Method Article
Nós apresentamos um protocolo para medir na cabeceira a atividade da endotoxina de amostras de sangue inteiras humanas. O ensaio da atividade da endotoxina é um teste simples a executar e pode ser um biomarcador útil em pacientes criticamente doentes com sepsis.
Lipopolissacaríno, também conhecido como endotoxina, é um componente fundamental das bactérias Gram-negativas e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da sepse e choque séptico. A identificação adiantada de um processo infeccioso que esteja evoluindo ràpida a uma doença crítica pôde alertar um tratamento mais rápido e mais intensivo, desse modo potencial conduzindo aos melhores resultados pacientes. O ensaio da atividade da endotoxina (ea) pode ser usado na cabeceira como um biomarcador de confiança do endotoxemia sistemático. A deteção de níveis elevados da atividade da endotoxina foi mostrada repetidamente para ser associada com uma severidade aumentada da doença nos pacientes com sepsis e choque séptico. O ensaio é rápido e fácil de executar. Brevemente, após a amostragem, uma alíquota de sangue total é misturada com um anticorpo antiendotoxina e com LPS adicionado. A atividade da endotoxina é medida como a explosão oxidativa relativa de neutrófilos primados como detectado pela chemioluminescência. A saída do ensaio é expressa em uma escala de 0 (ausente) para 1 (máximo) e categorizada como "baixa" (< 0,4 unidades), "intermediário" (0,4 – 0,59 unidades), ou "alta" (≥ 0,6 unidades). A metodologia detalhada e a justificativa para a implementação do ensaio EA são relatadas neste manuscrito.
O lipopolissacarídeo (LPS), também conhecido como endotoxina, é um componente chave da estrutura da membrana de bactérias Gram-negativas (GN). Compõe-se cerca de 10% da parede celular, sendo vital para a integridade da membrana externa e homeostase. Além disso, é um ativador potente do sistema imunológico inata do hospedeiro1,2.
A exposição in vitro de células inatas do sistema imunológico a LPS leva a alterações na expressão de múltiplos genes3. A administração de quantidades muito pequenas de LPs em voluntários humanos saudáveis desencadeia a cascata de inflamação sistêmica aguda, enquanto a sepse e choque séptico podem surgir com maiores concentrações de endotoxina4,5.
A sepse é uma condição de risco de vida que, se não prontamente reconhecida, pode levar a falência de múltiplos órgãos e morte. Os pacientes sépticos devem ser tratados em tempo hábil, com ressuscitação agressiva, antibioticoterapia adequada, controle de fonte ideal e estratégias de apoio a órgãos. O diagnóstico da etiologia do sepsis é baseado primeiramente no reconhecimento clínico e na deteção cultura-baseada do micróbio patogénico6. No entanto, os resultados das culturas microbianas podem levar até 48 h e são inconclusivos em até 30% dos casos7. A identificação precoce e a intervenção podem levar a melhores resultados do paciente. Em pacientes em que a sepse é suspeita, as decisões são muitas vezes feitas com base em parâmetros fisiológicos e bioquímicos, sem um sinal claro de endotoxemia.
A medição da atividade da endotoxina (EA) pode ser obtida por meio de um ensaio comercial (ver tabela de materiais) em sangue total. Pode ser utilizado como biomarcador de endotoxemia sistêmica para a estratificação precoce da severidade da doença, particularmente em pacientes com risco de desenvolver choque séptico8. O teste foi usado para guiar a terapia do hemoperfusion de Polymyxin B em um ensaio clínico aleatorizado-controlado duplo-cego recentemente publicado nos pacientes com choque séptico9. Em pacientes criticamente enfermos, o estudo do MEDIC mostrou aumento dos níveis de EA para estar associado a disfunção de múltiplos órgãos, tempo de permanência na unidade de terapia intensiva (UTI) e mortalidade10.
Diferentes ensaios foram desenvolvidos para detectar endotoxina. O ensaio Limulus Amoebocyte lysate (LAL), seja como um teste de Gel-coágulo, turbidimétrico ou cromogênico, tem sido até agora o mais freqüentemente adotado para a estimativa da endotoxina sérica. Baseia-se na capacidade de endotoxina para induzir a coagulação da hemolinfa do caranguejo em ferradura, Limulus Polyphemus. No entanto, este ensaio tem algumas limitações em termos de especificidade. Em particular, ele também pode ser ativado por produtos microbianos que não seja endotoxina, tais como componentes da parede celular fúngica, e pode ser inibida por várias proteínas plasmáticas humanas11.
Durante a última década, a medida da EA foi desenvolvida e validada como um biomarcador de endotoxemia circulante. Comparado ao teste LAL, a EA é mais rápida e fácil de implementar no ambiente clínico. Além disso, demonstrou-se ser mais acurado que a LAL em sangue total, com sensibilidade e especificidade aumentadas, tanto in vitro como in vivo12.
Apesar de sua aplicação inicial como uma ferramenta diagnóstica adiantada para a identificação rápida de bactérias do GN como agentes causais do sepsis, o nível do ea foi estudado igualmente como um biomarcador da severidade da doença. Neste contexto, demonstrou-se ser particularmente útil avaliar o estado de hipoperfusão devido à doença crítica em curso, como choque séptico ou síndrome pós-parada cardíaca13. Mais recentemente, desde o desenvolvimento de sistemas de hemopurificação, um resultado positivo da EA também tem sido proposto como uma ferramenta de triagem para identificar com precisão potenciais candidatos para tal terapia14. Recentemente, realizou-se um estudo observacional retrospectivo sobre a prevalência e o significado clínico dos altos níveis iniciais de EA em 107 pacientes com choque séptico. Em consonância com outros resultados recentes, verificou-se que a EA é um marcador promissor de severidade da doença em pacientes com choque séptico15.
O objetivo do presente manuscrito é descrever o método de realização do ensaio EA, seja à beira do leito ou em laboratório, e descrever seu potencial de uso em um cenário representativo de choque séptico. Esta técnica pode detectar a atividade de LPS medindo o estouro oxidativo realçado nos neutrófilos que seguem seu priming por complexos de um anticorpo da antiendotoxina e de LPS. O aumento da ruptura respiratória é detectado por um quimiluminômetro e a quantidade de luz emitida é considerada proporcional à quantidade de endotoxina na amostra de sangue. O ensaio requer poucos reagentes, leva cerca de 30 min para executar e usa tão pouco como 40 μL de sangue total12.
O protocolo é conduzido de acordo com as diretrizes institucionais relativas ao manuseio de bioespécimes humanos e seguindo os procedimentos operativos padrão atuais do nosso laboratório clínico. O uso de dados da EA e informações clínicas dos pacientes que estão sendo testados seguem as diretrizes do Comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.
1. conteúdo do equipamento de laboratório e do kit de ensaio
2. ensaio da atividade da endotoxina
Um homem dos anos de idade 72 foi admitido ao departamento da emergência (ED) de um hospital urbano académico. Poucos dias antes, ele tinha apresentado ao seu médico de cuidados primários reclamando de queima em micção. Uma terapia do short-curso com Fosfomicina oral foi recomendada. Sua história médica incluiu a hipertensão, o diabetes tipo-2 uncomplicated e a hiperplasia prostática benigna. Seus medicamentos incluíram Enalapril, Atorvastatina, Tamsulosin e metformina.
No ED, ele estava letárdico, confuso quando despertado. Sua temperatura foi de 39,1 ° c, a freqüência cardíaca foi de 125 batimentos por minuto, a pressão arterial foi de 80/40 mmHg, a frequência respiratória foi de 20/min, e o SpO2 foi de 94% no ar ambiente, elevando para 99% com 4 L/min de oxigênio através de uma cânula nasal. O exame abdominal era normal, com exceção da sensibilidade suprapúbica leve mal localizada. Com dificuldade, foi colocado um cateter de Foley. Uma baixa quantidade de urina purulenta escura-colorida foi drenada.
Uma contagem de sangue completa revelou uma contagem da pilha branca de 18,5 x 103. A creatinina foi de 2,7 mg/dl, a glicose foi 250 mg/dl, e o nível de ácido láctico foi de 4,5 mmol/l. a análise da gasometria arterial revelou acidose mista, com pH 7,23, PCO2 48 mmHg, po2 88 mmHg e HCO3- 15 mmol/L.
Foi colocado cateter venoso central, com orientação ultrassonográfica, na veia jugular interna direita. Uma análise do gás sanguíneo foi obtida após a colocação do cateter, revelando um valor de 63% de ScVO2 . A ressuscitação fluida agressiva foi começada prontamente com uma infusão do bolus do cristalóide de 30 ml/kg sobre 30 minutos. a infusão de norephinefrina foi iniciada igualmente. O paciente foi transferido para a UTI com diagnóstico de choque séptico, provavelmente originando-se de uma infecção do trato urinário.
Na UTI, em meio à coleta de culturas microbianas e à administração de antibioticoterapia empírico, obteve-se uma amostra de sangue total para o teste EA. O ensaio foi rapidamente realizado de acordo com o protocolo aqui apresentado.
A fim de computar os resultados da EA, o quimioluminômetro registra: a luminescência basal de neutrófilos (L1); luminescência da atividade neutrófilos em resposta ao LPs na amostra de sangue (L2); a atividade máxima dos neutrófilos em resposta à exposição maciça ao LPS (L3). Os resultados são expressos como: atividade da endotoxina (EA) = (L2-L1)/(L3-L1). Portanto, o valor da EA resultante reflete o grau de ruptura oxidativa dos neutrófilos do paciente devido à presença de endotoxina circulante (L2), normalizada pelo mais alto nível de luminescência que pode ser medida na mesma amostra de sangue em resposta a um concentração supra-máxima de LPS (L3). Ambos os valores são controlados para a luminescência basal da amostra (L1).
Após aproximadamente 30 minutos, o clínico reconheceu 0,75 unidades da EA para ser o nível de atividade da endotoxina do paciente.
Um valor de EA inferior a 0,40 unidades da EA indica um baixo nível de atividade de endotoxina, igual a uma baixa concentração de LPS circulante, o que representa um baixo risco de progressão para um estado de doença grave. Os resultados entre 0,40 EA e 0,59 unidades da EA indicam um nível de atividade de endotoxina intermediária, que representa um risco elevado para o desenvolvimento de sepse grave e choque séptico. Os resultados iguais ou superiores a 0,60 unidades da EA indicam um alto nível de atividade da endotoxina, o que representa um alto risco para choque séptico e desfechos de pacientes pobres (tabela 1).
O diagnóstico de choque séptico, provavelmente devido às bactérias de GN, foi confirmado conseqüentemente. O paciente também foi Categorizado como sendo de risco extremamente elevado, em consonância com a evidência de falhas de órgãos concomitantes e nível de lactato. Foi tratado adicionalmente com a ressuscitação agressiva do volume e a sustentação vasoativas. A terapia do hemopurification de polymixin-B foi considerada, contudo não executada, devido à resposta adiantada de persuasão do paciente aos líquidos e aos vasopressores. No 2º dia, a Escherichia coli foi confirmada como agente causador através de hemoculturas positivas. Com a antibioticoterapia adequada, o paciente recuperou, recebendo alta da UTI no 7º dia. Um segundo teste de EA foi realizado antes da alta da UTI. Um resultado de 0,2 unidades EA indicou resolução completa da Cascata bioquímica desencadeada por choque séptico.
A Figura 1 mostra a distribuição dos valores de ea medidos dentro de 24 h em uma população de amostra de pacientes com choque séptico.
Figura 1: distribuição dos níveis de atividade da endotoxina (EA) medidos dentro de 24 h do início do choque séptico em uma população de pacientes criticamente doentes (n = 107). Adaptado de Bottiroli, et al. com permissão15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Unidades da EA | Nível de atividade da endotoxina |
< 0.40 | Baixo |
0,40 – 0,59 | Intermediário |
≥ 0,60 | Alta |
Tabela 1: categorias de níveis de atividade da endotoxina. EA = atividade de endotoxina.
O choque séptico ainda hoje está associado a uma mortalidade tão alta quanto 40%, embora essa taxa varie de acordo com os relatos considerados16. A necessidade de novos e melhores biomarcadores é defendida pela maioria dos especialistas nos campos, a fim de auxiliar os clínicos no diagnóstico precoce, melhor manejo e prognosticação de pacientes com choque séptico6.
Realizar um teste de EA não requer conhecimento técnico prévio ou equipamento de laboratório sofisticado, e qualquer prestador de cuidados de saúde pode facilmente e rapidamente aprender a executá-lo. A identificação alerta de um EA de circulação elevada pôde ajudar em estratificar o risco do paciente, provocando uma aproximação terapêutica mais adiantada e mais agressiva. Inversamente, um resultado de EA de menos de 0,40 unidades da EA pode indicar um baixo risco de progressão para falência de múltiplos órgãos17. O uso de amostras do paciente como seu próprio controle é simples, faz este teste mais sensível e uma respresentação mais exata do nível de sangue verdadeiro do endotoxemia.
O uso de complexos LPS-anticorpo e dos neutrófilos do próprio paciente protege o teste EA de ser possivelmente inibido por outros fatores (por exemplo, proteínas plasmáticas). O mesmo não pode ser dito para outro teste, como o teste LAL, que requer a ativação de uma cascata de coagulação. O teste de LAL executa bem quando a endotoxina não está ligada por um receptor específico, mas no plasma e no sangue inteiro as proteínas diferentes ligam LPS, interferindo com o ensaio. Além disso, os produtos fúngicos podem desencadear a cascata de coagulação Limulus, tornando o teste menos específico para bactérias GN. Por esses motivos, o EA é superior ao teste LAL ainda comumente adotado para a avaliação da endotoxemia18.
No entanto, para que o teste do EA seja confiável, é crucial seguir meticulosamente os passos acima mencionados. O nível de endotoxina do espécime que está sendo testado é calculado pela quimioluminescência computacional ao longo do tempo, medindo as respostas basal (tubo #1) e máxima (tubo #3) para a mesma amostra de sangue como valores de referência. Conseqüentemente, é imperativo coloc com cuidado os três tubos na ordem correta no chemiluminometer.
O uso de níveis de EA na prática clínica não deve substituir os testes padrão (por exemplo, exames laboratoriais e hemoculturas) no trabalho de uma potencial doença infecciosa. Embora o LPS possa claramente ser associado com a liberação de produtos da membrana da bactéria do GN, os níveis elevados de endotoxemia foram relatados igualmente em caso das infecções devido a outros agentes19. É muito bem sabido que a endotoxemia pode ser devida à translocação de bactérias através da mucosa intestinal, particularmente sempre que a hipoperfusão tecidual e a permeabilidade aumentada da barreira intestinal provavelmente ocorram20,21. Nessas condições, é possível esperar que os LPS circulantes sejam uma consequência, e não a causa, de sepse e choque. Nesse cenário, o EA poderia fornecer informações sobre a gravidade da lesão tecidual em andamento, independentemente da etiologia bacteriana15. Apoiando esse princípio, em um estudo recente, Grimaldi et al. encontraram a elevação dos níveis de EA para estarem associadas à severidade e duração do choque após parada cardíaca fora do hospital13.
Curiosamente, Virzí et al. também destacaram o papel potencial da endotoxina (e seu monitoramento) em pacientes com síndrome cardiorrenal tipo 5, condição caracterizada por disfunção cardíaca e renal concomitante no cenário de diferentes transtornos sistêmicos , como a sepse23 . A endotoxina é sabida para induzir o prejuízo de myocytes cardíacos, embora o mecanismo fisiopatológico exato seja em grande parte obscuro. Por outro lado, a endotoxemia demonstrou induzir disfunção renal devido a várias vias de lesão local e sistêmica, causando prejuízos do fluxo sanguíneo renal, da taxa de filtração glomerular e da função tubular22.
No entanto, algumas limitações do EA devem ser destacadas. A influência de uma antibioticoterapia contínua no resultado da EA não está atualmente bem estabelecida24. Além disso, evidências sugerem que, em pacientes críticos, uma medida precoce da EA de ponto único, embora útil, não prevê de forma confiável a mortalidade por choque séptico, mesmo quando maior que 0,6 unidades15. As avaliações repetidas seriais puderam ser precisadas, embora seu número e sincronismo sejam atualmente obscuros. Outros autores concentraram-se nas flutuações da endotoxemia, o que pode estar associado a um aumento da variabilidade diária, com maior grau de disfunção de múltiplos órgãos25. Por fim, uma limitação técnica adicional a ser considerada é a escala relativa ao longo da qual a atividade da endotoxina é medida (0 a 1 unidades, com 0, 1 incrementos mínimos detectáveis). Isto faz resultados extremamente elevados inevitàvel platô em torno do nível máximo, desse modo fazendo diferenciações neste subgrupo dos pacientes (EA > 0,9 unidades) mais duramente para investigar.
Em conclusão, enquanto novos estudos são necessários para avaliar o impacto potencial do monitoramento dos níveis de endotoxina no desfecho clínico, o EA está atualmente disponível como um teste rápido, simples e sensível, o que pode facilitar o processo de tomada de decisão da UTI clínicos em pacientes sépticos doentes críticos.
A estor SpA cobriu o custo da publicação da revista e da taxa de produção de vídeo. Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecemos a Paolo Braganò e a Lisa Mathiasen, Ph.D. pela revisão da metodologia do protocolo de ensaio. Dario WINTERTON, MD forneceu ajuda substancial rever o manuscrito para proficiência em língua inglesa.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados