O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

O ensaio de invasão celular in vitro é utilizado para medir o potencial de metástase oncológica, quantificando o potencial celular para invasão e migração usando inserções de cultura celular contendo matriz proteica. As células são desafiadas a migrar através da matriz proteica e uma membrana porosa, em direção a um quimioatractivo, e depois quantificada por microscopia de luz.

O ensaio in vitro da invasão usa uma matriz proteína-rica em uma câmara de Boyden para medir a habilidade de pilhas cultivadas passar através da matriz e de uma membrana porosa em um processo análogo às etapas iniciais da metástase da pilha de cancro. As células testadas podem ser alteradas para a expressão gênica ou tratadas com inibidores para testar alterações no potencial de invasão. Esta experimentação testa o phenotype agressivo das pilhas mamária do tumor do rato para descobrir e caracterizar os oncogenes potenciais que promovem a invasão da pilha. Esta técnica, no entanto, pode ser versátil e adaptada a muitas aplicações diferentes. O experimento em si pode ser feito em um dia e os resultados são adquiridos por microscopia de luz em menos de um dia. Os resultados incluem contagens do número de células invasoras para comparação e análise. O ensaio de invasão in vitro é um método rápido, barato e de corte claro para determinar o comportamento celular em uma cultura que pode ser usada como uma avaliação inicial antes de mais envolvidos em ensaios in vivo.

O ensaio in vitro da invasão pode ser uma ferramenta útil ao medir a habilidade de uma pilha de migrar através de uma membrana proteína-revestida, análoga aos primeiros passos na metástase. Uma característica chave de células cancerosas malignas é a sua capacidade de migrar através e invadir tecidos próximos. O cancro que se espalhou ou metástase levanta mais desafios do tratamento e tem umas mais baixas taxas de sobrevivência a longo prazo, quando os tumores localizados forem mais fáceis de tratar e tiverem umas taxas mais elevadas da sobrevivência a longo prazo. Para metástase, as células cancerosas devem deixar o tumor primário e migrar para o sistema circulatório ou linfático, um processo que requer a passagem através da matriz extracelular e da membrana basal¹. No processo chamado a transição mesenquimais epithelial (EMT), as pilhas do tumor devem quebrar contatos da pilha-pilha, migrar direccionalmente, e invadir vasos próximos do sangue ou da linfa. As etapas iniciais desta cascata da metástase são do grande interesse desde que estas etapas são o que pode fazer o cancro deadlier. Os fatores genéticos e epigenéticos envolvidos nos primeiros passos da metástase são o foco de uma grande quantidade de pesquisa, mas são necessárias ferramentas experimentais precisas e confiáveis para testar esses primeiros passos tanto in vivo como in vitro.

As ferramentas para medir as alterações na migração celular, como ensaios de cicatrização de feridas (Scratch) ou crescimento em ambientes 3D, como ensaios de agar suave, podem abordar parcialmente a necessidade de métodos experimentais de medir os primeiros passos de metástase, mas um ensaio para medir a invasão é mais desafiador desde que o processo ocorre no corpo dentro de um microambiente complexo do tumor. Para fins de triagem de drogas ou alterações genéticas para determinar fatores importantes na invasão e metástase, um sistema que pode ser usado in vitro com células cultivadas e imitar os desafios enfrentados pelas células metastáticas in vivo é o ensaio de invasão^2, a ³. O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente diagnosticado em mulheres e a segunda causa principal de morte por câncer em mulheres, portanto, a compreensão dos genes responsáveis pela invasão de células de câncer de mama e metástase é extremamente importante para a saúde pública. Além disso, as células do rato são um sistema de modelo útil para estudar o cancro da mama e sua progressão.

O ensaio in vitro da invasão é baseado no conjunto da câmara de Boyden onde duas câmaras de meios do crescimento são separadas por uma membrana porosa³. Para imitar o microambiente do tumor, um gel proteína-rico é incluído igualmente para separar pilhas em uma câmara de um chemoattractant no outro e actuar como uma barreira da membrana do porão. A fim migrar para o chemoattractant, as pilhas devem primeiramente passar através da barreira proteína-rica a seguir passam através da membrana porosa-um processo análogo a como as pilhas metastáticas migram através do estroma. O gel rico em proteínas pode ser alterado com base nas necessidades do experimento, mas geralmente consiste em colágeno, ou extrato de membrana basal (por exemplo, Matrigel)⁴. É uma mistura complexa de proteínas, proteoglicanos e fatores de crescimento, mas consiste principalmente de lamininas e colágeno IV ^4,5. As pilhas devem então passar através de uma membrana porosa feita tipicamente do policarbonato, do poliéster, ou do politetrafluoretileno (PTFE). As membranas podem ser compradas comercialmente com ou sem um gel da proteína (tipicamente collagens), ou o gel pode ser comprado separada e adicionado. O tamanho do poro pode ser ajustado com base no tamanho da célula. Quando os tamanhos do pore estiverem disponíveis de 0,4-8,0 μm, somente os poros de 3,0-8,0 μm são grandes bastante para a migração da pilha. O ensaio de invasão tem sido usado para determinar a eficácia dos inibidores sobre a capacidade das células de migrar e invadir. Ao faltar o microambiente exato do tumor que está atual in vivo, o ensaio in vitro da invasão é benéfico em selecionar muitas circunstâncias em um curto período de tempo ao minimizar a necessidade para modelos animais. O objetivo desses experimentos é comparar a expressão gênica de suspeita de oncogenes e determinar os efeitos sobre o comportamento das células cancerosas e a agressividade da doença usando o ensaio de invasão in vitro e outros testes. Globalmente, o ensaio de invasão fornece resultados consistentes, quantitativos e rápidos para determinar o potencial metastático, sendo também um método relativamente barato, direto e adaptável.

Todos os experimentos e métodos foram realizados como autorizados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Villanova (IACUC).

1. expressão gênica em células tumorais cultivadas de camundongo mamária

1. Primeiro, prepare as linhas de célula a serem testadas.
2. Use uma colônia de reprodutores de camundongos BALB/cV. Esses camundongos carregam a cepa Balb/CV do vírus do tumor mamário do camundongo, transmitida aos filhotes no leite^6,7. 50 por cento de fêmeas de melhoramento desenvolvem tumores mamária por 10 meses da idade.
   1. Para estabelecer uma linha celular do tumor, Sacrifique uma represa do tumor-rolamento usando um protocolo IACUC-aprovado. Mergulhe a pele abdominal em 70% EtOH e retire o tumor condições estéreis em uma capa de fluxo laminar. Os tumores são subcutaneous, assim que tome o cuidado para evitar perfurar o peritoneum.
   2. Coloc fragmentos do tumor das áreas não-Necrotic em um prato de Petri com uma pequena quantidade de Hanks estéril solução salina equilibrada (HBSS) e mince muito finamente com uma lâmina de navalha estéril.
   3. Transfira os aglomerados de células dispersas para um balão de cultura de células T25 contendo 5 mL de meio de águia modificada de Dulbecco ou DMEM (4,5 g/L de glicose, vermelho fenol e L-glutamina) suplementados com 50% de soro bovino fetal ou FBS e 1% de antibiótico/solução antimicótica. Cresça pilhas em frascos tratados da cultura de pilha em uma incubadora com 5% CO₂ e 100% umidade em 37 ° c.
   4. Lave as células não aderentes após 24-48 h e substitua o DMEM por 50% de FBS e 1% de antibiótico/solução antimicótica. Devolva as células para a incubadora.
   5. Substitua a mídia de cultura líquida a cada 3 dias.
   6. Dividir ou passar as células quando eles são 90% confluente. Remover meios de cultura e lavar as células aderentes com HBSS (sem cálcio ou magnésio). Incubar células com solução de 0,25% de Trypsin-EDTA por 1-5 min a 37 ° c até que as células sejam arredondadas e separadas. Diluir as células 1:10 em meios de cultura frescos e adicionar a um novo balão. Um balão da cultura da pilha T-25 exige 5-8 meios de cultura do mL, 5 mL de HBSS para lavar, e 1 mL do trypsin-EDTA à passagem. Devolva o balão para a incubadora.
   7. Reduza a concentração de FBS a 40% após a primeira passagem, então 30% após a segunda passagem, então 20% após a terceira passagem, e finalmente 10% para todas as passagens subseqüentes. O processo de estabelecimento de crescimento no meio DMEM padrão com 10% FBS requer quatro passagens e 2-8 meses.
3. Uma vez que as linhas celulares são estabelecidas, altere a expressão de suspeita de oncogenes por transfecção de shRNA visando mRNA ou CRISPR para genes não essenciais.
   1. Estabeleça linhas celulares estáveis resistentes a antibióticos com clones individuais que são verificados por Western blot e/ou RT-qPCR para resultados consistentes, no entanto, Transfections transitórios podem funcionar bem, uma vez que o ensaio requer apenas 22 h. controlar linhas de células com sequências de destino não específicas também são necessárias.

2. ensaio de invasão in vitro

1. Cresça as pilhas de tumor mamária aderentes do rato em um frasco T25 até 70-90% confluente para o dia 1 do experimento.
   Nota: Outras linhas celulares ou condições experimentais podem exigir meios de cultura de células diferentes. Por exemplo, se as células de câncer de mama responsivo a hormônio estão sendo testadas, soro filtrado de carvão pode ser necessário para remover compostos que ativam estrogênio ou outros receptores hormonais.
2. Prepare as inserções da câmara de Boyden aquecendo-as à temperatura ambiente (do armazenamento de-20 ° c) por aproximadamente 20 minutos em uma capa da cultura de pilha. Evite ciclos de congelamento para inserções não utilizadas. Use três inserções (replicações) para gerar dados estatisticamente válidos para cada linha de célula para cada experimento.
   1. Adicionar pré-aquecido 37 ° c soro-livre DMEM mídia para o poço e, em seguida, a inserção. Para inserções projetadas para 24 pratos bem, adicione 500 μL de DMEM sérico-livre ao poço e então 500 μL de DMEM soro-livre à inserção assim que a membrana e o gel porosos são hidratados em ambos os lados.
      Nota: Para inserções maiores projetadas para um prato de 6 poços, use 2 mL de DMEM sem soro em ambos os lados.
3. Coloc o prato com inserções em uma incubadora da cultura de pilha de 37 ° c com 5% CO₂ e 100% de umidade para pelo menos 2 h para hidratar e ACCLIMATE completamente.
4. Prepare as células removendo a mídia de crescimento e enxaguando as células com 5 mL de HBSS.
   1. Retire o HBSS e adicione 1 mL 0,25% de solução de tripsina-EDTA por 1-5 min a 37 ° c ou até que as células apareçam arredondadas ou mostrem sinais de descolamento do balão.
   2. Bata suavemente no balão para separar todas as células. Suspender as células em 5 mL de DMEM + 10% FBS e transferir para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
   3. Centrifugue as pilhas em 1.000 x g por 5 minutos para pellet suavemente as células. Retire a mídia e substitua por 5 mL de DMEM sem soro para ressuscite as células.
   4. Repita a centrifugação e a suspensão em meios soro-livres duas vezes mais para um total de 3 lavas.
   5. Completamente Ressuspender as células no final 5 mL de soro-livre DMEM e garantir que não há aglomerados de células.
5. Determine a concentração da pilha usando um Hemocytometer. Conte apenas células viáveis. Diluir a suspensão da célula para 5 x 10⁴ células/ml em 5 ml de DMEM sem soro.
   Nota: Esta concentração rende 2.500 células por pastilha em um prato de 24 poços. Este número de células é suficiente para células cancerosas agressivas com altas taxas de migração e invasão. Linhas celulares menos agressivas podem exigir mais células, até 10.000 células por inserção para células invasoras observáveis. Se a invasão celular reduzida for esperada, considere maximizar as células invasoras aumentando o número da célula. Se o aumento da invasão celular for esperado, comece com menos células.
6. Retire o prato de cultura celular da incubadora e aspirar suavemente a mídia a partir da inserção. Levante a pastilha e aspirar a mídia do poço. Trabalhando rapidamente, adicione o chemoattractant à câmara mais baixa. Para um prato de 24 poços, adicione 750 μL de DMEM com 5% de FBS.
   1. Coloque a pastilha no poço e adicione as células à pastilha. Para um prato de 24 poços, use 500 μL de suspensão celular. Para uma pastilha de prato de 6 poços, use 2,5 mL de quimioatração e 2 mL de células. Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes em ambos os lados da membrana.
   2. Devolva o prato para a incubadora da cultura celular por 22 h.
7. Após 22 h, fixar e manchar as células. Prepare uma solução de 1% paraformaldeído em 1x fosfato tampão salina (PBS) para fixação.
   1. Em um prato limpo da cultura da pilha 24-well, adicione 1 mL do fixador aos poços individuais assim que há um poço para cada inserção.
   2. Prepare a solução de coloração (recém-feita) de 0,1% cristal violeta (w/v) em uma solução de PBS com 10% de etanol (v/v). Da mesma forma, adicione 1 mL de solução de coloração a um poço limpo em um prato de cultura de 24 poços para cada pastilha.
   3. Retire cada pastilha um de cada vez com fórceps e coloque um cotonete estéril dentro da pastilha e esfregue o lado superior da membrana para remover as células não migradas.
   4. Repita com um segundo cotonete de algodão. A membrana é bastante forte, pressão tão suave enquanto limpando não compromete a integridade da membrana.
   5. Remova qualquer mídia restante do interior da pastilha e adicione 750 μL de PBS para lavar as células separadas.
   6. Retire o PBS e repita a lavagem. Coloque a pastilha em um fixador bem contendo para fixar as células migradas na parte inferior da membrana. Repita para todas as inserções.
   7. Fixar as pastilhas durante 15 min à temperatura ambiente.
   8. Após a fixação, retire a pastilha. Lave novamente a pastilha com 750 μL de PBS.
   9. Coloque a pastilha no poço com a solução de coloração para manchar todas as células migradas e fixas. Manchar as células por 15 min à temperatura ambiente.
      Nota: Para pastilhas de prato de 6 poços, use 2 mL de solução fixativa, 2 ml de solução de coloração e 2 mL de lavagem PBS.
8. Use um copo com água destilada para senhor as inserções. Retire as pastilhas e mergulhe na água destilada até que a água que corre fora da pastilha seja clara.
   1. Retire as gotas de água em excesso e coloque as pastilhas sobre um papel de filtro lateralmente para secar ao ar (geralmente durante a noite).
9. Prepare a membrana para a imagem etiquetando uma corrediça de vidro limpa do microscópio para cada inserção e coloc uma gota pequena do óleo da imersão do microscópio no centro da corrediça.
   1. Retire a membrana da pastilha usando um bisturi para cortar em torno do perímetro da membrana no interior da pastilha plástica.
   2. Retire a membrana usando fórceps e coloque na parte superior da gota de óleo na corrediça para segurá-la no lugar.
      Nota: As membranas são muito finas e muito leves, para que possam ser facilmente perdidas pelo fluxo de ar suave.

3. imagem e análise

1. Desde as membranas porosas são claras e manchas de células com cristal violeta dar-lhes contraste, use um microscópio de luz composto para ver as células. Use uma câmera e/ou software para quantificar para muitas amostras, mas não é necessário. Exibir células em ampliação de 5x, 10x ou 20x. Para quantificação, use múltiplas imagens não sobrepostas a uma ampliação de 10x. Alternativamente, conte todas as células migradas na membrana a uma ampliação de 10x.
2. Determine o número total de células ou células invasoras por área para todas as amostras. Para cada experimento, realize cada condição no ensaio com três inserções replicantes e repita várias vezes para resultados estatisticamente úteis.
3. Ao comparar diferentes linhas celulares com diferentes taxas de crescimento e taxas de migração, faça um experimento paralelo para comparar as células que invadem através de uma matriz proteica e comparar com um conjunto de câmara Boyden sem matriz proteica (somente células migradas). Calcule a invasão por cento para cada linha celular (número de células invadidas/número de células migradas x 100%).
   Nota: Essa abordagem pode ajudar a comparar a taxa de invasão às taxas de migração. Se a comparação de diferentes condições aplicadas à mesma linha celular, calculando a invasão sozinho é cálculos mais relevantes. A borda externa da membrana, por vezes, tem um maior número de células do que as áreas centrais e é, portanto, menos precisos. Se isso ocorrer, exclua essas células da quantificação e assegure-se de que todas as células sejam removidas por um cotonete em um experimento repetido.

Este método de invasão in vitro através de uma matriz proteica foi utilizado para avaliar os fenótipos agressivos e os comportamentos celulares oncogênicos de células tumorais do camundongo com expressão alterada da proteína do dedo de zinco ZC3H8^,8. Em conjunto com outras abordagens que também examinam a migração celular e o crescimento em ambientes 3D, verificou-se que níveis mais elevados de expressão de Zc3h8 em linhagens celulares tumorais, ou por expressão mediada por promotor de um plasmídeo, resultaram em taxas rápidas de células proliferação, migração rápida, crescimento em ambientes 3D e maior invasão no ensaio de invasão in vitro⁸. Inversamente, a expressão diminuída por construções de shRNA conduziu à proliferação, à migração, e à invasão menos agressivas⁸. Estes resultados foram confirmados in vivo onde a expressão mais elevada de Zc3h8 produziu os tumores maiores que apareceram ràpida, quando a expressão diminuída produziu poucos tumores que eram menores e menos freqüentes⁸.

Para expandir que este trabalho, os plasmídeos da expressão que podem resgatar o knockdown shRNA-negociado da expressão Zc3h8 foram transfected estàvel em pilhas mamária do rato para avaliar se o crescimento e o comportamento agressivos da pilha poderiam ser restabelecido nestas pilhas. Todos os knockdown e resgate de expressões foram verificados pelo Western blot ou RT-qPCR⁸. Utilizou-se um ensaio de invasão com 5.000 células por Câmara em um prato de 24 poços e documentado com fotografias como mostrado na Figura 1 e na Figura 2. A Figura 3 mostra os resultados do ensaio de invasão que demonstram como a invasão celular diminuiu no knockdown de shRNA da expressão Zc3h8, mas que a invasão é resgatada quando a expressão é resgatada. Estes dados mostram que o ensaio da invasão pode fornecer um método rápido para testar linhas de pilha in vitro antes de embarcar em aproximações mais caras e mais longas.

Figura 1: componentes do ensaio de invasão. (A) inserção da câmara de Boyden para um prato de 24 poços da cultura do tecido. (B) um prato de cultura de tecido de 24 poços usado para fixação, coloração e lavagem após 22 h de incubação com células. Números 1, 2 e 3 são replicações de uma única linha de célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fluxograma do ensaio de invasão com a escala de tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: resultados do ensaio de invasão de amostra de células tumorais mamárias do camundongo alteradas para expressão de Zc3h8, que altera o fenótipo oncogênico. (A, B) As pilhas isoladas dos tumores mamária do rato foram transfected estàvel com o shRNA que Segia uma seqüência de controle do mRNA ou alvejando Zc3h8 mRNA. (C) a linha celular posterior foi então resgatada expressando Zc3h8 recombinante projetada para não ser afetada pelo shRNA. As pilhas são manchadas com violeta de cristal e capturadas na ampliação 10x usando um microscópio claro. Barra de escala = 500 μm. (D) quantificação mostrando que a expressão reduzida de Zc3h8 diminuiu o número de células invasoras e o potencial de metástase. Resgate da expressão gênica resgata maiores taxas de invasão celular. Os valores representam o número total de células invasoras de uma inserção de ensaio de invasão de 24 poços. Para cada repetição no experimento, calculou-se o número médio de células invasoras. Isto foi repetido para três experimentos. As barras de erro indicam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ensaio de invasão in vitro é um método barato, rápido, quantitativo e direto para estudar os fatores que promovem a invasão de células cancerosas. O câncer de mama é o câncer mais comumente diagnosticado entre as mulheres. Dos três principais subtipos de câncer de mama, triplo negativo, (ou ER-, PR-, HER2/Neu-), é o mais agressivo, mais provável de metástase, e mais mortal⁹. Portanto, compreender os genes e a expressão que resultam em metástases pode ajudar a encontrar novos alvos terapêuticos e marcadores genéticos para a doença. Embora muitos dos genes importantes para a invasão de células cancerosas e metástases tenham sido identificados e caracterizados, os níveis de expressão e a atividade dos motoristas de metástase versus supressores de metástase podem ser um aspecto crítico da progressão da doença^9, a ¹⁰.

Além da expressão gênica, o ensaio de invasão in vitro também tem sido utilizado para estudar o papel do microRNA e de outros reguladores na promoção ou prevenção da invasão de células cancerosas^11,12. O método de configuração de invasão in vitro pode ser usado para o estudo de inibidores, ambientes de tumores de tipo multicélulas, células editadas por CRISPR ou alterações de curto prazo em ambientes de crescimento celular. A versatilidade e adaptabilidade tornam este ensaio muito vantajoso.

O ensaio de invasão pode ser usado em um primeiro passo na análise de genes e fatores que contribuem para ou impedem a progressão tumoral. Por exemplo, Yan et al. (2010) utilizaram os ensaios de invasão in vitro para definir o papel de GATA-3 em suprimir o EMT pela linha celular de câncer de mama altamente agressiva MDA-MB 231¹³. Puderam então mostrar que esta supressão correlacionou com uma habilidade diminuída de dar forma a metástases em um ensaio in vivo¹³. As estratégias terapêuticas potenciais podem ser caracterizadas inicialmente pela habilidade de nervos inibidores da via para limitar a invasão através de Matrigel, correlacionando também com o efeito destes nervos inibidores na formação do tumor em modelos animais. O ensaio de invasão in vitro pode ser utilizado para uma análise mais aprofundada de oncogenes conhecidos e potenciais e parceiros interagindo. Por exemplo, a dissecção molecular de motivos funcionais conhecidos de uma oncoproteína ou uma análise rápida das mutações pode ser feita com o ensaio in vitro da invasão como uma tela inicial ou uma avaliação do significado. Isto pode fornecer a introspecção valiosa em domínios críticos assim como uma compreensão funcional de fenótipos da pilha a nível molecular.

Quando o ensaio da invasão da câmara de Boyden tiver muitas vantagens, há umas limitações. Por exemplo, o ensaio de invasão só examina a intravasação, uma das etapas iniciais da metástase, mas não as etapas posteriores quando as células cancerosas colonizam locais secundários. Conseqüentemente, somente uma vista parcial do potencial da metástase pode ser concluída. O comprimento de 22 h do ensaio, quando flexível, não pode excluir alguma divisão da pilha que poderia distorcer mudanças sutis em medir a invasão de populações assíncronas da pilha. Os inibidores tais como mitomycin C podem ser usados para impedir a divisão da pilha no caso das pilhas ràpida do mergulho. Por fim, o uso de solução de 5% FBS para quimiotaxia lentamente se difunde ao longo do tempo e equilibram entre as câmaras superior e inferior. A densidade da proteína gel retarda esta difusão e apresenta as células com a opção de migrar lateralmente através do gel e membrana (haplotaxis) ou através da matriz proteica e através dos poros para as concentrações mais elevadas de FBS (quimiotaxia). Agentes quimiotaxia alternativos podem ser substituídos ou menores subsídios de tempo para invasão podem ser usados para medir apenas as células que invadiram antes da equilibração. É a flexibilidade, não a rigidez, do ensaio in vitro da invasão que permite a personalização que faz este ensaio tão útil. As adaptações futuras deste ensaio incluem uma seleção em grande escala dos compostos, as mudanças da expressão de Gene, e a avaliação da eficácia alelo-específica da droga. Além disso, um sistema de câmara dupla com meios de circulação poderia desafiar as células a invadir através de uma matriz proteica, atravessar um ambiente líquido, e restabelecer em uma segunda matriz proteica em um local secundário. Por último, uma membrana mais desafiadora pode ser usada com o sistema de ensaio de invasão in vitro, como uma monocamada de células não invasoras que seriam mais difíceis para as células cancerosas cruzarem.

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho foi apoiado pela concessão R15CA169978 dos institutos nacionais de saúde. O financiamento adicional veio da Universidade de Villanova.