Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.

Interações intercelulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Parácrina ou sinalização justácrina Medeia tais interações. O uso de um meio condicionado e estudos coculture são os métodos mais comuns para discriminar entre estes dois tipos de interações. No entanto, o efeito de concentrações elevadas localizadas dos fatores secretados para o microambiente durante as interações parácrina não é instaurado com precisão por meio condicionado e, assim, pode levar a conclusões imprecisas. Para superar este problema, criámos um método de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina. Os tipos de duas células são cultivados em qualquer superfície de uma membrana de policarbonato µm de espessura 10 com 0,4 µm de poros. Os poros permitem a troca de fatores secretados e, ao mesmo tempo, inibem a sinalização justácrina. As células podem ser coletadas e lysed no ponto de extremidade para determinar os efeitos da sinalização parácrina. Além de permitir para localizadas gradientes de concentração dos fatores secretados, este método é passível de experimentos que envolvem períodos prolongados de cultura, bem como o uso de inibidores. Enquanto nós usamos este método para estudar as interações entre as células de câncer de ovário e as células mesoteliais que encontram no local da metástase, pode ser adaptado para qualquer dois tipos de células aderentes aos pesquisadores estudar parácrina sinalização em vários campos, incluindo desenvolvimento, imunologia e microambiente do tumor.

O papel de produtivas interações recíprocas entre as células cancerosas e o microambiente do tumor na progressão do tumor foi bem estabelecido e tornou-se um grande foco de pesquisa em câncer biologia¹. Instâncias similares de sinalização bidirecional são cruciais durante o ferida cura, respostas imunes, angiogênese, nichos de células-tronco e desenvolvimento^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. um tema comum em todos estes processos biológicos é que células respondem de várias maneiras para sinais extracelulares de seu microambiente que determinam o destino de celular, fisiologia do tecido e progressão da doença. Portanto, o foco tornou-se cada vez mais em direção a desenvolver uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em tais comunicações célula-célula. A maioria de tais interações envolvem parácrina ou justácrina sinalização entre as células. Sinalização parácrina envolve a secreção de fatores específicos sinalização por uma célula que são percebidas pelos receptores correspondentes na outra célula na vizinhança, desencadeando uma resposta dentro de^9,10, Considerando que justácrina sinalização requer o contato direto entre os componentes celulares das duas células envolvidas^11,12.

Essa sinalização é um componente crucial na homeostase do tecido, bem como o microambiente do tumor. As células cancerosas beneficiam parácrina e justácrina fatores de células do estroma do tumor, incluindo cancro associado fibroblastos (CAFs), células do sistema imunológico e adipócitos^13,14,15,16. A sinalização pode ser mediada por fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, etc., enquanto a sinalização justácrina envolve justapostos ligantes e receptores como sinalização Notch, ou interações entre integrinas e seus respectivos parácrina proteínas da matriz extracelular. Nós demonstramos a importância das interações recíprocas entre as células de câncer de ovário e CAFs no¹⁴, de progressão e metástase tumor. Da mesma forma, as interações de células de câncer de ovário metástase com as células mesoteliais, cobrindo o local da metástase regulam chave microRNAs e fatores de transcrição em células cancerosas que promovem a colonização metastático^{17, 18}.

A maioria dos estudos na sinalização parácrina envolvem o uso de um meio condicionado coletado de tipo de uma célula para tratar o segundo tipo de célula com. Enquanto esta abordagem tem sido amplamente utilizada, ele não Replica eficazmente os níveis de alta concentração localizados do fator secretado no microambiente da célula receptora. Também não consegue reproduzir a cinética do fluxo contínuo do fator secretado sendo produzido por uma célula e recebido pela célula vizinha. Parácrina é eficaz em distâncias curtas, como os fatores secretados são nas concentrações necessárias apenas nas imediações da célula de origem e tendem a difundir e diluir para fora à medida que aumenta a distância de sinalização. Esta alta concentração localizada do fator secretado é essencial para desencadear uma resposta na célula do receptor. Além disso, a resposta nas células destinatários também é dependente o equilíbrio dos fatores secretados recentemente e seu esgotamento contínuo através de degradação, vinculação e internalização no destinatários células e difusão longe da célula de origem. Meio condicionado pode ser concentrado a conta para as altas concentrações localizadas presentes no microambiente, mas que exatamente não pode replicar as concentrações exatas. Além disso, ele não pode imitar a cinética natural de produção e depleção do fator envolvido. Para mais precisão replicar sinalização parácrina e separá-lo de justácrina mecanismos de sinalização, criámos um método de cultura proximal romance, que envolve os tipos de duas células em qualquer superfície de uma membrana porosa a crescer. Os poros são pequenos o suficiente para evitar interações justácrina e ainda permitir a troca de fatores secretados em concentrações elevadas localizadas. Dessa forma, este sistema retém a cinética da produção e depleção dos fatores parácrina.

O protocolo segue as diretrizes do Conselho regulamentação institucional da Indiana University.

1. preparação da pilha

1. Isolamento e cultura de células mesoteliais primárias de
   1. Isolado primárias mesoteliais células humanas (HPMCs) de omento humana como descrito anteriormente,^17,18 e cultivá-las em completar o meio de crescimento [modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina, 1% não aminoácidos essenciais e vitaminas 1%] a 37 ° C e 5% de CO₂.
      Nota: Os HPMCs são normalmente cultivadas para a confluência de 100% (figura 1A).
2. Condições de crescimento de células de câncer de ovário
   1. Desenvolvem-se células de câncer de ovário HeyA8 meio de crescimento completa em 37 ° C e 5% de CO₂.
      Nota: Uso HeyA8 células cultivadas para cerca de 80% confluência (figura 1B).

2. cultura de pilha

1. Set-up cultura proximal
   1. Uso Transwell insere para placas boas 6 com uma membrana de policarbonato μm de espessura de tecido-cultura-tratados 10 com 0,4 μm poros (10⁸ poros/cm²) e uma área de crescimento 4,67 cm² . Se necessário, otimize para inserção de diferentes tamanhos, dimensionando o número de células semeado de acordo com a área de superfície de crescimento. Meio quente completo crescimento, tripsina e fosfato salino (PBS) a 37 ° C antes do uso.
2. Preparando as inserções
   1. Para propagar as células HeyA8 na superfície da membrana da inserção inferior, remova o encaixe de sua embalagem utilizando Pinças esterilizadas e coloque-invertida em um prato de cultura estéril de 15 cm.
   2. Use um prato de 15 cm, pois tem a profundidade para acomodar a inserção invertida, ou substituí-lo com qualquer recipiente estéril apropriado. Dependendo do experimento, coloque o número necessário de inserções no prato 15 cm.
   3. Rotule os três controles e três condições experimentais em conformidade com um marcador na borda das pastilhas.
3. Preparando as células cancerosas
   1. Para trypsinize as HeyA8 células cultivadas na confluência de 80% em um balão de² 25 cm (~ 2 x 10⁶ células), adicionar 1 mL de tripsina (0,25%) para 40-60 s e neutralizar a tripsina com 6 mL de meio de cultura completo.
   2. Centrifugar as células a 500 x g , à temperatura ambiente (RT) por 3 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura completo. Conte as células ao vivo usando o método de exclusão do corante azul de Tripan.
4. Semeando as células cancerosas
   1. Suspenda a 100.000 células/mL de células de HeyA8 ao vivo no meio de crescimento completo. Cuidadosamente semente 80.000 HeyA8 células suspendidas em 800 μL de meio de cultura completo na parte inferior da inserção (que está agora virada para cima, uma vez que está invertida).
   2. As sementes das células para formar uma forma de cúpula, como assim as células permanecem na pastilha (Figura 1). Iniciar a partir do centro da membrana e mover-se para fora em círculos concêntricos ao Pipetar lentamente. Evite passar mais de 3 mm da borda para prevenir qualquer derramamento de médio porte.
      Nota: O número de células semeadas dependerá da taxa de crescimento das células e a duração do experimento. O número de células HeyA8 semeado para esta cultura proximal foram otimizado e as células será confluente 80 – 90% no final do terceiro dia.
5. Acessório de células de câncer
   1. Cubra o prato de 15 cm e cuidadosamente mover o prato contendo as inserções para a incubadora de CO₂ . É fundamental para que não perturbe a gota de médio e células na pastilha nesta etapa. Embora as células a 37 ° C por 4 h permitir que as células cancerosas anexar para a inserção.
6. Preparando as células mesoteliais
   1. Após cerca de 4 h, trypsinize as HPMCs crescidos na confluência de 100% em um balão de² 75cm (~ 4 x 10⁶ células) com 2 mL de tripsina (0,25%) por 1 – 2 min e neutralizar a tripsina com 12 mL de meio de crescimento completo.
   2. Centrifugar as células a 500 x g em RT por 3 min, Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura completo e contagem de células vivas, usando o método de exclusão do corante azul de Tripan.
7. Semeando as células mesoteliais
   1. Suspenda a 300.000 células/mL de HPMCs ao vivo no meio de crescimento completo. Adicione 2,5 mL de meio fresco completo de crescimento para cada poço de uma placa de 6. Cuidadosamente trazer o prato de 15 cm, contendo as inserções para fora para o bairro de biossegurança. Usando pinça estéril, a inserção da aleta e colocá-lo no poço da placa de 6-bem para que fique na posição vertical, com as células de HeyA8 ligadas à superfície inferior imergida no meio de crescimento completo (Figura 1).
   2. Semente de 450.000 HPMCs suspendidos em 1,5 mL do meio de crescimento no interior dos implantes com as células de HeyA8 ligadas à superfície, virado para o fundo do poço (Figura 1) ou para inserções sem quaisquer células HeyA8 para os controles HPMC. Adicione 1,5 mL de meio de crescimento sem pilhas para os controles HeyA8.
8. Crescer a cultura proximal
   1. Deixe a cultura proximal crescem a incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% de CO₂ por 72 h. Se necessário, o meio pode ser reposto da seguinte forma.
      1. Para o interior da inserção, remover 750 µ l e adicionar 750 µ l de meio fresco crescimento completo.
      2. Para o exterior da inserção (a 6 placa), retire 1 mL e adicionar 1 mL de meio fresco crescimento completo. O 1 mL foi escolhido para a conveniência de mudar o meio em uma única etapa. Se desejado, 1,25 mL pode ser removido e substituído em vez disso.
9. Recolha as células
   1. Recolha as células após 72 h da cultura proximal. Tome especial cuidado nesta etapa para evitar a contaminação cruzada de células HeyA8 e HPMCs. Trypsinize as células, centrifugue-los e lyse a pelota em vez de Lise das células na membrana para evitar uma contaminação cruzada.
10. Trypsinizing as células
    1. Enxágue ambos os lados da inserção com PBS 1x.
    2. As inserções de transferência para um novo poço e adicionar a tripsina. Adicionar 0,5 mL de tripsina no interior da inserção e adicionar 2 mL de tripsina para a placa de 6 para trypsinize as células de câncer ligadas à superfície inferior da inserção. Incubar a placa por 2 min a 37 ° C.
11. Neutralizando a tripsina
    1. Adicione 1 mL de meio de cultura completo no interior da inserção para neutralizar a tripsina, Pipetar para cima e para baixo e depois levar as células e transferi-los para um tubo de recolha rotulado. Adicione um adicional 2 mL do meio de crescimento completo de uma neutralização completa. Tenha cuidado para não perfurar a membrana enquanto pipetagem para evitar uma contaminação cruzada das células.
    2. Para coletar as células na parte inferior da inserção, pipete a tripsina 2ml que foi adicionada na etapa 12.2 para a superfície inferior 2 – 3 x para que as células cair na parte inferior da placa 6-poços. Neutralizar a tripsina na parte inferior da placa com 6 mL de meio de crescimento e transferir o conteúdo da placa para um tubo de recolha rotulado.
12. Coletando e lise das células
    1. Centrifugar as células a 500 x g por 3 min e Aspire os meios de comunicação. Resuspenda e lyse as pelotas de célula com 0,7 mL de reagente de Lise fenol e guanidina tiocianato-baseada para a extração de RNA. Isole o RNA usando qualquer kit apropriado.

3. reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa

Nota: As etapas a seguir descrevem uma reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR) para estudar as mudanças de expressões do gene como resultado a cultura proximal.

1. Prepare o cDNA de amostras de RNA para qPCR. Usar qualquer apropriado transcriptase reversa com um buffer correspondente e primers aleatórios para garantir a transcrição reversa do mRNA todos (ver Tabela de materiais).
2. Avaliar as alterações dos níveis de expressão de RNAm de fibronectina (FN1) e E-caderina (CDH1) e transformar o fator de crescimento beta 1 (TGFβ1) por qPCR com gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como um controle interno. É possível usar padronizados ensaios de expressão de gene comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) ou para projetar primers.
3. Compare as HeyA8 células crescidas na cultura proximal com HPMCs com os controles HeyA8 e as HPMCs crescidos em cultura proximal com os controles HPMC.

Metástase de células de câncer de ovário encontram células mesoteliais no local da metástase dentro da cavidade peritoneal¹⁹. Produtivo parácrina e justácrina interações com a ajuda de células mesoteliais na indução de respostas adaptáveis nas células de câncer de ovário, que permitem sucesso metástase^17,18,20,21 . Para testar a eficácia do método cultura proximal, testamos as parácrina interações entre as células de câncer de ovário HeyA8 e HPMCs. Anteriormente foi relatado que um coculture de HeyA8 células com HPMCs resulta em um aumento da expressão de fibronectina no HPMCs²¹. Esta indução da expressão de fibronectina é mediada por um aumento da secreção de TGFβ pelo HeyA8 células²¹. Portanto, nós testamos o efeito de uma cultura proximal de células HeyA8 e HPMCs sobre os níveis de RNAm de fibronectina e TGFβ ambos nestas células. Como esperado, cultura proximal com células HeyA8 resultou em um aumento da expressão de fibronectina nos HPMCs em comparação aos controles que foram semeadas em inserções sem células de HeyA8 ligadas à superfície inferior (Figura 2A). Da mesma forma, a cultura proximal da HPMCs com HeyA8 células resultaram em um aumento da expressão de TGFβ no primeiro caso (Figura 2B). A expressão de fibronectina e TGFβ também aumentou significativamente em células da HeyA8, após a cultura proximal com HPMCs em comparação com controles, onde HPMCs não foram semeadas na superfície superior das pastilhas (Figura 2 e 2D).

Para comparar o efeito da abordagem médio condicionado clássico, realizamos um experimento tratando HeyA8 células com um meio de HPMC-condicionado. Houve uma diminuição na expressão de fibronectina e uma mudança significativa no TGFβ em HeyA8 células tratadas com o meio de HPMC-condicionado. (Figura 3A e 3B). Testamos também o potencial de bloquear o TGFβ secretada com um anticorpo neutralizante na cultura proximal. O tratamento com o anticorpo neutralizante TGFβ resultou em uma diminuição significativa na indução de TGFβ HeyA8 células em cultura proximal com HPMCs (Figura 3). No entanto, o anticorpo neutralizante TGFβ aumentou ligeiramente a expressão TGFβ nas células controle HeyA8, provavelmente como uma resposta compensatória (Figura 3).

Além disso, testamos também o efeito da cultura proximal sobre os níveis de expressão do marcador epitelial E-caderina. Enquanto cultura proximal com células HeyA8 aumentou ligeiramente a expressão de E-caderina nos HPMCs (Figura 2E), observou-se uma diminuição acentuada na E-caderina no HeyA8 células cultivadas nas proximidades de HPMCs, em comparação aos controles (Figura 2F). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram a eficácia do sistema de cultura proximal em estudar a parácrina sinalização entre as células de câncer de ovário e as células normais no local da metástase que afetam a expressão do gene em ambos os tipos de células durante o processo de colonização metastático.

Figura 1: montagem do sistema de cultura proximal. (A), este painel mostra humanos células mesoteliais primárias (HPMCs). (B), este painel mostra HeyA8 células de câncer de ovário. Escala de barras = 200 µm (A-B). (C) HeyA8 células foram semeadas na superfície inferior de um transwell inserir com 0,4 µm de poros. Uma vez que as células foram anexadas, a inserção foi colocada em um poço de um 6-placa contendo meio de crescimento. Células mesoteliais então foram semeadas na inserção para que eles ligado à superfície superior e foram separados das células HeyA8 pela membrana. Os 0,4 µm poros na membrana permitida o intercâmbio de secretada fatores mas inibiu qualquer contacto directo entre as células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: efeito da cultura proximal na expressão do mRNA. O show de dois primeiros painéis da qPCR de fibronectina (A) e (B) TGFβ1 expressão nas células mesoteliais primárias humanas (HPMCs) cultivada proximalmente para células HeyA8, comparadas com o controle HPMCs. O show de dois painéis da qPCR para fibronectina (C) e (D) TGFβ1 expressão nas células HeyA8 cultivadas proximalmente para HPMCs, em comparação com controle Heya8 células. Os dois últimos painéis mostram o qPCR para a expressão de E-caderina no HPMCs (E) cultivadas proximalmente para células HeyA8 e HeyA8 (F) as células cultivadas proximalmente para HPMCs. N = 3, * p < 0,01. As barras de erro representam o desvio padrão das três repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: efeito de humano primário de células mesoteliais (HPMC)-condicionado tratamento médio na expressão de RNAm de células HeyA8. Os dois painéis top mostram o qPCR de fibronectina (A) e (B) TGFβ1 expressão nas células HeyA8. (C), este último painel mostra o efeito de inibir TGFβ1 secretada com um anticorpo neutralizante (TGFβ1 Ab) na expressão de HeyA8 TGFβ1 mediante uma cultura proximal com HPMCs. N = 3, * p < 0,01. p < 0,05. As barras de erro representam o desvio padrão das três repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Compreender o mecanismo de parácrina e justácrina sinalização entre as células é essencial para o desenvolvimento de um melhor conhecimento do tecido normal homeostase e doença condições^7,8. Parácrina a maioria dos estudos são conduzidos através da recolha de sinalização condicionado médio de uma célula tipo e usá-lo para tratar o outro tipo de célula. Este método tem uma vantagem em sua simplicidade inerente. No entanto, isso não com precisão recapitular as concentrações localizadas dos fatores secretados para o microambiente celular ou a cinética da produção e depleção dos fatores envolvidos. Enquanto os primeiros podem ser abordados em certa medida, embora não precisamente, concentrando-se o meio condicionado, é muito difícil de recriar a cinética. O uso de pastilhas transwell crescer células a inserção e o fundo do poço pode, em certa medida, recapturar os efeitos da cinética de produção e esgotamento. No entanto, as células são separadas pela distância entre a inserção e o fundo do poço e, assim, não podem recriar as concentrações localizadas dos fatores parácrina. Nós relatamos o desenvolvimento de um método simples de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina recíproca, que manteve as altas concentrações localizadas dos fatores secretados, bem como a dinâmica da taxa de produção e depleção dos fatores.

Em um estudo de prova de princípio, demonstrar a eficácia do método cultura proximal em reproduzir os efeitos das interações entre as células de câncer de ovário e HPMCs. Além disso, mostramos também os efeitos opostos de interações recíprocas parácrina na expressão do marcador epitelial E-caderina nas células HeyA8 e HPMCs. Enquanto nosso experimento envolveu o cultivo das células ao longo de um período de 3 dias, pode ser adaptado para mais curto ou mais pontos de tempo ajustando o número inicial de células semearam. Isso permite que os pesquisadores a estudar os efeitos a curto prazo, bem como a longo prazo da sinalização parácrina ou para realizar estudos de tempo-curso. Potencialmente, este método simples pode ser aplicado para qualquer pesquisa sobre parácrina sinalização entre dois tipos de células aderentes, incluindo Imunologia, angiogênese, desenvolvimento de células e cicatrização, além de estudos sobre o microambiente do tumor.

Os passos críticos neste método são propagação das células na superfície inferior da membrana e colheita das células de ambas as superfícies no ponto de extremidade. Atingimos a semeadura na superfície mais baixa pelo primeiro lançando a inserção e então propagação das células como uma grande gota de médio. A célula mais aderente dos dois estudadas deve ser semeada na superfície inferior. Tem que ser tomado para não perturbar a inserção enquanto incubando-lo para evitar esse blob do meio de perturbar. Gel de silicone pode ser aplicado para as bordas da pastilha para evitar a rebentar e derramar da bolha de líquido. No final do experimento cultura proximal, as células de ambos os lados da membrana são sequencialmente trypsinized em vez de lysed diretamente, porque eles lise sobre a membrana riscos contaminação cruzada dos lysates através dos poros. Por trypsinizing-los em seus compartimentos individuais e cuidar para que o volume médio e tripsina nunca excede o montante estipulado do protocolo, é evitar qualquer contaminação. Cada tipo de célula é coletado em um tubo separado, centrifugado, e o centrifugado é então lysed.

Embora esta técnica permite o estudo eficaz de interações parácrina, evitando interações diretas evidentes, não podemos descartar as interações através de encapsulamento nanotubules (TNTs). Alguns destes TNTs podem ser estreita o suficiente para passar através dos 0,4 µm poros e tempo o suficiente para abranger a 10 µm espessura da membrana. Enquanto nossas tentativas para verificar sua presença nos poros por microscopia confocal eram inconclusivos (dados não mostrados), microscopia eletrônica potencialmente poderia ser empregada para confirmar sua presença. Portanto, esse método não exclui a potencial comunicação célula-célula através de TNTs se as células do candidato são capazes de formá-los e interagir através deles. Da mesma forma, não podemos descartar aumentada autócrina sinalização como resultado o potencial bloqueio dos poros por células em ambos os lados da membrana, impedindo a difusão de cruz.

Crescimento de células em qualquer superfície de uma membrana com 0,4 µm de poros também permite a troca potencial de exosomes. Exosomes foram tradicionalmente considerados como sacos de lixo de células, mas pesquisas recentes indicaram que essas vesículas com sua carga de proteínas, microRNAs e até mesmo os mRNAs e DNA servem como importantes mediadores de parácrina comunicações celulares^{22 , 23 , 24}. portanto, o método de cultura proximal pode ser efetivamente usado para estudar comunicações celulares por meio de exosomes. Além disso, este método é passível de tratamento com inibidores específicos dos anticorpos neutralizantes ou sinalização contra o ligante secretada ou receptor correspondente. Em resumo, nós relatamos o desenvolvimento de um método simples e versátil cultura proximal, que pode se replicar com precisão parácrina sinalização, evitando interações diretas entre as células. A simplicidade deste método permite sua aplicação generalizada em diversos campos como a biologia do câncer, desenvolvimento e Imunologia.

Os autores não têm nada para divulgar.

Estamos em dívida para com os pacientes para a sua participação na coleção de tecidos para estas experiências. Um prêmio de academia do DoD OCRP ovário câncer (W81XWH-15-0253) e um piloto prêmio da Fundação de sonho de Colleen para Anirban K. Mitra apoiaram esta pesquisa.