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インビトロ細胞侵入アッセイは、タンパク質マトリックスを含む細胞培養インサートを用いて細胞侵入および移動の細胞電位を定量化することにより、癌転移の可能性を測定するために使用される。細胞は、タンパク質マトリックスと多孔質膜を通って、化学集化剤に向かって移動し、光顕微鏡で定量化することに挑戦される。
インビトロ侵食アッセイは、ボイデン室のタンパク質が豊富なマトリックスを使用して、培養細胞がマトリックスを通過する能力と多孔質膜を癌細胞転移の初期段階に類似したプロセスで測定します。試験された細胞は、遺伝子発現のために変更したり、インヒビターで処理して侵入電位の変化をテストすることができます。この実験は、マウス乳腺腫瘍細胞の積極的な表現型をテストし、細胞侵入を促進する潜在的な腫瘍遺伝子を発見し、特徴付ける。しかし、この技術は汎用性が高く、多くの異なるアプリケーションに適応できます。実験自体は1日で行うことができ、結果は1日未満で光顕微鏡検査によって取得されます。結果には、比較および分析のための侵入細胞の数が含まれます。インビトロ侵血アッセイは、生体内アッセイに関与する前に初期評価として使用できる培養中の細胞挙動を決定するための迅速で安価で明確な方法です。
インビトロ侵血アッセイは、転移の最初のステップに類似したタンパク質被覆膜を通って移動する細胞の能力を測定する際に有用なツールでありうる。悪性癌細胞の重要な特徴は、近くの組織を介して移動し、侵入する能力です。転移または転移した癌は、より多くの治療上の課題を提起し、長期生存率が低い一方で、局所的な腫瘍は治療が容易であり、長期生存率が高い。転移するためには、癌細胞は原発腫瘍を残して循環器系またはリンパ系に移行しなければならず、細胞外マトリックスおよび地下膜1を通過する必要があるプロセスである。上皮間葉転移(EMT)と呼ばれるプロセスでは、腫瘍細胞は細胞間接触を破り、方向に移動し、近くの血液またはリンパ管に侵入しなければならない。この転移カスケードの最初のステップは、これらのステップが癌を死語させることができるものであるので、大きな関心があります。転移の初期段階に関与する遺伝的およびエピジェネティックな要因は、多くの研究の焦点ですが、インビボとインビトロの両方でこれらの初期のステップをテストするには、正確で信頼性の高い実験ツールが必要です。
創傷治癒(スクラッチ)アッセイやソフト寒天アッセイなどの3D環境での増殖などの細胞移動の変化を測定するツールは、部分的に転移の初期段階を測定する実験的方法の必要性に対処することができますが、侵入を測定するためのアッセイは、プロセスは複雑な腫瘍微小環境内で体内で起こるので、より困難です。薬物や遺伝子改変をスクリーニングして侵入および転移の重要な因子を決定する目的で、培養細胞をインビトロで使用し、生体内の転移細胞が直面する課題を模倣することができるシステムが侵襲アッセイ2、 3.乳癌は女性で最も一般的に診断されたタイプの癌であり、女性の癌死の第二の主要な原因であり、乳癌細胞の侵入と転移の原因となる遺伝子を理解することは公衆衛生にとって非常に重要です。さらに、マウス細胞は、乳癌とその進行を研究するための有用なモデルシステムである。
インビトロ侵略アッセイは、成長培地の2つのチャンバーが多孔質膜3によって分離されているボイデン室アセンブリに基づいています。腫瘍微小環境を模倣するために、タンパク質が豊富なゲルは、一方のチャンバー内の細胞を他方の化学刺激剤から分離し、基体膜バリアとして作用するようにも含まれる。化学集化剤に向かって移行するためには、細胞はまずタンパク質が豊富な障壁を通過し、次に多孔質膜を通過する必要があります。タンパク質が豊富なゲルは、実験のニーズに基づいて変更することができるが、通常、コラーゲン、または基基膜抽出物(例えば、Matrigel)4から構成される。これは、タンパク質、プロテオグリカンおよび成長因子の複雑な混合物であるが、主にラミニンとコラーゲンIV 4、5で構成されている。細胞は、典型的にはポリカーボネート、ポリエステル、またはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)で作られた多孔質膜を通過する必要があります。膜は、タンパク質ゲル(典型的にはコラーゲン)の有無にかかわらず商業的に購入されてもよいし、またはゲルを別途購入して添加してもよい。細孔のサイズは細胞のサイズに基づいて調節することができる。細孔サイズは0.4~8.0 μmで利用可能ですが、3.0~8.0 μmの細孔のみが細胞移動に十分な大きさです。侵襲アッセイは、細胞が移動して侵入する能力に対する阻害剤の有効性を決定するために使用されてきた。インビボに存在する正確な腫瘍微小環境を欠いている間、インビトロ侵受アッセイは動物モデルの必要性を最小にしながら、短時間で多くの条件をスクリーニングする上で有益である。これらの実験の目的は、疑わしい腫瘍遺伝子の遺伝子発現を比較し、インビトロ侵血アッセイおよびその他の試験を用いて癌細胞の挙動および疾患の攻撃性に及ぼす影響を決定することです。全体として、侵受アッセイは、比較的安価で、わかりやすく、適応可能な方法である一方で、転移電位を決定するための一貫性のある定量的かつ迅速な結果を提供します。
すべての実験と方法は、ビラノバ大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたように行われました。
1. 培養マウス乳腺腫瘍細胞における遺伝子発現
2. インビトロ侵略アッセイ
3. イメージングと解析
タンパク質マトリックスを介したインビトロ侵来のこの方法は、亜鉛フィンガータンパク質ZC3H88の発現を変化させたマウス乳腺腫瘍細胞の積極的な表現型および発因性細胞行動を評価するために用いた。また、3D環境における細胞の移動と増殖を調べる他のアプローチと併せて、腫瘍細胞株におけるZc3h8のより高い発現、またはプラスミドからのプロモーター媒介発現により、細胞の急速な速度をもたらしたことがわかった。増殖、高速移行、3D環境での成長、およびインビトロ侵入アッセイ8の侵略の増加。逆に、shRNA構築物による発現の減少は、より積極的な増殖、移行、および侵入8をもたらした。これらの結果は、Zc3h8のより高い発現が急速に現れる大きな腫瘍を産生する生体内で確認されたが、発現の減少は、より小さく、頻度の低い腫瘍を産生した8。
この研究を拡張するために、Zc3h8発現のshRNA媒介ノックダウンを救い出すことができる発現プラスミドをマウス乳細胞で安定的にトランスフェクトし、これらの細胞において積極的な細胞増殖と挙動が再確立できるかどうかを評価した。すべてのノックダウンと表現の救助は、ウェスタンブロットまたはRT-qPCR8によって検証されました。侵略アッセイは、24ウェル皿のチャンバーあたり5,000セルで使用され、図1および図2に示すように写真で文書化された。図3は、Zc3h8発現のshRNAノックダウン時に細胞侵入がどのように減少したかを示す侵入アッセイの結果を示すが、その発現が救出されたときにその侵入が救出される。これらのデータは、侵入アッセイが、より高価で長いアプローチに着手する前に、インビトロで細胞株をテストするための迅速な方法を提供できることを示しています。
図1:侵入アッセイ成分。(A)24ウェル組織培養皿用ボイデン室挿入物。(B) 細胞との22時間インキュベーション後の固定、染色、洗浄に用いられる24ウェル組織培養皿。数値 1、2、および 3 は、単一のセルラインの反復です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:時間スケールを持つ侵入アッセイフローチャート。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:腫瘍性表現型を変化させるZc3h8の発現のために変化したマウス乳腺腫瘍細胞のサンプル侵入アッセイ結果。(A, B)マウス乳腺腫瘍から単離された細胞は、mRNAの対照配列またはZc3h8 mRNAを標的とするshRNAを用いたsRNAを用いた安定的にトランスフェクトした。(C)後の細胞株は、shRNAの影響を受けるように設計された組換えZc3h8を発現することによって救出された。細胞は結晶紫色で染色され、光顕微鏡を使用して10倍の倍率で捕捉されます。スケールバー= 500 μm. (D) Zc3h8の発現の減少は、侵入細胞の数および転移電位を減少させたことを示す定量化。遺伝子発現の救助は細胞の侵入のより高い率を救う。値は、24 ウェルの侵入アッセイ挿入物からの侵入セルの合計数を表します。実験における各反復について、侵略細胞の平均数を算出した。これを3回の実験で繰り返した。誤差余数は、平均の標準誤差を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
インビトロ侵血アッセイは、癌細胞の侵入を促進する因子を研究するための安価で、迅速、定量的、および簡単な方法である。乳癌は、女性の間で最も一般的に診断された癌です。乳癌の3つの主要なサブタイプのうち、トリプルネガティブ(またはER-、PR-、HER2/neu-)は、最も攻撃的で、転移する可能性が最も高く、最も致命的な9である。したがって、転移をもたらす遺伝子や発現を理解することは、疾患の新しい治療目標と遺伝マーカーを見つけるのに役立ちます。癌細胞の侵入および転移に重要な遺伝子の多くが同定され、特徴付けられているが、転移ドライバと転移抑制剤の発現レベルおよび活性は、疾患進行の重要な側面である可能性がある9、 10.
遺伝子発現を超えて、インビトロ侵血アッセイは、癌細胞侵入11、12を促進または予防するマイクロRNAおよび他のレギュレータの役割を研究するためにも用いられている。インビトロ侵食セットアップ法は、阻害剤、多細胞型腫瘍環境、CRISPR編集細胞、または細胞増殖環境の短期的な変化の研究に使用することができる。汎用性および適応性はこのアッセイを非常に有利にする。
侵侵アッセイは、腫瘍の進行に寄与または予防する遺伝子および因子の分析の第一段階で使用されてもよい。例えば、Yan et al. (2010) (2010) は、インビトロ侵襲アッセイを用いて、非常に積極的な乳癌細胞株MDA-MB 23113によるEMT抑制におけるGATA-3の役割を定義した。その後、この抑制がインビボアッセイ13で転移を形成する能力の低下と相関していることを示すことができた。潜在的な治療戦略は、最初にマトリゲルを介した侵入を制限する経路阻害剤の能力によって特徴付けることができる, また、動物モデルにおける腫瘍形成に対するこれらの阻害剤の効果と相関する.インビトロ侵侵略アッセイは、既知および潜在的なオンコ遺伝子および相互作用パートナーのより詳細な分析に使用することができる。例えば、オンコタンパク質の既知の機能的モチーフの分子解剖または変異の迅速な分析は、初期スクリーンまたは有意性の評価としてインビトロ侵入アッセイで行うことができる。これは重要なドメインに関する貴重な洞察を提供するだけでなく、分子レベルでの細胞表現型の機能的理解を提供することができます。
ボイデンチェンバーの侵略アッセイには多くの利点がありますが、限界があります。例えば、侵襲アッセイは転移の初期段階の1つであるイントラバシスのみを調べているが、癌細胞が二次的な位置を植民地化する場合の後のステップは見ていない。したがって、転移の可能性の部分的なビューのみを結論付けることができます。アッセイの22時間の長さは柔軟ですが、非同期細胞集団の侵入を測定する微妙な変化を歪める可能性のある細胞分裂を排除することはできません。ミトマイシンCなどの阻害剤は、急速に潜血細胞の場合に細胞分裂を防ぐために使用することができる。最後に、化学タキシスのための5%FBS溶液の使用は、時間の経過とともにゆっくりと拡散し、上下の部屋の間で平衡化します。タンパク質ゲルの密度は、この拡散を遅くし、ゲルと膜(幸栓軸)を横切って横方向に移動するか、タンパク質マトリックスを通して、より高濃度のFBS(ケモタキシス)に向かって毛穴を通って移動するオプションを細胞に提示します。代替ケモタキシス剤は、侵襲に対する代替時間許容量を置換または短時間で、平衡化前に侵入した細胞のみを測定するために使用することができる。このアッセイを非常に有用にするカスタマイズを可能にするインビトロ侵略アッセイの剛性ではなく、柔軟性です。このアッセイの将来の適応には、化合物の大規模スクリーニング、遺伝子発現変化、および対立遺伝子特異的薬物有効性の評価が含まれる。さらに、循環媒体を持つ二重チャンバーシステムは、タンパク質マトリックスを介して侵入し、液体環境を横断し、二次的な場所で第2のタンパク質マトリックスに再確立するために細胞に挑戦することができます。最後に、癌細胞が交差するのがより困難になる非侵襲細胞の単層のようなインビトロ浸潤アッセイシステムとより挑戦的な膜を使用することができる。
著者は何も開示していない。
この研究は、国立衛生研究所の助成金R15CA169978によって支援されました。追加の資金はビジャノバ大学から来ました.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well plates | Corning | 353504 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
BALB/c mice | |||
Cell Culture Incubator | |||
Cell Culture Treated Flasks | |||
Clinical cenrifuge | |||
Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
Distilled water | |||
DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
Ethanol | |||
FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
Forcepts | |||
Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
Hemocytometer | |||
Imersion oil | |||
Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
Light Microscope | |||
Lipofectamine Transfection Reagent | |||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
PBS | |||
Scalpel, disposable | #11 | ||
shRNA | |||
Sterile Transfer pipet | |||
Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
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