Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

Con la presentennotità di un protocollo per misurare al capezzale l'attività di endotossina dei campioni di sangue intero umano. Il saggio Endotoxin Activity è un semplice test da eseguire e può essere un biomarcatore utile nei pazienti critici con sepsi.

Il lipopolisasseride, noto anche come endotossina, è una componente fondamentale dei batteri gram-negativi e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della sepsi e dello shock settico. L'identificazione precoce di un processo infettivo che si sta rapidamente evolvendo verso una malattia critica potrebbe indurre un trattamento più rapido e più intensivo, portando così potenzialmente a migliori esiti per i pazienti. L'attività endotossina (EA) può essere utilizzato al capezzale come biomarcatore affidabile dell'endotossia sistemica. È stato ripetutamente dimostrato che la rilevazione di livelli elevati di attività endotossina sia associata ad un aumento della gravità della malattia nei pazienti con sepsi e shock settico. Il saggio è veloce e facile da eseguire. In breve, dopo il campionamento, un di sangue intero viene mescolato con un anticorpo anti-endotossina e con LPS aggiunto. L'attività dell'endotossina è misurata come la relativa raffica ossidativa di neutrofili innescati rilevati dalla chemioluminescenza. L'output del saggio è espresso su una scala da 0 (assente) a 1 (massimo) e classificato come "basso" (<0,4 unità), "intermedio" (0,4–0,59 unità) o "alto" (unità 0,6 USD). La metodologia dettagliata e la logica per l'attuazione del saggio EA sono riportate in questo manoscritto.

Il Lipopolysaccharide (LPS), noto anche come endotossina, è un componente chiave della struttura della membrana dei batteri Gram-negativi (GN). Esso costituisce circa il 10% della parete cellulare, essendo vitale per l'integrità della membrana esterna e l'omeostasi. Inoltre, è un potente attivatore del sistema immunitario innato dell'ospite^1,2.

L'esposizione in vitro delle cellule del sistema immunitario innato a LPS porta a cambiamenti nell'espressione di più geni³. La somministrazione di piccole quantità di LPS in volontari umani sani innesca la cascata di infiammazione sistemica acuta, mentre la sepsi e lo shock settico possono insorgere con concentrazioni di endotossina più elevate^4,5.

La sepsi è una condizione pericolosa per la vita che, se non prontamente riconosciuta, può portare all'insufficienza multiorgano e alla morte. I pazienti settici devono essere trattati in modo tempestivo, con rianimazione aggressiva, terapia antibiotica adeguata, controllo ottimale del codice sorgente e strategie di supporto all'organo tempestivo. La diagnosi dell'eziologia della sepsi si basa principalmente sul riconoscimento clinico e sul rilevamento di patogeni basati sulla cultura⁶. Tuttavia, i risultati delle colture microbiche possono richiedere fino a 48 h e sono inconcludenti fino al 30% dei casi⁷. L'identificazione precoce e l'intervento possono portare a migliori esiti per i pazienti. Nei pazienti in cui si sospetta la sepsi, le decisioni sono spesso prese sulla base di parametri fisiologici e biochimici, senza un chiaro segno di endotossia.

La misurazione dell'attività endotossina (EA) può essere ottenuta mediante un saggio commerciale (vedi Tabella deimateriali) nel sangue intero. Può essere utilizzato come biomarcatore dell'endotossia sistemica per la stratificazione precoce della gravità della malattia, in particolare nei pazienti a rischio di sviluppare shock settico⁸. Il test è stato utilizzato per guidare la terapia dell'emoperfusione Polymyxin B in uno studio clinico in doppio cieco controllato da randomizzati in pazienti con shock settico⁹. Nei pazienti in stato di crisi, lo studio MEDIC ha mostrato un aumento dei livelli di EA da associare alla disfunzione di organi multipli, alla durata del soggiorno dell'unità di terapia intensiva (ICU) e alla mortalità¹⁰.

Sono stati sviluppati diversi saggi per rilevare l'endotossina. L'assaggio di Limulus Amoebocyte (LAL), sia come gel-clot, turbidimetrico, o test cromogenico, è stato finora il più frequentemente adottato per la stima dell'endotossina del siero. Si basa sulla capacità di endotossina per indurre la coagulazione dell'emolina del granchio a ferro di cavallo, Limulo polyphemus. Tuttavia, questo saggio ha alcune limitazioni in termini di specificità. In particolare, può anche essere attivato da prodotti microbici diversi dall'endotossina, come i componenti della parete cellulare fungina, e può essere inibito da varie proteine plasmatiche umane¹¹.

Durante l'ultimo decennio la misurazione di EA è stata sviluppata e convalidata come biomarcatore dell'endotossia circolante. Rispetto al test LAL, EA è più veloce e più facile da implementare in ambito clinico. Inoltre, è stato dimostrato di essere più preciso di LAL nel sangue intero, con una maggiore sensibilità e specificità, sia in vitro che in vivo¹².

Nonostante la sua implementazione iniziale come uno strumento diagnostico precoce per la rapida identificazione dei batteri GN come agenti causali di sepsi, il livello di EA è stato studiato anche come biomarcatore della gravità della malattia. In questo contesto, è stato dimostrato di essere particolarmente utile valutare lo stato di ipoperfusione a causa di malattie critiche in corso, come lo shock settico o la sindrome da arresto post-cardiaco¹³. Più recentemente, dopo lo sviluppo di sistemi di emopurazione, è stato proposto anche un risultato positivo di EA come strumento di screening per identificare con precisione i potenziali candidati per tale terapia¹⁴. Recentemente abbiamo condotto uno studio retrospettivo osservazionale sulla prevalenza e l'importanza clinica dei primi livelli di EA in 107 pazienti con shock settico. In linea con altri risultati recenti, abbiamo scoperto che EA è un promettente marcatore della gravità della malattia nei pazienti con shock settico¹⁵.

Lo scopo del presente manoscritto è descrivere il metodo per eseguire il saggio EA, sia al capezzale che in laboratorio, e descriverne l'uso potenziale in uno scenario rappresentativo di shock settico. Questa tecnica è in grado di rilevare l'attività di LPS misurando l'esplosione ossidativa avanzata nei neutrofili in seguito al loro innesco da complessi di un anticorpo anti-endotossina e LPS. L'aumento dell'esplosione respiratoria viene rilevato da un chemiluminometro e la quantità di luce emessa è considerata proporzionale alla quantità di endotossina nel campione di sangue. Il saggio richiede pochi reagenti, richiede circa 30 min per eseguire eutilizza appena 40 .

Il protocollo è condotto secondo le linee guida istituzionali relative alla gestione delle biocampioni umane e seguendo le attuali procedure operative standard del nostro laboratorio clinico. L'uso dei dati EA e delle informazioni cliniche dei pazienti testati segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.

1. Attrezzature di laboratorio e contenuti del kit di anamante

1. Conservare il kit EA a 2-8 gradi centigradi quando non è in uso.
2. Ogni test EA è costituito da 5 diversi tipi di tubi; utilizzare ciascuno di essi per una parte diversa del test (vedere la sezione 2).
   1. Utilizzare tubo #1 (il tubo "Control") per misurare l'attività basale della raffica ossidativa non specifica dei neutrofili del paziente in assenza di un anticorpo specifico.
   2. Utilizzare il tubo #2 (il tubo "Campione") per misurare la raffica ossidativa in risposta al complesso dell'anticorpo LPS.
   3. Usa il tubo #3 (il tubo "Max") per misurare la picchiata ossidativa massima dei neutrofili del paziente in risposta a un eccesso di endotossina.
   4. Utilizzare il tubo #4 (il tubo "LPS") come fonte di endotossina endogena endogena.
   5. Utilizzare tubo #5 ("tubo "Aliquota") per l'immagazzinamento del sangue.
      NOT: Duplicati di tubi #1, #2 e #3 sono previsti per un totale di 8 tubi da utilizzare per ogni campione di sangue sottoposto a test (la bottiglia di reagente EA e il test di controllo di qualità possono essere utilizzati per tutte le prove contenute in una sacca).
3. Raccogliere campioni di sangue del paziente in tubi sterili contenenti anticoagulante EDTA. Conservare i campioni di sangue a temperatura ambiente prima di eseguire il test EA.
4. Prima di iniziare il test, accendere il chemiluminometro e lo shaker dell'incubatrice. Riscaldare l'incubatrice alla temperatura di 37 gradi centigradi.
5. Idealmente, iniziare l'elaborazione del campione entro 30 min dalla raccolta del sangue.

2. Saggio di attività dell'endotossina

1. Preparare le provette EA per il campione di sangue di ogni paziente che è necessario testare. Mettere i tubi in rastrelliere a tubo. Quindi rimuovere i tappi.
2. Utilizzando una combipipetta, pipette un volume di 1 mL del reagente EA dalla bottiglia in tubi #1 (tubo di controllo), #2 (tubo di campionamento) e #3 (tubo massimo), ciascuno in duplicato.
   NOT: Pipetta lungo il lato del tubo per evitare soluzione spruzzi indietro.
3. Mescolare il campione di sangue del paziente invertendo delicatamente il tubo di raccolta del sangue per 20 volte. Quindi, pipetta 0,5 mL di sangue del paziente nel tubo #4 (tubo massimo LPS) e tubo #5 aliquota (tubo). Tubo vortice #4 per 10 s.
4. Mettere i rack a tubo con tutte le provette EA nello shaker dell'incubatore. Chiudere il coperchio e incubare per 10 min alla temperatura di 37 gradi centigradi.
5. Aprire il coperchio e rimuovere i rack tubo dallo shaker incubatrice. #5 tubo Vortex (tubo Aliquota). Utilizzando una punta sterile, pipetta 40 -L di sangue in tubi #1 e #2, in duplicato.
6. #4 tubo Vortex (tubo LPS). Utilizzando la stessa punta di pipetta, pipetta 40 -L di sangue dal tubo #4 in #3 tubo (tubo Max), in duplicato.
7. Vortex le sei provette finali (#1, #2, #3 e rispettivi duplicati), quindi riposizionarle nei loro rack.
   NOT: Assicurarsi che tutti i tubi siano vortice per la stessa quantità di tempo.
8. Rimettere i rack del tubo nello shaker per incubazione e chiudere il coperchio. Impostare lo shaker di incubazione a 100 giri/m, quindi avviare il movimento per 14 min.
9. Inserire la scheda chipcard etichettata EA nel chemiluminometro e premere start. Dopo l'incubazione di 14 min, seguire le istruzioni visualizzate sul chemiluminometro per leggere i tubi EA nell'ordine corretto.
10. Vorticare delicatamente ogni tubo per 10 s prima di posizionarlo sul supporto del campione del chemiluminometro. Aprire il cassetto campione e posizionare il tubo #1 nel supporto del campione. Quindi, chiudere il cassetto di esempio e attendere la lettura dell'unità luminosa relativa (RLU).
11. Ripetere il passaggio 2.10 per il tubo 2 e il tubo 3.
12. Ripetere i passaggi 2.10 per i tubi duplicati 1, 2 e 3.
    NOT: Provate a vorticare tutti i tubi per la stessa quantità di tempo durante i passaggi 2.10–2.12.
13. Dopo che tutti i tubi sono stati elaborati, si noti che i risultati EA verranno calcolati e stampati automaticamente. I livelli sono espressi come unità EA e rappresentano la media di determinazioni duplicate dagli stessi campioni.
14. Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.13 per ogni campione di sangue che deve essere testato.
15. Una volta completato il test, conservare le provette e i reagenti EA rimanenti a 2-8 gradi centigradi per un massimo di 30 giorni.

Un uomo di 72 anni è stato ricoverato al Pronto Soccorso (ED) di un ospedale urbano accademico. Pochi giorni prima si era presentato al suo medico di base lamentandosi di bruciare la minzione. È stata raccomandata una terapia a breve corso con fosforomicina orale. La sua storia medica includeva l'ipertensione, il diabete non complicato di tipo 2 e l'iperplasia prostatica benigna. I suoi farmaci includevano enalapril, atorvastatina, tamsulosin e metformina.

Nella disagno, era letargico, confuso quando si svegliò. La sua temperatura era di 39,1 gradi centigradi, la frequenza cardiaca era di 125 battiti al minuto, la pressione sanguigna di 80/40 mmHg, la frequenza respiratoria di 20/min, e lo SpO₂ nell'aria ambiente, salendo al 99% con 4 l/min di ossigeno attraverso una cannula nasale. L'esame addominale era normale, fatta eccezione per la tenerezza soprapubica poco localizzata. Con difficoltà, un catetere Foley è stato posto. Una bassa quantità di urina purulenta di colore scuro è stata drenata.

Un conteggio completo del sangue ha rivelato un numero di globuli bianchi di 18,5 x 10³. Creatinina era 2,7 mg/dL, il glucosio era 250 mg/dL, e il livello di acido lattico era 4,5 mmol/ L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L'analisi arteriosa del gas sanguigno ha rivelato l'acidosi mista, con pH 7,23, pCO₂ 48 mmHg, pO₂ 88 mmHg e HCO₃^- 15 mmol/L.

Un catetere venoso centrale è stato posto, con guida ecografica, nella vena giugulare interna destra. Un'analisi del gas sanguigno è stata ottenuta al momento del posizionamento del catetere, rivelando un valore ScVO₂ del 63%. La rianimazione aggressiva dei fluidi è stata prontamente avviata con un'infusione di bolus cristalloide da 30 mL/kg superiore a 30 min. Il paziente è stato trasferito in terapia intensiva con una diagnosi di shock settico, probabilmente originario di un'infezione delle vie urinarie.

In terapia intensiva, tra la raccolta di colture microbiche e la somministrazione di terapia antibiotica empirica, è stato ottenuto un intero campione di sangue per i test EA. Il saggio è stato rapidamente eseguito secondo il protocollo presentato nel presente documento.

Per calcolare i risultati dell'EA, il chemiluminometro registra: la luminescenza basale dei neutrofili (L1); luminescenza dell'attività dei neutrofili in risposta all'LPS nel campione di sangue (L2); l'attività massima dei neutrofili in risposta all'esposizione massiccia all'LPS (L3). I risultati sono espressi come: Attività endotossina (EA) : (L2-L1)/(L3-L1). Pertanto, il valore EA risultante riflette il grado di esplosione ossidativa dei neutrofili del paziente a causa della presenza di endotossina circolante (L2), normalizzata dal più alto livello di luminescenza che può essere misurato nello stesso campione di sangue in risposta a un concentrazione sovramassima di LPS (L3). Entrambi i valori sono controllati per la luminescenza basale del campione (L1).

Dopo circa 30 min, il medico ha riconosciuto 0,75 unità EA come il livello di attività endotossina del paziente.

Un valore EA inferiore a 0,40 unità EA indica un basso livello di attività endotossina, pari a una bassa concentrazione di LPS circolante, che rappresenta un basso rischio di progressione in uno stato di malattia grave. I risultati tra 0,40 EA e 0,59 unità EA indicano un livello di attività endotossina intermedio, che rappresenta un rischio elevato per lo sviluppo di sepsi grave e shock settico. Risultati pari o superiori a 0,60 unità EA indicano un elevato livello di attività di endotossina, che rappresenta un elevato rischio di shock settico e di scarsi risultati per i pazienti (tabella1).

È stata quindi confermata la diagnosi di shock settico, probabilmente dovuto a batteri GN. Il paziente è stato anche classificato come ad altissimo rischio, in linea con l'evidenza di fallimenti di organi concomitanti e livello di lattato. È stato inoltre trattato con rianimazione aggressiva dei volumi e supporto vasoattivo. La terapia emopurificazione Polymixin-B è stata considerata, ma non implementata, a causa della risposta precoce convincente del paziente a fluidi e vasopressori. Il secondo giorno, Escherichia coli è stata confermata come l'agente causale attraverso colture ematiche positive. Con l'appropriata terapia antibiotica, il paziente si è ripreso, essendo dimesso dall'terapia intensiva il giorno 7. Un secondo test EA è stato effettuato prima del discarico in terapia intensiva. Un risultato di 0,2 unità EA ha indicato una risoluzione completa della cascata biochimica innescata da shock settico.

La figura 1 mostra la distribuzione dei valori di EA misurati entro 24 h in una popolazione campione di pazienti con shock settico.

Figura 1: Distribuzione dei livelli di attività dell'endotossina (EA) misurati entro 24 h dall'insorgenza di shock settico in una popolazione di pazienti gravemente malati (n - 107). Adattato da Bottiroli, et al. con il permesso¹⁵. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Categorie di livelli di attività di endotossina. EA - Attività di endotossina.

Lo shock settico è ancora oggi associato a una mortalità fino al 40%, anche se questo tasso varia a seconda dei rapporti considerati¹⁶. La necessità di biomarcatori nuovi e migliori è sostenuta dalla maggior parte degli esperti del campo al fine di aiutare i medici nella diagnosi precoce, una migliore gestione e la prognosticazione dei pazienti con shock settico⁶.

L'esecuzione di un test EA non richiede conoscenze tecniche precedenti o sofisticate attrezzature di laboratorio e qualsiasi operatore sanitario può imparare facilmente e rapidamente come eseguirlo. L'identificazione tempestiva di un EA ad alta circolazione potrebbe aiutare a stratificare il rischio del paziente, innescando un approccio terapeutico più precoce e più aggressivo. Al contrario, un risultato EA inferiore a 0,40 unità EA potrebbe indicare un basso rischio di progressione verso il fallimento multiorgano¹⁷. L'uso dei campioni del paziente come proprio controllo è semplice, rende questo test più sensibile e una rappresentazione più accurata del vero livello endotossico reale.

L'uso di complessi anticorpi LPS e i neutrofili del paziente protegge il test EA dall'eventuale inibito da altri fattori (ad esempio le proteine plasmatiche). Lo stesso non si può dire per altri test, come il test LAL, che richiede l'attivazione di una cascata di coagulazione. Il test LAL funziona bene quando l'endotossina non è vincolata da un recettore specifico, ma nel plasma e nel sangue intero diverse proteine legano LPS, interferendo con il saggio. Inoltre, i prodotti fungini possono innescare la cascata di coagulazione del limulo, rendendo il test meno specifico per i batteri GN. Per questo motivo, l'EA è superiore al test LAL ancora comunemente adottato per la valutazione dell'endotoxemia¹⁸.

Tuttavia, affinché il test EA sia affidabile, è fondamentale seguire meticolosamente i passaggi di cui sopra. Il livello di endotossina del campione sottoposto a test viene calcolato calcolando la chemiluminescenza nel tempo, misurando le risposte basali (tubo #1) e massime (#3 tubo) per lo stesso campione di sangue dei valori di riferimento. Pertanto, è imperativo posizionare con attenzione i tre tubi nell'ordine corretto nel chemiluminometro.

L'uso dei livelli di EA nella pratica clinica non dovrebbe sostituire i test standard (ad esempio i test di laboratorio e le colture del sangue) nell'esame di una potenziale malattia infettiva. Anche se LPS potrebbe chiaramente essere associato con il rilascio di prodotti di membrana batterica GN, elevati livelli di endotoxemia sono stati segnalati anche in caso di infezioni dovute ad altri agenti¹⁹. È ben noto che l'endotoxemia potrebbe essere dovuta alla traslocazione di batteri attraverso la mucosa intestinale, in particolare ogni volta che l'ipoperfusione dei tessuti e una maggiore permeabilità della barriera intestinale sono suscettibili di verificarsi^20,21. In tali condizioni, è possibile aspettarsi che l'LPS circolante sia una conseguenza, piuttosto che la causa, della sepsi e dello shock. In questo scenario, l'EA potrebbe fornire informazioni sulla gravità della lesione tissutale in corso, indipendentemente dall'eziologia batterica¹⁵. A sostegno di questo principio, in un recente studio Grimaldi et al. ha trovato l'elevazione dei livelli EA da associare alla gravità e alla durata dello shock a seguito di arresto cardiaco fuori dall'ospedale¹³.

È interessante notare che Virzà et al. ha anche evidenziato il potenziale ruolo dell'endotossina (e il suo monitoraggio) nei pazienti con sindrome cardiorenale di tipo 5, una condizione caratterizzata da concomitante disfunzione cardiaca e renale nell'impostazione di diversi disturbi sistemici , come la sepsi²³ . L'endotossina è nota per indurre un danno di miociti cardiaci, anche se l'esatto meccanismo patofisiologico è in gran parte poco chiaro. D'altra parte, l'endotossia ha dimostrato di indurre disfunzione renale a causa di diversi percorsi di lesione locale e sistemica, causando compromissione del flusso sanguigno renale, tasso di filtrazione glomelare e funzione tubolare²².

Tuttavia, alcune limitazioni dell'EA devono essere evidenziate. L'influenza di una terapia antibiotica in corso sul risultato EA non è attualmente ben consolidata²⁴. Inoltre, l'evidenza suggerisce che nei pazienti critici una misurazione precoce dell'EA, sebbene utile, non prevede in modo affidabile la mortalità per urti settici, anche quando è superiore a 0,6 unità¹⁵. Potrebbero essere necessarie valutazioni ripetute seriali, anche se il loro numero e la loro tempistica non sono attualmente chiari. Altri autori si sono concentrati sulle fluttuazioni dell'endotossia, ipotizzando che un aumento della variabilità giornaliera potrebbe essere associato a un più alto grado di disfunzione multiorgano²⁵. Infine, un ulteriore limite tecnico da considerare è la scala relativa lungo la quale viene misurata l'attività dell'endotossina (da 0 a 1 unità, con incrementi minimi rilevabili di 0,01). Questo rende i risultati estremamente elevati inevitabilmente altopiano intorno al livello massimo, rendendo così le differenziazioni in questo sottogruppo di pazienti (EA > 0,9 unità) più difficile da indagare.

In conclusione, sebbene siano necessari ulteriori studi per valutare il potenziale impatto del monitoraggio dei livelli di endotossina sull'esito clinico, l'EA è attualmente disponibile come test rapido, semplice e sensibile, che potrebbe facilitare il processo decisionale di ICU medici in pazienti con recitari critici.

Estor SpA ha coperto il costo della pubblicazione della rivista e della tassa di produzione video. Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamo Paolo Braganò e Lisa Mathiasen, Ph.D. per la loro revisione della metodologia del protocollo di analisi. Dario Winterton, MD fornì un sostanziale aiuto alla revisione del manoscritto per la conoscenza della lingua inglese.