Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

A cobaia tem desempenhado um papel central como um modelo animal pequeno relevante no desenvolvimento de vacinas para doenças infecciosas como a tuberculose, gripe, difteria e febres hemorrágicas virais. Nós demonstramos que entrega de vacina plasmídeo-DNA (pDNA) na pele provoca respostas humorais robustas o porquinho. No entanto, a utilização deste animal a respostas imunes de modelo era um pouco limitada no passado devido à falta de reagentes disponíveis e protocolos para estudar respostas de células T. As células T desempenham um papel crucial em imunoprofilaticos e mecanismos de imunoterapia. Noções básicas sobre respostas de célula T é crucial para o desenvolvimento de doenças infecciosas e vacinas de Oncologia e acomodando dispositivos de entrega. Aqui descrevemos um ensaio enzima-lig immunospot (ELISpot) de interferon-gama (IFN-γ) para cobaia células mononucleares de sangue periférico (PBMC). O ensaio permite que pesquisadores caracterizar respostas de células T específicas vacina neste importante modelo de roedores. A capacidade de células isoladas do sangue periférico de ensaio fornece a oportunidade de acompanhar a imunogenicidade em animais individuais.

O protocolo descrito aqui permite a detecção de interferão-gama células segrega (IFN-γ) após a recordação de antígeno em uma população de células mononucleares (PBMC) de sangue periférico colhida do Hartley cobaias. Temos aplicado o ensaio para caracterizar a cinética e magnitudes das respostas de célula T de antígeno-específicas para um regime de vacinação gripe do porquinho. Acreditamos que este protocolo significativamente irá impulsionar o desenvolvimento pré-clínico de programas de vacinação neste modelo animal altamente relevantes.

Células T eliciadas vacinas desempenham um papel essencial na proteção contra agentes infecciosos e os caminhos de imunoterapia associados com outras doenças. A importância das células T tem sido destacada em vários estudos de vacina. Imunização de furões e ratos com um plasmídeo de DNA (pDNA) codificação para H5 hemaglutinina e proteção de neuraminidase fornecido N1 de morbidade e mortalidade em um desafio de vírus de gripe na ausência de anticorpos, indicando a importância de neutralizantes Imunidade de célula t¹. Além de forte neutralizando a resposta humoral, as células T desempenham um papel crucial para liberação viral² , não só mas também proteção contra infecção por vírus sincicial respiratório (VSR) em ratos³. Nos seres humanos, células CD8 + T pre-existentes foram associadas com severidade da doença diminuiu durante o H1N1 pandemia em 2009⁴. Contagem de células CD4 + T, juntamente com certa citocinas concentração de plasma está correlacionadas com a severidade da doença em crianças infectadas RSV⁵.

A cobaia ganhou destaque como um modelo de laboratório de pesquisa e desenvolvimento em diversas áreas da medicina, tais como sensibilização da pele, pesquisa nutricional, estudos do sistema auditivo e, mais relevante para este trabalho, as doenças infecciosas. Foi crucial para a descoberta de vacinas contra a tuberculose e a difteria. Mais recentemente, a cobaia é usada como um modelo para Influenza⁶ e Ebola⁷. Além disso, possuir semelhanças fisiológicas com pele humana⁸, a cobaia oferece um modelo animal pequeno acessível para os métodos de entrega de droga dérmica. Em contraste com a sua importância como um modelo de laboratório, a disponibilidade de ensaios específicos de cobaia e sondas para caracterizar respostas imunes permanece limitada⁹. Ensaios de celulares básicos tais como o IFN-γ enzima-lig immunospot (ELISpot-ensaio) que é usada rotineiramente na investigação pré-clínica e clínica para enumerar as respostas de células T não estão disponíveis.

Os primeira fase sólida enzima-lig immunospot ensaios foram usados para determinar o número de células secretoras de anticorpos específicas em uma célula B-população diversa de^10,11. O formato tem avançado para detectar células secretoras de citocinas, incluindo Il-1, Il-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-alfa, TNF-beta, granzime B e GM-CSF. O ensaio ELISpot possui alta sensibilidade; potencialmente, cada célula de produção de citocinas pode ser detectada. O limite de detecção para ensaios de ELISpot foi relatado para ser inferior a 10 pontos por 100.000 PBMCs¹². Recentemente, um par de anticorpo específico de IFN-γ-cobaia foi feito disponível¹³, e isso abriu a oportunidade de abordar esta deficiência no campo.

IFN-γ é considerada uma molécula efetora importante na resposta imune adaptativa; pode ser produzido e secretado pelas células CD4 e CD8 T tanto após a ativação. IFN-γ tem uma ampla gama de biológico funções no contexto de uma resposta imune a uma infecção de vírus, tais como a ativação de macrófagos e o Regulamento acima do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), eu e a expressão de MHCII. Também promove a diferenciação de células B, inibe o crescimento de célula T-auxiliar-2 e ativa as células assassinas naturais. IFN-γ bloqueia a replicação viral em células somáticas infectadas e upregulates expressão de moléculas de MHC. Assim, a produção de IFN-γ é uma indicação muito importante da qualidade da resposta celular T para uma vacina ou agente patogénico.

Um aspecto importante do ELISpot de IFN-γ aqui apresentado é o uso de PBMC, ao invés de splenocytes¹³. PBMC pode ser obtida pelo processamento de uma amostra de sangue coletada não-terminal, Considerando que a coleção de splenocytes requer a eutanásia de animais antes da colheita do baço. O uso de PBMC permite respostas de IFN-γ T-celular a ser monitorado durante um período de tempo e a avaliação dos efeitos sobre as respostas de células T como regimes prime-boost¹⁴.

Para os investigadores que estão usando atualmente a cobaia como um modelo animal, o método de IFN-γ ELISpot ampliará a gama de dados científicos que se pode ganhar. Sua disponibilidade agora pode reduzir a necessidade de realizar estudos com modelos animais menos relevantes para a doença-alvo, que anteriormente foram escolhidos devido à disponibilidade do reagente para o exame das respostas celulares. O uso de PBMC ao invés de baço ou linfonodos permite experimentos não-terminal e monitoramento contínuo de animais individuais.

Abaixo, nós fornecemos uma descrição detalhada das etapas envolvidas na detecção de uma resposta celular de IFN-γ em cobaias para pDNA vacina. Podemos delinear nosso procedimento de entrega específico e descrever o ensaio ELISpot geral, englobando a recolha de amostras de sangue, processamento de sangue, colheita PBMC, procedimento de ensaio e análise de dados. Um esquema do ensaio ELISpot é retratado na Figura 1.

Figura 1 : Visão esquemática do porco Guiné ELISpot protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) de Acculab e cuidado Animal.

Nota: O protocolo requer o uso de materiais potencialmente perigosos. Por favor refira MSDS do fabricante e usar equipamento pessoal adequado (EPI) durante todo o procedimento.

1. preparação do cobaia imunização local, intradérmica Mantoux-injeção e CELLECTRA-3P-EP-procedimento

1. Preparação do local do tratamento sobre a cobaia.
   1. Coloque o porco da Guiné em uma câmara de indução e anestesiar a 5% vapor de isoflurano.
   2. Remover o animal da câmara e colocar o cone de nariz em posição, fornecendo vapor de isoflurano 2% para manter a anestesia durante o procedimento.
   3. Raspe a região de cerca de 4 cm² no flanco abdominal.
   4. Desinfete a área depilada com etanol-cotonete.
2. Injeção de procedimento pDNA-formulação e eletroporação.
   1. Use uma seringa de insulina para injetar 100 µ l formulação dentro da derme através da técnica de Mantoux. Agulha é inserida em bisel acima em um ângulo de 10 graus com o corpo do animal.
   2. Retire a agulha e imediatamente inserir a matriz de eletrodo CELLECTRA® - 3P através da injeção-pápula e aplicar o campo elétrico.
   3. Retire o animal da anestesia e acompanhar sua recuperação.

2. Non-terminal sangrar

1. Coleta de sangue da veia jugular de cobaia anestesiada.
   1. Coloque o porco da Guiné em uma câmara de indução e anestesiar o animal conforme descrito em 1.1.1
   2. Utilizando uma seringa de 3 ml com agulha 27 1/2 polegada, pontuam a veia jugular do animal anestesiado e coletar 3 ml de sangue.
   3. Transferir imediatamente o sangue num tubo de colheita de sangue K2EDTA, inverter o tubo várias vezes para misturar o sangue com anticoagulante e lugar no gelo.
      Nota: Evitar a coagulação do sangue é crucial para o sucesso a jusante processamento da amostra de sangue.
   4. Monitore a recuperação do animal.

3. processamento de amostra de sangue

1. Separação de PBMC de sangue total por centrifugação gradiente de densidade
   1. Dilua 1:1 com Hank está equilibrado sal solução (HBSS) de sangue.
      Nota: Para evitar a contaminação de todo o trabalho a partir de agora deve ser executada em um armário de biossegurança, aplicando uma técnica asséptica.
   2. Camada diluído sangue gradualmente mais 4,5 ml Ficoll-Paque Plus em um tubo de 15 ml-cônico. Evite a perturbação da interface. Nota: Para assegurar a separação adequada, Ficoll-Paque deve estar à temperatura ambiente.
   3. Centrifugar tubos no rcf 800 por 30 min com freio fora.
      Nota: como alternativa, SepMate™ tubos (STEMCELL Technologies) pode ser usada para a separação de PBMC. HBSS-diluído sangue é adicionado ao tubo de 15 ml SepMate preenchido com 3,5 ml Ficoll-Paque Plus e então centrifugadas a rcf 1200 por 10 min (travão). Esta técnica de centrifugação gradiente de economia de tempo resulta em viabilidade igual, célula-rendimento e local-formação.
   4. Camada de Buffy-Coat da colheita e diluir em meio de R10 (10% (v/v) calor-desactivado FBS e 1% (v/v) caneta/Strep no meio RPMI1640) para um volume total de 15 ml.
   5. Pellet de células por centrifugação em 450 rcf por 5 min.
   6. Lave as células duas vezes com R10 médio.
   7. Ressuspender as células em 1 ml de R10 e passar celular-suspensão através de 70 µm célula-filtro em para um novo tubo.
   8. Contar as células e determinar o número de células vivas pela coloração azul Trypan.
   9. Diluir as células com R10 médio a uma concentração de 1 x 10 ^ 6 células vivas por ml.

4. preparação de placas de ELISpot e célula-estimulação

1. Casaco e bloco poços de uma placa de ELISpot PVDF-membrana de 96 poços antes de semear o PBMC.
   1. Placas devem ser previamente tratadas por 60 segundos. Pré-tratamento de etanol irá resultar em menos inespecíficos local-formação e manchas com melhor definição.
      Nota: Tome cuidado extra para garantir a completa membrana entra em contato com 15 µ l 35% etanol.
   2. Após 60 segundos adicionar 150 µ l 1X PBS por bem e então esvazie poços invertendo-se as placas.
      Nota: O pré-tratamento de etanol é muito sensível ao tempo. Não incube a membrana-bem mais do que 60 seg. membranas não deve secar durante as seguintes etapas do procedimento.
   3. Lave pratos três vezes com 250 µ l 1X PBS por bem.
   4. Casaco com 100 µ l/poço de 5 µ g/ml captura anticobaia anticorpo de IFN-γ V-E4 em PBS.
   5. Incubar as placas pelo menos 12 horas a 4° C.
   6. Lave pratos, adicionando 250 µ l/poço PBS três vezes.
   7. Adicionar 200 µ l/poço reserva bloqueio (10% (p/v) de sacarose e 2% (p/v) BSA em PBS) e incube por 2 horas a temperatura ambiente.
   8. Lave pratos com 250 µ l/poço PBS três vezes.
2. Placa PBMCs com peptídeos do antígeno-específicas, controles positivos e negativos.
   1. Dilua a piscina de proteína-peptídeo em R10 a concentração de peptídeo final desejado.
   2. Ensaio as amostra PBMCs em triplica.
      Nota: Adicione primeiro o meio com estimulantes para as placas de ELISpot e adicionar a suspensão PBMC segundo.
   3. Adicione 50 µ l de peptídeo-R10 médio indicado aos poços.
   4. Para controle negativo adicione 50 µ l formulação de peptídeo vazio no R10 em poços indicados.
   5. Para controle positivo Adicione 5 µ g/ml Concanavalina A (ConA) no meio de R10 em poços indicados.
   6. Adicionar 100 µ l de suspensão de células PBMC de todos os poços
   7. Incubar as placas em atmosfera de 5% CO2 umidificado no 37° Celsius para 18 hrs.
      Nota: Lugar ELISpot placas sobre um superfície/rack mesmo na incubadora e evitar qualquer perturbação das placas durante o tempo de incubação.

5. detecção dos pontos positivos de interferão-gama

1. Incubação com deteção anticorpo e placa de desenvolvimento.
   Nota: Para todas as etapas desta seção não é necessária nenhuma técnica asséptica.
   1. Cuidadosamente, retirar as placas da incubadora e com segurança esvaziar poços. Lave pratos, adicionando 250 µ l/poço PBS por três vezes.
   2. Adicione 100 µ l/poço de 2 µ g/ml deteção cobaia anti-IFN-γ biotinilado N-G3 diluído em tampão de bloqueio.
      Nota: Filtro (22 µm) Anticorpo a solução para reduzir a fundo.
   3. Incube com o anticorpo da deteção para 2 horas à temperatura ambiente.
   4. Descarte o sobrenadante e lavar pratos, adicionando 250 µ l/poço PBS três vezes.
   5. Adicionar 100 µ l/poço de fosfatase alcalina (FAL ou ALP)-estreptavidina conjugado diluído em tampão de bloqueio.
      Nota: Filtro (22 µm) solução para reduzir a fundo.
   6. Incube com ALP-estreptavidina conjugado por 1 hora em temperatura ambiente.
   7. Descartar a solução de ALP-Streptavidin e lavar pratos, adicionando 250 µ l/poço PBS duas vezes e remover excesso PBS, inverter a placa e borrá-lo contra uma toalha de papel limpo.
   8. Lavar pratos, adicionando 250 µ l/poço DI ultrapura água uma vez e remover o excesso de água, invertendo a placa e borrá-lo contra uma toalha de papel limpo.
   9. Adicione 100 µ l de solução de substrato BCIP/NBT (cuidado) em cada poço. Cuidado: BCIP/NBT é altamente inflamável e tóxico se ingerido, em contacto com a pele, ou inalado. Antes de usar consulte o MSDS.
   10. Incube durante 20 min em temperatura ambiente protegida da luz.
   11. Lave a placa 4 vezes com água desionizada. Inverter a placa e para remover o excesso de água.
   12. Retire o plástica drenagem inferior de placas de ELISpot e permitir que as placas secar.
   13. Quantificar os pontos manualmente ou usando um leitor de ELISpot automatizado, por exemplo o leitor de placa CTL-Immunospot S6.

Os resultados aqui apresentados servem como uma referência para os resultados esperados, o uso do presente protocolo, enfatizando a importância das etapas cruciais e confirmando os benefícios de otimizações descritos a seguir.

Após a centrifugação gradiente de densidade, conforme descrito na etapa 3.1 do protocolo, o líquido viscoso vermelho na parte inferior do tubo irá conter a maioria das células vermelhas do sangue. Como mostrado na Figura 2A, acima os glóbulos vermelhos é uma camada da meio-densidade. Entre uma camada de plasma claro ou amarelo na parte superior e a densidade gradiente médio é a camada de revestimento branco ou claro marrom de buffy, que contém a maioria dos glóbulos brancos e plaquetas. Separação incompleta se manifestaria como a presença de células vermelhas do sangue em cima do meio de gradiente de densidade. A coloração vermelha do plasma na Figura 2 é provavelmente devido à hemólise, como esta amostra de sangue foi armazenada no tubo da coleção 1,5 h antes de serem processadas. Figura 2 B mostra o gradiente antes (esquerda) e após centrifugação (à direita) no dispositivo de isolamento de PBMC. Amostra de sangue em Figura 2B foi processada com atraso mínimo após coleta de sangue e a coloração de plasma é amarelo.

O efeito de pre-molhando as membranas com etanol (ver passo 4.1 do protocolo) no desenvolvimento local é mostrado na Figura 3. Manchas em poços previamente tratadas exibir a melhor definição, e há uma redução no número de pontos em poços de controlo negativo médio/DMSO(Figura 3). Viabilidade típica de cobaia transformada PBMCs varia em torno de 90% e é semelhante tanto para tubos de 15ml regular e dispositivos PBMC-isolamento (Figura 3B). Rendimento de células viáveis de uma amostra de sangue de 3ml geralmente varia entre 3 x 10⁶ e 5 x 10⁶.

Os animais foram imunizados com plasmídeo codificação a cadeia (NP) de estirpe da gripe H1N1 A/PuertoRico8. A Figura 4 mostra a enumeração das respostas a células T IFN-γ apresentado como ponto-formando unidades (SFU) geradas em toda a duração de um regime de vacinação. Ensaio ELISpot com PBMCs colhidas de animais não-imunizadas resultados nas contagens de ponto insignificantes (sem tx). Quatorze dias após a primeira imunização (prime), uma média de 970 pontos de IFN-γ por milhões PBMC foram contados após estimulação imunogênica. Sete dias após a imunização segundo (impulso), respostas de células T contra todas as três piscinas foram expandidas, atingindo uma média de 5020 IFN-γ SFUs/10⁶ PBMCs. quarenta e seis dias após a imunização segundo (memória), uma média total de SFUs de IFN-γ 6310/10 ⁶ PBMC foram contado no sangue periférico.

LEGENDAS DAS FIGURAS:

Figura 2 : Imagens representativas das camadas após a centrifugação gradiente de densidade. Amostra de sangue do (A) antes (esquerda) e após centrifugação (à direita) em tubos de regulares. (B) sangue da amostra antes (esquerda) e após centrifugação (à direita) em dispositivos de PBMC-isolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Otimização do protocolo. (A) típica aparência de IFN-γ pontos positivos em uma placa de ensaio ELISpot bem desenvolvido de acordo com o protocolo. Poços de três vias de exemplo são mostrados após pré-tratamento com etanol (à direita) ou sem pré-tratamento (à esquerda). As células foram incubadas durante a noite ou com DMSO (topo) como controle de não-estímulo, peptídeos do antígeno correspondente (médio), ou o mitógeno ConA (parte inferior). PBMC originada-se do mesmo animal individual. Poços foram fotografados usando um scanner de placa automatizado. (B) comparação de diferentes tubos de gradiente de densidade em células transformadas. 3 mL de amostras de sangue de 3 cobaias individuais foram coletados. 1,5 mL de cada amostra foram processados usando tubos regulares (médio gradiente de densidade) ou dispositivos de PBMC-isolamento. Viabilidade (esquerdo, % ± SEM) e o número de células vivas (bem, x 10⁶ ± SEM) foram determinados utilizando uma célula automática contando sistema e ensaio de exclusão trypan azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Deteção de robustas celular imune respostas ao longo de um regime de vacinação. Nos dias 1 e 15, 30 µ g de pDNA codificação cadeia de gripe A (NP) foi entregue dermally intra abdominal flanco de cobaias de Hartley, seguido imediatamente pela pele-eletroporação. Resposta de IFN-γ ELISpot foi medida 14 dias após a primeira imunização (prime) e 7 dias (impulso) e 46 dias (memória) após a segunda imunização. Significa SFUs + SEM foram plotado para 5 cobaias tratadas e 2 cobaias não tratadas (sem tx). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A cobaia é um modelo animal valioso para o desenvolvimento pré-clínico de vacinas e estratégias de entrega intradérmica. O protocolo acima descreve a metodologia para medir respostas de célula T de antígeno-específicas neste modelo altamente relevantes. O ensaio fornece uma enumeração clara de periféricos T-células produtoras de interferão-gama após estimulação com peptídeos do antígeno-específicas. A cinética da resposta imune pode ser monitorada por amostragem de sangue não-terminal.

Temos otimizado o protocolo e identificou aspectos críticos para obter melhores resultados usando este ensaio. Por exemplo, a formação de coágulos de sangue no tubo de coleta resultará na viabilidade e recuperação PBMC suboptimal. Coágulos de sangue de porco da Guiné rapidamente¹⁸. É crucial realizar o sorteio de sangue rapidamente. Au-Birck et al fornecer um guia completo para técnicas no modelo cobaia¹⁶a sangrar. Desde a coleta de sangue requer anestesia geral, recomenda-se revisar os procedimentos habituais de funcionamento aplicáveis deste aspecto dos procedimento¹⁹. Insuficientemente anestesiadas cobaias reagirá movendo suas pernas ou vocalização após uma breve pitada do tecido entre os dedos com as unhas ou vacilar seus ouvidos e movendo que seus bigodes encaminhar após beliscar a sua orelha. A transferência imediata do sangue em um tubo com anticoagulante e misturar cuidadosamente por rolamento ou inversão do tubo várias vezes é um passo essencial no presente protocolo. Para o protocolo descrito aqui, utilizaram-se tubos de EDTA, e não outros anticoagulantes foram testados. Por favor, note que o EDTA é hipertônica, tubos idealmente devem ser preenchidos completo mais da metade e, portanto, o tamanho adequado do tubo para o volume da amostra deve ser usado.

Quando realizada corretamente, centrifugação gradiente de densidade resultados consistentemente em preparação de PBMC limpa. A gradiente de densidade média deve estar à temperatura quando mergulhando o gradiente antes da centrifugação, e freios não devem ser usados para parar o centrifugador quando usar tubos de regulares. Uma melhoria significativa em termos de praticidade do PBMC-processamento foi a combinação de centrifugação gradiente de densidade com dispositivos de isolamento PBMC. Isto permite uma redução no tempo de centrifugação. Centrifugação gradiente de densidade em dispositivos de PBMC-isolamento e tubos regular resulta em viabilidade semelhante, célula viva conta de PBMC transformado e formação local. Independente do tipo de tubo usado para a separação, a colheita de buffy casaco deve seguir imediatamente. Durante um período prolongado de tempo, contato com o meio de gradiente de densidade é citotóxico para os PBMCs.

A contagem exata de PBMC viável é importante semente consistentemente igual número de células em poços de ensaio-placa. Deve ser aplicado um método de discriminação ao vivo/morto. Em nosso laboratório, usamos o ensaio de azul trypan exclusão e um contador de célula automatizado.

Qualidade local, definida como manchas contrastadas afiado e altas, irá resultar em maior precisão e contando ponto consistente, especialmente quando se utiliza um sistema automatizado de contagem. Em consonância com as recomendações do fabricante, observamos pré-tratamentos de etanol das placas de ELISpot para ser um passo crucial para reduzir o número de pontos do plano de fundo e melhorar a definição dos pontos. O uso de um leitor de placa para as ensaio ELISpot-placas no final do protocolo de imagem é altamente recomendado. Imagens originais de cada poço podem ser facilmente e eficientemente obtidas e armazenadas. Usando um software de análise de imagem imagens digitais também permitem uma análise objectiva e contando ponto comparado a contagem manual por operadores individuais.

Uma necessidade absoluta para o desenvolvimento do ensaio descrito aqui foi a geração de uma adequado cobaia antipar de anticorpo de interferão-gama. Antibodies monoclonal de rato V-E4 e N-G3 foram desenvolvidos pela técnica de hibridoma com clones de células B de ratos que foram imunizados com cobaia recombinante interferon gama²⁰. V-E4, que é o isotipo IgG1, e N-G3, que é IgG2a, são relatados para ligar os dois para o antígeno recombinante e nativo. Atribuindo V-E4 como o anticorpo captura e biotinilado N-G3 como o anticorpo da deteção resultou em alta sensibilidade para proteína recombinante e nativa, mantendo o sinal de baixo fundo em um formato de sanduíche-ELISA. Ambos os anticorpos estão disponíveis para a comunidade científica através de um acordo de fabricação conduzido pelo laboratório do Dr. Hubert Schaefer, que é co-autor desta publicação. Solicitações serão recebidas pelo laboratório do Dr. Schaefer e então fabricadas por um parceiro comercial.

Interferão-gama é relatado para ser instável em regular de buffers ou mídia²¹. Schaefer et al.²⁰ relatou apenas uma diminuição moderada da taxa de recuperação quando usando degradada IFN-y, que tinha perdido a funcionalidade biológica, em um formato de ELISA usando anticorpos V-E4 e N-G3. No entanto, aumentar o tempo de incubação de estímulo de peptídeo de PBMC mais 18 h deve ser cuidadosamente analisado.

As vantagens de usar PBMCs tem sido discutida. No entanto, o ensaio descrito aqui reflete apenas respostas antígeno-específicos circulantes de células T na periferia. Tecido-infiltrando-se células T ou células isoladas de órgãos linfáticos, como o baço e linfonodos, podem apresentar diferentes propriedades^22,23,24. Não há diferenças significativas nas respostas celulares foram observadas mediante comparação dos pontos de interferão-gama de PBMC e splenocytes de cobaias que foram imunizadas com a mesma gripe pNP vacina¹⁴.

Neste protocolo, descrevemos um procedimento de vacinação intradérmica. Uma justificativa principal para a imunização de ID tem como alvo a alta densidade de células dendríticas presentes na pele²⁵. Nós e os outros têm mostrado que essas células podem ser direcionadas especificamente, adaptando o método de entrega²⁶, formulação²⁷ou drogas-projeto²⁸. Células apresentadoras de antígeno profissionais ativadas podem migrar para um nó de linfa drenando e ativar o sistema imune adaptativo^29,30,31,32. Células dendríticas são o antigénio essencial apresentação-tipo de célula para aprontar produtivas respostas imunes de celular.

Para este estudo os animais foram imunizados com plasmídeo codificação a cadeia de gripe H1N1, estirpe A/PuertoRico/8. Entrega de pele desta vacina pDNA (pNP) em combinação com eletroporação tinha sido mostrada para eliciar respostas humorais de antígeno-específicas em cobaias³³, furões e primatas não-humanos (NHPs)^1,34. Além disso, esta vacina suscitou respostas de células T robustas em ratos após o parto para a epiderme,³⁵, que poderia ser atribuída ao CD4 e CD8 T-células, estimulando com peptídeos representando epítopos específicos para estas populações de células. A vacina pNP foi também imunogênica após a entrega da mucosa, como demonstrado pela geração de respostas humorais em coelhos e porquinhos da Índia, bem como a resposta celular e humoral em ratos³⁶. Mais recentemente, nosso grupo foi capaz de demonstrar a geração de respostas de IFN-γT-célula no coelho após entrega intramuscular (dados não publicados).

Atualmente, as manchas de interferão-gama observadas no guinea pig ELISpot não podem ser alocadas para um subconjunto de CD4 + ou células T CD8 +. Especialmente para a concepção e desenvolvimento de terapias imunes segmentação da pele, que seria muito útil determinar se mancha frequências observadas de interferão-gama são causadas pela expansão de um subconjunto específico ou uma resposta equilibrada de ambos para Avalie a eficácia da vacinação para acionar Cruz-apresentação. Esta limitação pode ser superada por negativo ordenação de célula CD4 ou CD8 antes da semeadura das células na placa ou pela identificação de MHC-classe II (para respostas de CD4) ou MHC-classe I (para respostas de CD8) restrito epitopos.

O ensaio de interferão-gama ELISpot aqui descrito usando cobaia PBMCs aborda a necessidade de avaliar o curso de respostas celulares no modelo cobaia de laboratório. Isso irá refinar o desenvolvimento de vacinas e protocolos de entrega de pele. Acreditamos que permite para o emprego deste modelo animal relevantes para o estudo de doenças com componentes de células T importantes como TB³⁷, Ebola³⁸, HSV³⁹e outros. Que irá reduzir o uso de modelos animais menos relevantes.

Os autores Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick e Trevor R.F. Smithare funcionários da Inovio Pharmaceuticals e como tal, receber salário e benefícios, incluindo a propriedade de estoque e opção de ações, da companhia.

Gostaríamos de agradecer aos membros da Inovio Pharmaceuticals D departamento de assistência técnica e pessoal do Acculab para fornecer o serviço de criação de excelência. Em especial, gostaríamos de agradecer Alysha Vu e Joe Agnes para revisão do manuscrito. Este trabalho não foi financiado por qualquer subvenção específica de agências de financiamento no setor público, comercial ou não-lucrativa.