腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

インビトロ細胞侵入アッセイは、タンパク質マトリックスを含む細胞培養インサートを用いて細胞侵入および移動の細胞電位を定量化することにより、癌転移の可能性を測定するために使用される。細胞は、タンパク質マトリックスと多孔質膜を通って、化学集化剤に向かって移動し、光顕微鏡で定量化することに挑戦される。

インビトロ侵食アッセイは、ボイデン室のタンパク質が豊富なマトリックスを使用して、培養細胞がマトリックスを通過する能力と多孔質膜を癌細胞転移の初期段階に類似したプロセスで測定します。試験された細胞は、遺伝子発現のために変更したり、インヒビターで処理して侵入電位の変化をテストすることができます。この実験は、マウス乳腺腫瘍細胞の積極的な表現型をテストし、細胞侵入を促進する潜在的な腫瘍遺伝子を発見し、特徴付ける。しかし、この技術は汎用性が高く、多くの異なるアプリケーションに適応できます。実験自体は1日で行うことができ、結果は1日未満で光顕微鏡検査によって取得されます。結果には、比較および分析のための侵入細胞の数が含まれます。インビトロ侵血アッセイは、生体内アッセイに関与する前に初期評価として使用できる培養中の細胞挙動を決定するための迅速で安価で明確な方法です。

インビトロ侵血アッセイは、転移の最初のステップに類似したタンパク質被覆膜を通って移動する細胞の能力を測定する際に有用なツールでありうる。悪性癌細胞の重要な特徴は、近くの組織を介して移動し、侵入する能力です。転移または転移した癌は、より多くの治療上の課題を提起し、長期生存率が低い一方で、局所的な腫瘍は治療が容易であり、長期生存率が高い。転移するためには、癌細胞は原発腫瘍を残して循環器系またはリンパ系に移行しなければならず、細胞外マトリックスおよび地下^膜1を通過する必要があるプロセスである。上皮間葉転移(EMT)と呼ばれるプロセスでは、腫瘍細胞は細胞間接触を破り、方向に移動し、近くの血液またはリンパ管に侵入しなければならない。この転移カスケードの最初のステップは、これらのステップが癌を死語させることができるものであるので、大きな関心があります。転移の初期段階に関与する遺伝的およびエピジェネティックな要因は、多くの研究の焦点ですが、インビボとインビトロの両方でこれらの初期のステップをテストするには、正確で信頼性の高い実験ツールが必要です。

創傷治癒(スクラッチ)アッセイやソフト寒天アッセイなどの3D環境での増殖などの細胞移動の変化を測定するツールは、部分的に転移の初期段階を測定する実験的方法の必要性に対処することができますが、侵入を測定するためのアッセイは、プロセスは複雑な腫瘍微小環境内で体内で起こるので、より困難です。薬物や遺伝子改変をスクリーニングして侵入および転移の重要な因子を決定する目的で、培養細胞をインビトロで使用し、生体内の転移細胞が直面する課題を模倣することができるシステムが侵襲アッセイ2、 ³.乳癌は女性で最も一般的に診断されたタイプの癌であり、女性の癌死の第二の主要な原因であり、乳癌細胞の侵入と転移の原因となる遺伝子を理解することは公衆衛生にとって非常に重要です。さらに、マウス細胞は、乳癌とその進行を研究するための有用なモデルシステムである。

インビトロ侵略アッセイは、成長培地の2つのチャンバーが多孔質膜3によって分離されているボイデン室アセンブリに基づいています。腫瘍微小環境を模倣するために、タンパク質が豊富なゲルは、一方のチャンバー内の細胞を他方の化学刺激剤から分離し、基体膜バリアとして作用するようにも含まれる。化学集化剤に向かって移行するためには、細胞はまずタンパク質が豊富な障壁を通過し、次に多孔質膜を通過する必要があります。タンパク質が豊富なゲルは、実験のニーズに基づいて変更することができるが、通常、コラーゲン、または基基膜抽出物(例えば、Matrigel)4から構成される。これは、タンパク質、プロテオグリカンおよび成長因子の複雑な混合物であるが、主にラミニンとコラーゲンIV 4、5で構成されている。細胞は、典型的にはポリカーボネート、ポリエステル、またはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)で作られた多孔質膜を通過する必要があります。膜は、タンパク質ゲル(典型的にはコラーゲン)の有無にかかわらず商業的に購入されてもよいし、またはゲルを別途購入して添加してもよい。細孔のサイズは細胞のサイズに基づいて調節することができる。細孔サイズは0.4~8.0 μmで利用可能ですが、3.0~8.0 μmの細孔のみが細胞移動に十分な大きさです。侵襲アッセイは、細胞が移動して侵入する能力に対する阻害剤の有効性を決定するために使用されてきた。インビボに存在する正確な腫瘍微小環境を欠いている間、インビトロ侵受アッセイは動物モデルの必要性を最小にしながら、短時間で多くの条件をスクリーニングする上で有益である。これらの実験の目的は、疑わしい腫瘍遺伝子の遺伝子発現を比較し、インビトロ侵血アッセイおよびその他の試験を用いて癌細胞の挙動および疾患の攻撃性に及ぼす影響を決定することです。全体として、侵受アッセイは、比較的安価で、わかりやすく、適応可能な方法である一方で、転移電位を決定するための一貫性のある定量的かつ迅速な結果を提供します。

すべての実験と方法は、ビラノバ大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたように行われました。

1. 培養マウス乳腺腫瘍細胞における遺伝子発現

1. まず、テストする細胞株を準備します。
2. BALB/cVマウスの繁殖コロニーを使用します。これらのマウスは、マウス乳腺腫瘍ウイルスのBALB/cV株を運び、ミルク6、7で子犬に伝染する。繁殖雌の50%は生後10ヶ月までに乳腺腫瘍を発症する。
   1. 腫瘍細胞株を確立するには、IACUC承認プロトコルを使用して腫瘍担持ダムを犠牲にする。70%EtOHで腹部皮膚を浸し、層流フードの無菌条件下で腫瘍を取り除く。腫瘍は皮下にあるので、心膜を穿刺しないように注意してください。
   2. 少量の無菌ハンクスバランス生理食水溶液(HBSS)とミンチを滅菌カミソリブレードで非常に細かくペトリ皿に非壊死領域からの腫瘍断片を置きます。
   3. 分散した細胞塊を、5mLダルベッコの改変イーグル培地またはDMEM(4.5g/Lグルコース、フェノールレッド、L-グルタミン)を含むT25細胞培養フラスコに移し、50%の胎児牛血清またはFBSおよび1%の抗生物質/抗菌溶液を補充した。37°Cで5%CO2および100%の湿度を持つインキュベーターで処理された細胞培養フラスコで細胞を成長させます。
   4. 24-48時間後に非付着細胞を洗い流し、DMEMを50%のFBSおよび1%の抗生物質/抗マイコティック溶液に置き換える。細胞をインキュベーターに戻します。
   5. 液体培養培養剤を3日ごとに交換してください。
   6. 90%のコンフルエントである場合に細胞を分割または通過させる。培養培養剤を取り除き、HBSS(カルシウムまたはマグネシウムなし)で付着細胞を洗浄します。細胞が丸みを帯びて剥離するまで、0.25%トリプシン-EDTA溶液で細胞を37°Cで1〜5分間インキュベートします。細胞を生培地中に希釈1:10とし、新しいフラスコに添加する。T-25細胞培養フラスコは、洗浄するために5〜8 mL培養培養培養物、洗浄するHBSSの5 mL、および通過にトリプシンEDTAの1 mLを必要とします。フラスコをインキュベーターに戻します。
   7. FBS濃度を最初の通路の後に40%に減らし、次いで2番目の通路の後に30%、次いで第3の通路の後に20%、そして後続のすべての通路について10%に減らす。10%FBSで標準的なDMEM媒体の成長を確立するプロセスは4つの通路および2 -8ヶ月を必要とする。
3. 細胞株が確立されたら、非必須遺伝子に対するmRNAまたはCRISPRを標的とするshRNAのトランスフェクションによって疑わしいオンコ遺伝子の発現を変化させます。
   1. 一貫した結果を求めてウェスタンブロットおよび/またはRT-qPCRによって検証された個々のクローンを用いて抗生物質耐性安定細胞株を確立するが、アッセイは22時間の制御細胞株しか必要としないため、一時的なトランスフェクションも同様に機能する。非固有のターゲット シーケンスも必要です。

2. インビトロ侵略アッセイ

1. 実験1日目の70〜90%コンフルエントになるまで、T25フラスコで付着マウス乳腺腫瘍細胞を成長させる。
   注:他の細胞株または実験条件は、異なる細胞培養培養培養剤を必要としてもよい。例えば、ホルモン応答性乳癌細胞がテストされている場合、エストロゲンまたは他のホルモン受容体を活性化する化合物を除去するために炭フィルター血清が必要な場合があります。
2. ボイデン室の挿入物を室温(-20°C保存)に約20分間、細胞培養フードで温めます。未使用の挿入物の凍結解凍サイクルは避けてください。3 つの挿入 (反復) を使用して、各実験の各セルラインに対して統計的に有効なデータを生成します。
   1. 予め温めた37°Cの無血清のDMEM媒体を井戸に加え、その後挿入する。24ウェルの皿用に設計されたインサートの場合は、500 μLの無血清DMEMをウェルに加え、500μLの無血清DMEMをインサートに加えて、多孔質膜とゲルを両側に水和します。
      注:6ウェル皿用に設計された大きなインサートの場合は、両側に2 mLの無血清DMEMを使用してください。
3. 37°Cの細胞培養インキュベーターに5%のCO₂と100%の湿度を含む37°Cの細胞培養インキュベーターに挿入器を入れ、少なくとも2時間は水分を補給し、順応させます。
4. 増殖培養物を除去し、5 mL HBSSで細胞をすすいで細胞を調作する。
   1. HBSSを取り出し、37°Cで1~5分間、または細胞が丸みを帯びたり、フラスコから剥離の兆候が現れるまで、1 mL 0.25%トリプシン-EDTA溶液を追加します。
   2. フラスコを軽くタップして、すべてのセルを取り外します。DMEM+10%FBSの5 mLで細胞を再懸濁し、無菌15 mL遠心管に移す。
   3. 細胞を1,000 x gで5分間遠心分離し、細胞を穏やかにペレットします。培剤を取り外し、5 mLの無血清フリーDMEMに置き換えて細胞を再中断します。
   4. 無血清培中の遠心分離と懸濁液を2回繰り返し、合計3回の洗い流しを行います。
   5. 血清フリーDMEMの最終5mLで細胞を徹底的に再中断し、細胞の塊がないことを確認します。
5. 血球計を用いて細胞濃度を決定する。実行可能なセルのみをカウントします。無血清DMEMの5 mLで細胞懸濁液を5 x 10⁴細胞/mLに希釈する。
   注:この濃度は、24ウェル皿に挿入あたり2,500細胞を得る。この細胞数は、移動と侵入の割合が高い積極的な癌細胞には十分です。あまり積極的な細胞株は、観察可能な侵入細胞のために挿入当たり最大10,000セル、より多くの細胞を必要とする可能性があります。細胞の侵入の減少が予想される場合は、細胞数を増やして侵入細胞を最大化することを検討してください。増加した細胞の侵入が予想される場合は、より少ない細胞で始まります。
6. インキュベーターから細胞培養皿を取り出し、インサートからメディアをそっと吸引します。インサートを持ち上げ、井戸からメディアを吸引します。迅速に作業し、下部の部屋に化学刺激剤を追加します。24ウェルの料理の場合は、5%のFBSでDMEMの750 μLを追加します。
   1. インサートをウェルに配置し、セルをインサートに追加します。24ウェルの皿の場合は、500 μLのセルサスペンションを使用します。6ウェル皿インサートの場合は、2.5mLのケモアトラクションと2mLの細胞を使用します。膜の両側に空気の泡が存在しないことを確認します。
   2. 22時間、細胞培養インキュベーターに皿を戻します。
7. 22時間後、細胞を固定し、染色します。固定のための1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で1%パラホルムアルデヒドの溶液を調出します。
   1. きれいな24ウェル細胞培養皿で、個々のウェルに固定剤の1 mLを追加し、各インサートに1つの井戸があります。
   2. 10%エタノール(v/v)でPBSの溶液中に0.1%結晶バイオレット(w/v)の染色溶液(作りたて)を調製します。同様に、各インサートの24ウェル培養皿にきれいな井戸に1mLの染色溶液を加えます。
   3. 鉗子で一つずつ挿入を取り外し、インサートの内側に無菌綿棒を入れ、膜の上側を綿棒で洗い流し、未移行細胞を取り除きます。
   4. 2つ目の綿棒で繰り返します。膜はかなり強いので、スワビング中の穏やかな圧力は、膜の完全性を損ないません。
   5. インサートの内側から残りの培中を取り出し、750 μLのPBSを加えて離れた細胞を洗い流します。
   6. PBSを取り外し、洗浄を繰り返します。インサートをウェルに固定し、移行した細胞を膜の下側に固定します。すべての挿入に対して同じ手順を繰り返します。
   7. 室温で15分間インサートを固定します。
   8. 次の固定は、挿入を削除します。750 μL PBS で挿入物をもう一度洗います。
   9. すべての移行および固定細胞を染色するために染色溶液でウェルに挿入を置きます。室温で15分間細胞を染色します。
      注:6ウェル皿インサートの場合は、2mLの固定液、2mLの染色液、2mLのPBS洗浄を使用します。
8. 蒸留水でビーカーを使用して、インサートを汚します。インサートを取り外し、インサートから流れる水が透明になるまで蒸留水に浸します。
   1. 余分な水滴を取り除き、フィルターペーパーの上に挿入物を横方向に置き、空気乾燥(通常は一晩)します。
9. 各インサートにきれいなガラス顕微鏡スライドを標識してイメージング用の膜を準備し、スライドの中央に小さな一滴の顕微鏡浸漬油を置きます。
   1. メスを使用してインサートから膜を取り外し、プラスチックインサートの内側にある膜の周囲を切り取ります。
   2. 鉗子を使用して膜を取り外し、スライド上のオイルドロップの上に置き、所定の位置に保持します。
      注:膜は非常に薄く、非常に軽いので、穏やかな空気の流れによって容易に失われる可能性があります。

3. イメージングと解析

1. 多孔質膜は透明であり、結晶紫色の染色細胞はコントラストを与えるので、化合物光顕微鏡を使用して細胞を見ます。カメラやソフトウェアを使用して、多くのサンプルを定量化しますが、必須ではありません。セルを 5 倍、10 倍、または 20 倍の倍率で表示します。定量化するには、10倍の倍率で複数の重なり合わない画像を使用します。あるいは、10倍の倍率で膜上のすべての移行細胞をカウントします。
2. すべてのサンプルの領域あたりの侵入セルまたはセルの合計数を決定します。各実験について、3回の反復挿入でアッセイ内の各条件を実行し、統計的に有用な結果を求めて複数回繰り返します。
3. 異なる細胞株を異なる増殖速度および移行速度と比較する場合、タンパク質マトリックスを介して侵入する細胞を比較し、タンパク質マトリックス(移行細胞のみ)を持たないボイデンチャンバーアセンブリと比較する並列実験を行います。各セルラインの侵略率を計算します(侵入したセルの数/移行されたセルの数 x 100%)。
   注:この方法は、侵入率と移行率を比較するのに役立ちます。同じセルラインに適用された異なる条件を比較する場合、侵略の計算だけでより関連性の高い計算が行われます。膜の外縁は、時々中心領域よりも多くの細胞数を有し、したがって、より正確ではない。この場合は、これらの細胞を定量から除外し、繰り返し実験で綿棒によってすべての細胞が除去されることを確認します。

タンパク質マトリックスを介したインビトロ侵来のこの方法は、亜鉛フィンガータンパク質ZC3H8⁸の発現を変化させたマウス乳腺腫瘍細胞の積極的な表現型および発因性細胞行動を評価するために用いた。また、3D環境における細胞の移動と増殖を調べる他のアプローチと併せて、腫瘍細胞株におけるZc3h8のより高い発現、またはプラスミドからのプロモーター媒介発現により、細胞の急速な速度をもたらしたことがわかった。増殖、高速移行、3D環境での成長、およびインビトロ侵入アッセイ8の侵略の増加。逆に、shRNA構築物による発現の減少は、より積極的な増殖、移行、および侵入8をもたらした。これらの結果は、Zc3h8のより高い発現が急速に現れる大きな腫瘍を産生する生体内で確認されたが、発現の減少は、より小さく、頻度の低い腫瘍を産生した8。

この研究を拡張するために、Zc3h8発現のshRNA媒介ノックダウンを救い出すことができる発現プラスミドをマウス乳細胞で安定的にトランスフェクトし、これらの細胞において積極的な細胞増殖と挙動が再確立できるかどうかを評価した。すべてのノックダウンと表現の救助は、ウェスタンブロットまたはRT-qPCR⁸によって検証されました。侵略アッセイは、24ウェル皿のチャンバーあたり5,000セルで使用され、図1および図2に示すように写真で文書化された。図3は、Zc3h8発現のshRNAノックダウン時に細胞侵入がどのように減少したかを示す侵入アッセイの結果を示すが、その発現が救出されたときにその侵入が救出される。これらのデータは、侵入アッセイが、より高価で長いアプローチに着手する前に、インビトロで細胞株をテストするための迅速な方法を提供できることを示しています。

図1:侵入アッセイ成分。(A)24ウェル組織培養皿用ボイデン室挿入物。(B) 細胞との22時間インキュベーション後の固定、染色、洗浄に用いられる24ウェル組織培養皿。数値 1、2、および 3 は、単一のセルラインの反復です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:時間スケールを持つ侵入アッセイフローチャート。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:腫瘍性表現型を変化させるZc3h8の発現のために変化したマウス乳腺腫瘍細胞のサンプル侵入アッセイ結果。(A, B)マウス乳腺腫瘍から単離された細胞は、mRNAの対照配列またはZc3h8 mRNAを標的とするshRNAを用いたsRNAを用いた安定的にトランスフェクトした。(C)後の細胞株は、shRNAの影響を受けるように設計された組換えZc3h8を発現することによって救出された。細胞は結晶紫色で染色され、光顕微鏡を使用して10倍の倍率で捕捉されます。スケールバー= 500 μm. (D) Zc3h8の発現の減少は、侵入細胞の数および転移電位を減少させたことを示す定量化。遺伝子発現の救助は細胞の侵入のより高い率を救う。値は、24 ウェルの侵入アッセイ挿入物からの侵入セルの合計数を表します。実験における各反復について、侵略細胞の平均数を算出した。これを3回の実験で繰り返した。誤差余数は、平均の標準誤差を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

インビトロ侵血アッセイは、癌細胞の侵入を促進する因子を研究するための安価で、迅速、定量的、および簡単な方法である。乳癌は、女性の間で最も一般的に診断された癌です。乳癌の3つの主要なサブタイプのうち、トリプルネガティブ(またはER-、PR-、HER2/neu-)は、最も攻撃的で、転移する可能性が最も高く、最も致命的な9である。したがって、転移をもたらす遺伝子や発現を理解することは、疾患の新しい治療目標と遺伝マーカーを見つけるのに役立ちます。癌細胞の侵入および転移に重要な遺伝子の多くが同定され、特徴付けられているが、転移ドライバと転移抑制剤の発現レベルおよび活性は、疾患進行の重要な側面である可能性がある9、 ¹⁰.

遺伝子発現を超えて、インビトロ侵血アッセイは、癌細胞侵入11、12を促進または予防するマイクロRNAおよび他のレギュレータの役割を研究するためにも用いられている。インビトロ侵食セットアップ法は、阻害剤、多細胞型腫瘍環境、CRISPR編集細胞、または細胞増殖環境の短期的な変化の研究に使用することができる。汎用性および適応性はこのアッセイを非常に有利にする。

侵侵アッセイは、腫瘍の進行に寄与または予防する遺伝子および因子の分析の第一段階で使用されてもよい。例えば、Yan et al. (2010) (2010) は、インビトロ侵襲アッセイを用いて、非常に積極的な乳癌細胞株MDA-MB 231¹³によるEMT抑制におけるGATA-3の役割を定義した。その後、この抑制がインビボアッ^セイ13で転移を形成する能力の低下と相関していることを示すことができた。潜在的な治療戦略は、最初にマトリゲルを介した侵入を制限する経路阻害剤の能力によって特徴付けることができる, また、動物モデルにおける腫瘍形成に対するこれらの阻害剤の効果と相関する.インビトロ侵侵略アッセイは、既知および潜在的なオンコ遺伝子および相互作用パートナーのより詳細な分析に使用することができる。例えば、オンコタンパク質の既知の機能的モチーフの分子解剖または変異の迅速な分析は、初期スクリーンまたは有意性の評価としてインビトロ侵入アッセイで行うことができる。これは重要なドメインに関する貴重な洞察を提供するだけでなく、分子レベルでの細胞表現型の機能的理解を提供することができます。

ボイデンチェンバーの侵略アッセイには多くの利点がありますが、限界があります。例えば、侵襲アッセイは転移の初期段階の1つであるイントラバシスのみを調べているが、癌細胞が二次的な位置を植民地化する場合の後のステップは見ていない。したがって、転移の可能性の部分的なビューのみを結論付けることができます。アッセイの22時間の長さは柔軟ですが、非同期細胞集団の侵入を測定する微妙な変化を歪める可能性のある細胞分裂を排除することはできません。ミトマイシンCなどの阻害剤は、急速に潜血細胞の場合に細胞分裂を防ぐために使用することができる。最後に、化学タキシスのための5%FBS溶液の使用は、時間の経過とともにゆっくりと拡散し、上下の部屋の間で平衡化します。タンパク質ゲルの密度は、この拡散を遅くし、ゲルと膜(幸栓軸)を横切って横方向に移動するか、タンパク質マトリックスを通して、より高濃度のFBS(ケモタキシス)に向かって毛穴を通って移動するオプションを細胞に提示します。代替ケモタキシス剤は、侵襲に対する代替時間許容量を置換または短時間で、平衡化前に侵入した細胞のみを測定するために使用することができる。このアッセイを非常に有用にするカスタマイズを可能にするインビトロ侵略アッセイの剛性ではなく、柔軟性です。このアッセイの将来の適応には、化合物の大規模スクリーニング、遺伝子発現変化、および対立遺伝子特異的薬物有効性の評価が含まれる。さらに、循環媒体を持つ二重チャンバーシステムは、タンパク質マトリックスを介して侵入し、液体環境を横断し、二次的な場所で第2のタンパク質マトリックスに再確立するために細胞に挑戦することができます。最後に、癌細胞が交差するのがより困難になる非侵襲細胞の単層のようなインビトロ浸潤アッセイシステムとより挑戦的な膜を使用することができる。

著者は何も開示していない。

この研究は、国立衛生研究所の助成金R15CA169978によって支援されました。追加の資金はビジャノバ大学から来ました.