuidadosamente la boca con fórceps y tira suavemente de la lengua y muévela a un lado de la boca para evitar que te atragantes. Mantenga la boca abierta con los fórceps y coloque los incisivos superiores en el ojo de la cerradura de la barra de dientes en el marco estereotáctico.
16. Sosteniendo la cabeza del ratón por las orejas, coloque las barras de las orejas contra los huesos postorbitales y asegúrelos. Asegúrese de que el cráneo del ratón esté nivelado con la mesa quirúrgica. Asegure las barras de los oídos cuidadosamente sin aplicar presión contra el cráneo. A continuación, asegure cuidadosamente la barra nasal.
17. Usando una hoja de bisturí talla 15, haga una incisión a lo largo de la cabeza del ratón, exponiendo el cráneo. Retraiga la piel en el lugar de la incisión utilizando retractores Decolibri. Utilice un aplicador estéril para eliminar todo el tejido pericraneal.
18. Identifique el bregma y baje la aguja de la jeringa de Hamilton directamente sobre ella. Con el marco, coloque la aguja 1 mm antes del bregma y 1,5 mm lateral. Usando una aguja 26G, marca este lugar anotando el cráneo.
19. Utilice un taladro eléctrico inalámbrico equipado con una broca de 0,45 mm para crear un orificio de rebaba en el sitio de destino. Taladre hasta alcanzar la dura mater subyacente. Extraiga cuidadosamente el hueso restante en el orificio de la rebaba con una aguja de 26G.
20. Con una pipeta, homogeneizar las células a fondo y extraer 7 l de la suspensión de la neuroesfera en la jeringa. Para asegurarse de que la jeringa funciona correctamente, dispensar 1 l de la suspensión en una almohadilla empapada en alcohol al 70%.
21. Baje la aguja a la superficie de la dura mater. Baje la jeringa 3,5 mm ventral y retraiga 0,5 mm. Esto creará un espacio de 0,5 mm en el cerebro para que las neuroesferas se depositen cuando se inyectan.
22. Deje la aguja en su lugar durante 2 minutos para el equilibrio de presión. Entrega lenta y suavemente 1 l de las células en el transcurso de 1 min. Deje que las células se asienten durante 6 minutos. Retire la jeringa lentamente y suavemente del cerebro en el transcurso de 2 min.
23. Usando solución salina estéril, lave la superficie del cráneo tres veces. Dispensar el exceso de células en la jeringa en una almohadilla de alcohol 70%, y limpiar la aguja con otro 70% almohadilla de alcohol. Enjuague la jeringa con PBS estéril para evitar la obstrucción de la aguja.
24. Retire los retractores y saque cuidadosamente el ratón del marco estereotáctico. Cierre la incisión con suturas de nylon 3-0, fórceps y un controlador de aguja.
25. Administrar atipamezol (1,0 mg/kg), aproximadamente 100 l para un ratón de 20 g. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg por vía subcutánea) por vía subcutánea, aproximadamente 70 l para un ratón de 20 g. Coloque ratones postquirúrgicos en una jaula de recuperación limpia y monitorícelos hasta que estén alerta y activos.

2. Perfusión animal y preservación cerebral

1. Para controlar la progresión tumoral, determine la bioluminiscencia in vivo utilizando un sistema de imágenes in vivo hasta que los animales muestren signos de carga tumoral. Eutanizar ratones cuando alcanzan una señal entre 10⁶ a 10⁷ fotones/s.
2. Anestetizar ratones que muestran signos de carga tumoral con inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (75,0 mg/kg) y dexmedetomidina (0,5 mg/kg) solución. Entregue aproximadamente 250 ml a un ratón que pese 20 g. A continuación, asegúrese de que el ratón no responde al reflejo del pedal.
3. Usando fórceps, sostenga la piel por encima de la cavidad peritoneal, y usando un gran par de tijeras de disección hacer una incisión "Y" penetrando la pared peritoneal, perforar el diafragma, y luego cortar la caja torácica.
4. Inserte una cánula contundente de 20G en el ventrículo izquierdo del corazón del ratón. Luego retorzcan la aurícula derecha del corazón para permitir la exsanguinación.
5. Permitir la solución oxigenada de Tyrode (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glucosa, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) para fluir a través del sistema circulatorio del ratón hasta que el hígado y los pulmones se hayan despejado por completo debido a la eliminación de sangre (5 min).
6. Continúe perfundiendo el animal con una solución de sacarosa del 30% disuelta en la solución de Tyrode durante 15 minutos adicionales. Para evaluar el éxito de la perfusión, confirme que el cuello, la cola y las piernas son rígidos después de la circulación de sacarosa del 30%.
7. Usando un pequeño par de tijeras de disección, corta el cuero cabelludo en la línea media. Comenzando en el hueso occipital y trabajando hacia adelante hacia el hocico. Esto expondrá el cráneo.
8. Usando un par de rongeurs, romper a través del cráneo comenzando en el hueso occipital y continuar hacia adelante para exponer totalmente las superficies del cerebro. Luego gira el lado de la cabeza hacia arriba y disecciona los nervios en la base del cerebro para liberarlo del cráneo.
9. Prepare una solución de sacarosa del 30% con agua libre de RNase y filtre a través de un filtro de malla de nylon de 40 m para reducir la degradación del ARN.
10. Para maximizar la infiltración de la solución de sacarosa, coloque los cerebros diseccionados en una solución de sacarosa del 30% y guárdelos a 4 oC durante la noche. Antes de un procesamiento posterior asegúrese de que el cerebro llegue a la parte inferior de los tubos que contienen la solución de sacarosa.

3. Criopreservación de cerebros que albergan tumores de glioma

1. Antes de criopreservar los cerebros, preparar un frasco lleno de isopentano frío/2-metilbutano y colocar el frasco en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Deje que el disolvente se enfríe.
2. Retire el cerebro de la solución de sacarosa al 30% y seque en un papel de filtro.
3. Etiquete el criomold con un marcador permanente. Con cuidado, agregue aproximadamente 5 ml de OCT (compuesto de temperatura de corte óptimo) en el centro del criomold evitando las burbujas de aire.
4. Coloque el cerebro en criomold que contenga OCT en la orientación deseada. Llene el molde con OCT hasta que el cerebro esté completamente sumergido. Usando fórceps limpios, coloque rápidamente el criomold con OCT y el cerebro en el isopentano frío/2-metilbutano.
5. Una vez que el OCT se solidifique (30-40 s), retire el criomold con el cerebro y colóquelo en hielo seco. No deje el molde que contiene el cerebro en 2-metilbutano más allá de 2 min ya que esto puede causar grietas en OCT sólido.

4. Seccionar los tejidos tumorales cerebrales congelados

1. Etiquetar 2 m de polietilenenucato (PEN) con la información de la muestra. Las secciones de tejido se colocarán directamente en estas diapositivas después de la sección.
2. Ajuste la temperatura de la cámara de criostato entre -20 y -24 oC. Antes de seccionar, coloque el bloque de muestra en la cámara de criostato y déjelo equilibrar a la temperatura en la cámara durante 30-60 min.
3. Limpie la cámara de criostato y el portacuchillas con 100% de etanol y rocíe los cepillos que se utilizarán con la solución de limpieza RNase. Trabajando dentro de la cámara de criostato, retire el molde y conecte el bloque OCT que contiene el cerebro al disco de la muestra de criostato con OCT. Coloque el bloque en el soporte del disco y alinee el bloque con la cuchilla.
4. Instale una cuchilla desechable en el soporte de sección.
5. Secciona el cerebro a 10 m de espesor. Asegúrese de que no haya rayas o líneas de arañazos en el tejido. Usando un pincel, aplanar y desenrosque con precaución el tejido sobre la superficie de corte.
6. Monte cuidadosamente el tejido que contiene las secciones cerebrales en diapositivas de vidrio PEN libres de RNase. Voltear los deslizamientos de vidrio cargado positivo con los dedos en dirección del tejido y presionar suavemente el vidrio deslizarse hacia abajo hacia la sección de tejido.
   NOTA: La temperatura de las manos ayudará a que el tejido se adhiera al vidrio.
7. Después de montar las secciones del cerebro en las diapositivas, mantenga las diapositivas en una caja dentro de la cámara de criostato y luego guárdelas a -80 oC. Nunca mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente.
   NOTA: El plegado del tejido y el desgarro son comunes. Para un análisis posterior preciso, es importante minimizar estos artefactos.

5. Fijación y tinción de secciones de tejido cerebral crioconservado

1. Para preservar la integridad del ARN, limpie todos los instrumentos que se utilizarán con la solución de limpieza RNase. Proceda con el protocolo de fijación y tinción dentro de una campana de humo.
2. Prepare las soluciones fijativas descritas en tubos limpios libres de RNase de 50 ml. Haga todas las soluciones con agua libre de RNase el día de la tinción.
3. El mismo día que se realizará la microdisección láser, preparar soluciones de etanol al 100%, 95%, 70% y 50%. Mantenga las soluciones en tubos herméticamente cerrados a temperatura ambiente.
4. Preparar un 4% de violeta Cresyl y un 0,5% de eosina Y en 75% de solución de etanol. Vortex la solución vigorosamente durante 1 min y filtrarlos a través de un filtro de nylon de 0,45 m para eliminar los rastros de polvo no disuelto.
5. Colocar los portaobjetos en un recipiente con 95% de etanol durante 30 s. Transfiera los portaobjetos al tubo que contiene 75% de etanol; Dejar toboganes allí durante 30 s.
6. Transfiera los portaobjetos al 50% de etanol y déjelos allí durante 25 s. En este punto, el PTU se disolverá. Transfiera la diapositiva a una solución violeta de Cresyl al 4% durante 20 s y, a continuación, transfiera a una solución de eosina Y al 0,5% durante 5 s.
7. Saque la diapositiva de la solución de tinte y seque la diapositiva con un papel de filtro. A continuación, coloque los portaobjetos en 50% etanol durante 25 s. Transfiera las diapositivas al 75% de etanol durante 25 s. Transfiera las diapositivas al 95% de etanol durante 30 s. Transfiera las diapositivas al 100% de etanol para 60 s.
8. Enjuague la diapositiva con xileno. Transfiéralos a un recipiente con xileno y espere 3 min.
9. Prepare el medio de montaje (por ejemplo, goma Pinpoint) en agua libre de RNase. Para montar secciones cerebrales de ratón, diluir el medio de montaje en agua libre de RNase en una proporción de 1:10.
10. Seque los portaobjetos en una superficie libre de RNase a temperatura ambiente durante 10 s. Antes de que el xileno se seque, proceda a montar los portaobjetos con las secciones de tejido.
11. Disperse suavemente la solución de montaje en la parte superior del tejido de la corredera con un pincel fino estéril y libre de RNase. Espere 10-20 s, y luego transfiera inmediatamente los portaobjetos a la plataforma de microdisección del microscopio.
    NOTA: La relación entre el medio de montaje y el agua libre de RNase utilizado para el montaje varía en función del tejido de interés. La relación medio/agua de montaje preserva la morfología del tejido glioma para la microdisección láser sin afectar la integridad del ARN.

6. Microdisección de captura láser

NOTA: Es necesario utilizar un microscopio de microdisección de captura láser para microdiseccionar con láser áreas específicas de interés dentro del tejido tumoral. Para minimizar el tiempo para la microdisección láser tisular, prepare el microscopio LMD antes de la fijación y la tinción.

1. Para iniciar el sistema, primero encienda la tira de alimentación, seguido de encender el láser. A continuación, encienda el controlador del microscopio y el ordenador. Inicie el software LMD.
2. En Control de microscopio, seleccione aumento de 10x. En Control láser, establezca los parámetros láser para la disección de tejidos. Establezca una frecuencia láser de 120 Hz para obtener los mejores resultados de corte. Ajuste siempre la corriente láser al 100%.
3. Para una microdisección láser precisa, ajuste la velocidad a 10 y un ajuste de apertura a 2.0-10.0 m. Ajuste la potencia a 53. Tener la potencia láser en un ajuste más alto puede causar aguafuerte de vidrio.
4. Cargue el colector de tejido que capturará el tejido después de la disección. Haga clic en el segundo botón de descarga. Retire el colector vacío y coloque los tubos de cabeza plana DE 0,5 ml PCR libres de DNase/RNase que contengan 30 ml de tampón de lisis en el colector. Vuelva a colocar el colector en la máquina y haga clic en Continuar en el software para continuar.
5. Cargue la muestra procesada (fija y manchada) en el microscopio. Primero, haga clic en descargar en el software LMD. A continuación, monte la muestra en el portaobjetos y coloque el portaobjetos en el escenario. Haga clic en Continuar en el software para continuar.
6. En las ventanas Cortar formas, seleccione Dibujar + Cortar. Utilice los controles del microscopio para encontrar el área de interés. Dibuje la región de interés (ROI) y seleccione un tubo colector de destino. Es posible dibujar varios ROIs para micro diseccionar diferentes áreas de una sola diapositiva al mismo tiempo.
7. Haga clic en Iniciar corte para proceder a la microdisección tisular. Después de seccionar las áreas de interés, retire los tubos colectores del soporte y coloque los tubos sobre hielo seco. Transfiera las muestras de tejido de ARN recogidas a -80 oC para su almacenamiento a largo plazo.

7. Aislamiento de ARN del tejido glioma microdiseccionado

1. Para la extracción de ARN de LMD, utilice un kit de aislamiento de ARN optimizado para muestras pequeñas y bajo rendimiento de ARN (ver Tabla de Materiales). Siga las instrucciones de fabricación. Llevar a cabo todos los pasos de aislamiento a temperatura ambiente (25 oC). Para mantener la calidad del ARN, trabaje rápidamente. Preparar todas las soluciones según lo indicado por el fabricante.
2. Ajustar el volumen de la muestra a 350 ml con tampón de lisis con 1% de mercaptoetanol. Vortex la muestra durante 40 s con el fin de reducir la viscosidad de la muestra y aumentar la eficiencia de la columna de espín de arn.
3. Transfiera la totalidad de la muestra a una columna de giro eliminator gDNA colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar el tubo durante 30 s a 8.000 x g. Guarde el flujo y asegúrese de que no quede líquido en la columna después de la centrifugación.
4. Añadir 350 s de etanol al 70% al flujo y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la muestra a una columna de giro de elusión de ARN colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa suavemente y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el flujo a través, guardando la columna.
5. Añadir 700 l de tampón de lavado de ARN 1 (20% etanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) a la columna de giro de elución de ARN. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de centrifugado. Deseche el flujo.
6. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente la columna de espín de elARN del tubo de recolección para que la columna no entre en contacto con el flujo.
7. Añadir 500 l del segundo tampón de lavado de ARN (etanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) a la columna de centrifugado. Cierre la tapa de la columna y gire 8.000 x g durante 20 s para lavar la membrana de la columna. Deseche el flujo.
8. Para lavar la columna de elución de ARN, añadir 500 s de 80% de etanol, cerrar la tapa de la columna y centrifugar a 8000 x g durante 2 min. Tire los tubos con la solución de elución.
9. Utilice un nuevo tubo de recogida, abra la tapa de la columna de centrifugar a 8000 x g durante 5 minutos para secar la columna. Deseche el tubo de elución.
10. Coloque la columna de giro de elución de ARN en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Añadir 12 ml de agua libre de RNase calentada a 37 oC directamente al centro de la membrana de la columna de espín. Espere 4 minutos y centrífuga durante 1 min a toda velocidad para eluir el ARN.

8. Control de calidad del ARN, preparación de bibliotecas y análisis de ARN-Seq

1. Después de la extracción y purificación del ARN, amplificar el ARN y crear una biblioteca de ADNc utilizando un kit especial adecuado para el aislamiento de ARN a concentraciones picomolares siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del fabricante. Limpie la estación de trabajo para evitar la contaminación con otros productos de PCR y la degradación nucleasa de las muestras.
2. Si el ARN tiene un valor RIN mayor que 4, lo que significa que el ARN es de buena calidad o sólo parcialmente degradado, proceda con el paso de fragmentación. Prepara todos los objetos sobre hielo.
3. Cree una mezcla maestra como se indica (Tabla 1). Cree una mezcla de reacción en un tubo PCR de pared delgada de 0,2 ml sin nucleasa. Incubar los tubos a 94 oC en un ciclor térmico de tapa caliente. El tiempo de incubación de fragmentación depende de la calidad del ARN. RIN 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Después de la incubación, coloque los tubos en un estante de PCR que se enfrió previamente a -20 oC y déjelo sentado durante 2 minutos.
5. Para cada tubo de muestra de ARN, prepare la primera mezcla maestra de reacción de síntesis de hebras (Tabla 2). Incubar los tubos en un ciclor térmico de tapa caliente en las condiciones descritas en la Tabla 3. los productos de ADNc se pueden congelar a -20 oC hasta dos semanas antes de proceder al siguiente paso.
6. Cree la mezcla maestra PCR como se indica en el Cuadro 4. Coloque los tubos en un ciclor térmico de tapa caliente y ejecute la reacción de PCR bajo los ajustes indicados en la Tabla 5.
7. Permita que las cuentas, que se utilizarán para purificar el ADN, se calienten a temperatura ambiente. Una vez calentado, añadir 40 s de las cuentas a cada muestra. Vortex los tubos para mezclar y girar hacia abajo brevemente para recoger líquido en la parte inferior del tubo. Deje que los tubos se incuban a temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que el ADN se una a las cuentas.
8. Coloque los tubos en un dispositivo de separación magnética y deje sentarse durante unos 5 minutos, o hasta que la solución se vuelva completamente clara. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, utilice una pipeta para quitar el sobrenadante cuidadosamente sin alterar las perlas.
9. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, añadir 200 s de etanol recién hecho 80% a las cuentas para lavar sin perturbar las cuentas. Espere 30 s antes de retirar el 80% de etanol. Repita este paso.
10. Gire brevemente por los tubos y vuelva a colocarlos en el dispositivo de separación. Retire cualquier etanol residual del 80% sin perturbar las perlas.
11. Deje que los tubos se sequen al aire con las tapas abiertas durante 5 min. No lo deje sensato más tiempo, ya que las cuentas se secarán en exceso.
12. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, agregue 52 s de agua libre de nucleasas para cubrir las cuentas. Retire los tubos del dispositivo de separación y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que se resuspendan todas las perlas. Incubar a 5 min a temperatura ambiente.
13. Vuelva a colocar los tubos en el dispositivo de separación hasta que la solución quede clara, aproximadamente 1 min. Transfiera 50 sL del sobrenadante resultante a los pozos de una tira de 8 pozos. Añadir 40 s l de nuevas perlas a cada muestra. Vórtice a fondo para mezclar. Permita que las perlas se unan al ADN incubando a temperatura ambiente durante 8 min.
14. Durante este período de incubación, comience a descongelar los componentes que se utilizarán para cualquier ARNR presente en las muestras. Una vez desconwestresados, colócalos en hielo. Además, precalentar un ciclor térmico a 72 oC.
15. Coloque las muestras en el dispositivo de separación magnética hasta que la solución se despeje (aproximadamente 5 min). Aliquot 1,5 l de sondas por muestra a un tubo PCR refrigerado. Coloque el tubo en el ciclor térmico precalentado bajo los ajustes de 72 oC durante 2 min y 4 oC.
16. Manteniendo los tubos de muestra en el dispositivo de separación magnética, retire el sobrenadante con un pipeta sin perturbar las perlas. A continuación, añadir 200 l de etanol recién hecho 80% a las cuentas para lavar sin perturbar las cuentas. Espere 30 s antes de retirar el 80% de etanol. Repita este paso.
17. Gire brevemente por los tubos y vuelva a colocarlos en el dispositivo de separación. Retire cualquier etanol residual del 80% sin perturbar las perlas. Deje que los tubos se sequen al aire con las tapas abiertas durante 2 min. No deje que se sente más tiempo, ya que las cuentas se secarán en exceso.
18. Prepare la mezcla maestra para todas las muestras combinando los siguientes componentes en el orden presentado(Tabla 6).
19. Mezcle la mezcla maestra por vórtice y agregue 22 s de la mezcla a las cuentas secas de cada muestra y mezcle bien para resuspender. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
20. Gire hacia abajo los tubos y colóquelos en el dispositivo de separación magnética durante 1 minuto o hasta que las muestras se borren. Transfiera 20 l del sobrenadante, sin perturbar las perlas a nuevos tubos PCR. Coloque los tubos en un ciclor térmico precalentado bajo los ajustes de la Tabla 7.
21. Prepare una mezcla maestra de PCR para obtener suficiente para las reacciones de cada muestra. Agregue los siguientes componentes a la mezcla maestra en la Tabla 8indicada. Añadir 80 l de la mezcla maestra de PCR a cada uno de los tubos de muestra del paso 8.20 y colocar en el ciclor térmico en los siguientes ajustes (Tabla 9).
22. Permita que las perlas, que se utilizarán para purificar el ADN, se calienten a temperatura ambiente. Una vez calentado, añadir 100 s de las cuentas a cada muestra. Deje que los tubos se incuban a temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que el ADN se una a las cuentas.
23. Coloque los tubos en un dispositivo de separación magnética y deje sentarse durante unos 5 minutos, o hasta que la solución se vuelva completamente clara.
24. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, utilice una pipeta para quitar el sobrenadante cuidadosamente sin alterar las perlas.
25. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, añadir 200 s de etanol recién hecho 80% a las cuentas para lavar sin perturbar las cuentas. Espere 30 s antes de retirar el 80% de etanol. Repita este paso.
26. Brevemente, gire por los tubos y vuelva a colocarlos en el dispositivo de separación. Retire cualquier etanol residual del 80% sin perturbar las perlas.
27. Deje que los tubos se sequen al aire con las tapas abiertas durante 5 min. No deje que se quede más tiempo, ya que las cuentas se secarán en exceso. Pipeta de 20 l de Tris Buffer al pellet seco. Retire el tubo del dispositivo de separación y mezcle bien con un pipeta para resuspender las perlas. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
28. Coloque los tubos en el dispositivo de separación durante 2 minutos, o hasta que la solución se aclare. Adquiere el sobrenadante y transfiéralo a nuevos tubos. A continuación, almacene la solución recogida a -20 oC.
29. Compruebe la necesidad de las bibliotecas finales para el control de calidad y cantidad. Agrupa las muestras, agrupadas y secuenciadas, como lecturas de 50 nt de extremo emparejado, de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.

Nuestro laboratorio ha generado modelos de ratón genéticamente diseñados (GEMM) utilizando el sistema de transposasa de belleza durmiente(Figura 1A). Este sistema incorpora alteraciones genéticas específicas en el genoma de las células progenitoras neuronales en ratones neonatales. Estas células progenitoras alteradas forman tumores glioma endógenos. Las secuencias de plásmidos utilizadas para generar los tumores fueron: (1) pT2C-LucPGK-SB100X para el transposón de la Bella Durmiente & expresión de luciferasa, (2) pT2-NRASSV12 para la expresión NRAS, (3) pT2-shp53-GFP4 para la expresión de proteína p53 knock-down y GFP, y (4) pT2-shATRx-GFP4 para ATRX knock-down. Se inyectaron plásmidos en el ventrículo lateral de cachorros neonatales de 1 día de edad como se describió anteriormente^11. Se monitorizó la toma de plásmidos y la formación de tumores a través del sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo. Una vez que los ratones portadores de tumores mostraron signos de carga tumoral, fueron sacrificados. Los tumores se utilizaron para generar cultivos de la neuroesfera o directamente crioconservados para el procesamiento de LMD(Figura 1A).

Los cultivos celulares iniciados a partir del GEMM se utilizaron para generar un modelo de glioma traducible(Figura 1B). Las neuroesferas de Glioma derivadas de tumores GEMM fueron cultivadas e implantadas intracranealmente en el estriado de ratones inmunocompetentes. Las suspensiones de una sola célula obtenidas del cultivo de las neuroesferas se utilizaron para generar tumores de glioma por implantación intracraneal como se describe anteriormente en nuestro laboratorio^10,11,12. Esta metodología permite la cuantificación cuidadosa del número de células que se implantan por ratón (30.000 células/1 L/ratón). Este protocolo permite la reproducibilidad de los resultados entre diferentes implantaciones experimentales. Sin embargo, la implantación de las neuroesferas podría ser una opción alternativa para generar tumores de glioma de ratón y posterior análisis de LMD y ARN-Seq. Sin embargo, este método se considera más preciso. La progresión tumoral fue monitoreada por el sistema de imágenes del espectro de bioluminiscencia in vivo. Los ratones que mostraban signos de carga tumoral fueron perfundidos transcardialmente y el cerebro fue crio-conservado para el procesamiento de LMD (Figura 1C).

Las secciones de tejido se microdiseccionaron con láser para caracterizar el transcriptoma de estructuras multicelulares dentro de los gliomas. Los procedimientos de perfusión, congelación e incrustación descritos fueron optimizados para preservar la morfología del tejido y obtener ARN de buena calidad después de la microdisección láser. Se evaluaron diferentes enfoques de perfusión para adquirir tejidos con morfología superior e integridad del ARN(Tabla 10). Para diseccionar las áreas de interés, era necesario manchar el tejido con colorantes inocuos para el ARN (Figura 2). Observamos que la perfumar el tumor lleva el ratón con la solución de Tyrode durante 5 min, y luego 30% sacarosa durante 15 min, seguido de almacenamiento nocturno del cerebro diseccionado en 30% sacarosa preserva la morfología y la integridad del ARN del tejido tumoral(Figura 3D). La perfusión con una solución de sacarosa del 30% impidió la formación de cristal de hielo dentro del tejido. Aunque, la fijación del tejido paraformaldehído dio lugar a morfología tisular de alta calidad, la integridad del ARN se vio afectada negativamente(Figura 3B). Otros enfoques como la solución de Tyrode para 5 min o la solución de Tyrode para solución de sacarosa de 5 min + 30% durante 15 min(Figura 3A y C)no afectaron a la calidad del ARN. Bajo estas condiciones, los cerebros no se conservaron en 30% sacarosa durante la noche; observamos una reducción de la resolución en la morfología tisular.

Realizamos varias técnicas de tinción seguidas de análisis de control de calidad de la integridad del ARN. Observamos que el 4% de la tesina Cresyl violeta y 0.5% de eosina Y era suficiente para identificar estructuras multicelulares de glioma y mantener la integridad del ARN. Cresyl violeta es un tinte acidofílico que tiñe el núcleo de las células con un color azul oscuro. EosinY es un tinte basófilo que mancha los componentes básicos de las células.

Observamos que si el tejido no estaba montado con medio de montaje, las secciones se deshidrataron y la morfología se deterioró(Figura 4A). Para mantener la morfología tisular de alta calidad, montamos el tejido con medio de montaje. Observamos que el medio de montaje del 15% se disolvió en agua (30 ml en 200 ml de agua) mantenía una morfología tisular de alta calidad(Figura 4B).

En la Figura 5A,se muestran las áreas de heterogeneidad del glioma. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de microdisección de captura láser antes de la disección. Las líneas rojas representan áreas con abundantes células mesenquimales (células alargadas). Las líneas azules representan áreas sin celdas mesenquimales (células redondeadas)(Figura 5A,imagen media). La Figura 5B muestra imágenes de áreas tumorales microdiseccionadas por láser (líneas rojas) y áreas normales del tejido cerebral (líneas azules). La selección del ROI se realiza para diseccionar áreas de interés(Figura 5A y B,imágenes más bajas). Podemos observar en estas imágenes el éxito en la disección de las áreas seleccionadas.

La extracción de ARN se realizó utilizando un kit comercial. Se determinó que se requería un área total de tejido diseccionado entre 2,5 x 10⁶ - 7 x 10⁶ m² para la extracción de ARNm y la preparación de la biblioteca de ADN para la secuenciación posterior del ARN. El control de calidad del ARN determinó un RIN entre 6 y 7 en el tejido glioma después de la microdisección láser. Se determinó que un RIN de 6 años era apropiado para la preparación de la biblioteca de ADNc. Después de la extracción de ARN, se utilizó un kit para el aislamiento de ARN a concentraciones picomolares para generar una biblioteca de ADNc. adecuada para la secuenciación de próxima generación.

Tabla 1: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Preparación de mezcla maestra para el paso 8.3.

Tabla 2: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Preparación de master Mix para el paso 8.5.

Tabla 3: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Condiciones del termociclador para el paso 8.5.

Tabla 4: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Preparación master Mix para el paso 8.6.

Tabla 5: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Condiciones del termociclador para el paso 8.6.

Tabla 6: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Preparación master Mix para el paso 8.18.

Tabla 7: Control de la calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Condiciones del termociclador para el paso 8.20.

Tabla 8: Control de calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Preparación master Mix para el paso 8.21.

Tabla 9: Control de la calidad del ARN y preparación de la biblioteca: Condiciones del termociclador para el paso 8.21.

Cuadro 10: Métodos para diferentes enfoques de perfusión.

Figura 1: Modelos de glioma de ratón utilizados para microdisección láser. (A) GemM de belleza durmiente utilizado para desarrollar de novo glioma. Las imágenes muestran la progresión del tumor: (i) inyección de plásmido en el ventrículo lateral de los neonatos, (ii) carga tumoral. (B) Generación de modelo glioma trasplantable utilizando cultivos de células de glioma. Las células de la neuroesfera cultivadas a partir de GEMM se implantan intracranealmente en el estriado. (C) Representación de la crio-sección del cerebro incrustado en la orientación coronal después de la perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación esquemática del método utilizado para manchar secciones de tejido crioconservado con Cresyl violeta y Eosin. Los portaobjetos utilizados para la tinción se manipularon con herramientas limpiadas con agua libre de RNase. Todas las soluciones se prepararon con agua libre de RNase/DNase el día de la tinción. Cresyl violeta manchas núcleos violeta y eosina Y manchas citoplasma rosa. Los distees se disolvieron en 70% de etanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de varios enfoques de perfusión para preservar la morfología del tejido y la integridad del ARN. Las imágenes de H&E representan morfología comparativa del tejido cerebral sometido a perfusión bajo diferentes métodos: (A) La solución de Tyrode durante 15 min, (B) Solución de Tyrode para 5 min, 4% PFA para 10 min, (C) Solución de Tyrode para 5 min, 30% sacarosa durante 15 min y (D) Solución de Tyrode para 5 min, 30% sacarosa para 15 min con inmersión durante la noche en 30% sacarosa. Se muestra la evaluación de la calidad del ARN para cada método de perfusión. Las gráficas representan picos rRNA de 18 y 28 s y el pico de marcador inicial. La relación de 18s y 28s rRNA se utiliza para determinar la calidad del ARN. Una imagen de gel de los fragmentos de ARN se muestra a la derecha de las gráficas. La calidad del ARN se evaluó utilizando los valores de RIN. La calidad del ARN fue alta en los métodos A, C y D. La morfología del tejido fue superior en los métodos C y D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes representativas del tejido glioma montado y no montado. (A) Imágenes representativas de tejido teñido con H&E. Este tejido se dejó desmontado y se deshidrataron mostrando una morfología deficiente con roturas en el tejido. (B) Imágenes representativas de tejido teñido con H&E y montado con medio de montaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes representativas del tejido glioma utilizado para la microdisección láser. (A-B) Imágenes representativas de tejido teñido con H&E y áreas de estructuras multicelulares seleccionadas para LMD. (A) A la izquierda, se seleccionaron áreas de celdas alargadas (rojo) y áreas de control (azul) para LMD. (B) A la derecha, se seleccionaron las áreas de invasión colectiva (rojo) y áreas de control (azul) para LMD. (C) Control representativo de la calidad del ARN para zonas microdiseccionadas por láser. Se microdisecizó un área total de 6,5 x 10⁶ m^2. El análisis muestra la concentración de ARN de 2.346 pg/L y el número de integridad del ARN (RIN): 6,8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad e invasión del glioma es de vital importancia para descubrir nuevas dianas terapéuticas¹³. En este manuscrito, describimos un método detallado y optimizado para analizar el paisaje molecular de la heterogeneidad e invasión del glioma utilizando microdisección de captura láser (LMD) seguida de análisis transcriptomico.

La microdisección de captura láser (LMD) se puede utilizar para identificar diferentes áreas o células individuales dentro del tumor, proporcionando una muestra específica para analizar más a fondo el patrón molecular que mantiene el contexto espacial del tumor^14. Esta técnica es fiable y de bajo precio en comparación con otros métodos utilizados para analizar el transcriptoma espacial en tumores sólidos^15. Analizamos la heterogeneidad y la invasión del glioma en modelos de tumores de ratón genéticamente diseñados o modelos implantables intracraneales utilizando LMD. Estos modelos recapitulan las características más destacadas de los gliomas humanos, permitiendo el estudio de la heterogeneidad del glioma y la invasión^10,,12.

Mantener la morfología del tejido tumoral de alta calidad y la integridad del ARN es una de las limitaciones para la LMD. Para mejorar la morfología tisular, perfundimos ratones con la solución de Tyrode durante 5 minutos, seguidos de un 30% de sacarosa disuelta en la misma solución. Una vez diseccionado el cerebro, lo conservamos en 30% de sacarosa disuelta en agua libre de RNase/DNase durante la noche o hasta que el cerebro llegó al fondo del contenedor de almacenamiento. Estos pasos mejoran significativamente la morfología del tejido y reducen la formación de cristales de hielo en el tejido durante la criopreservación. Aunque el tejido glioma humano no se utilizó para este protocolo, la incubación de muestras humanas en una solución de sacarosa del 30% durante la noche podría ser una metodología factible para mejorar la morfología de las criosecciones. Otra posible limitación para el LMD es la preservación de la integridad del ARN después de la tinción^8. Aunque otros equipos de investigación han realizado microdisección láser en el tejido glioma seguida de análisis de ARN-seq, no ilustran ningún ARN y/o morfología ni comentan sobre la calidad morfológica, o controles particulares para las secciones¹⁶congeladas del glioma. En este protocolo la identificación morfológica precisa era esencial para microdiseccionar láser estructuras macrocelulares precisas dentro de los gliomas. Observamos que la fijación del tejido glioma con solución de etanol y la tinción con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina Y se disolvió en calidad de ARN mantenido por etanol y permitió la identificación microscópica de células individuales y estructuras multicelulares. Demostramos que el montaje de secciones de glioma con solución de montaje es un paso crítico que evita el agrietamiento y la formación de fisuras en el tejido. Tenga en cuenta que el medio de montaje debe prepararse en agua, ya que el uso del medio de montaje disuelto en etanol dará lugar a una morfología de tejido deficiente. La microdisección láser debe realizarse lo más rápido posible en un entorno libre de RNase. También recomendamos seccionar hasta 2,5 x 10^{6 m2} de área total de tumores/tejidos para obtener cantidades adecuadas de ARN, tanto para el control de calidad del ARN como para el análisis transcriptómico.

LMD permite el análisis de las vías de señalización molecular que regulan la heterogeneidad y la invasión del glioma. Este análisis podría revelar nuevos objetivos potenciales para el diagnóstico, el pronóstico y el desarrollo traslacional futuro en modelos de glioma preclínico.

Todos los autores de este artículo no declaran posibles conflictos de intereses.

El trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, (NIH/NINDS) Subvenciones: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subvenciones R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; el Departamento de Neurocirugía, Rogel Cancer Center en la Universidad de Michigan, ChadTough Foundation, y Leah's Happy Hearts Foundation to M.G.C. and P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 to M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Proyecto F049768 a A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Premio Médico-Científico de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc. (RPB), otorga R01 EY022633 de la NEI del NIH (AK), y una subvención sin restricciones de RPB al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales. Esta investigación utilizó el Núcleo de Investigación de la Visión (P30 EY007003), y el Núcleo de Investigación del Centro de Cáncer (P30 CA046592). AK cuenta con el apoyo del Premio De Académico Emergente Mrs. William Davidson del Instituto de Investigación Médica A. Alfred Taubman.