パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

傍分泌と juxtacrine 細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。ここでは、近位文化メソッドを細胞の直接接触を防止しながら分泌因子のローカライズされた濃度を維持する、パラクリン シグナル伝達研究に使用します。

細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。パラクリンや juxtacrine シグナリングは、このような相互作用を仲介します。馴化培地と培養研究の使用は相互作用のこれらの 2 つのタイプを区別する最も一般的な方法です。ただし、パラクリン作用中に、微小環境における分泌因子のローカライズされた高濃度の効果は馴化培地によって正確にそうはいないと、したがって、不正確な結論につながる可能性があります。この問題を克服するために我々 は、パラクリン シグナルを研究する近位部の培養法を考案しました。2 つのセル型は、0.4 μ m 孔を持つ 10 μ m 厚ポリカーボネート膜のいずれかのサーフェスに栽培しています。毛穴は分泌因子の交換を許可して、同時に juxtacrine シグナリングを禁じる。細胞を収集、パラクリン シグナル伝達の効果を決定するエンドポイントで分離できます。分泌因子の局在の濃度勾配をできるだけでなく、この方法は長時間文化だけでなく、阻害剤の使用を含む実験を受けやすい。このメソッドを使用して、卵巣癌細胞と中皮細胞の転移のサイトで出会う彼ら間の相互作用を研究する、パラクリン シグナル、様々 な分野の研究に研究の 2 つ付着性のセル型に合わせることができます。開発、免疫学、腫瘍微小環境を含みます。

がん細胞と腫瘍の進行がん微小環境との間の生産的な相互作用の役割は、定着させてきた、がん生物学¹の研究の主要な焦点となっています。双方向信号のような場合、重要な創傷治癒、免疫反応、血管新生、幹細胞ニッチ中および開発^{2,3,4,5,6,7,8}. これらのすべての生物学的プロセスに共通するテーマは、細胞が様々 な細胞の運命、組織生理学、病気の進行を決定するの細胞外のキューにその微小環境からの方法で応答します。したがって、このような細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムの理解に向けてますますなっています。このような相互作用の大部分は、パラクリンや juxtacrine 細胞間シグナル伝達を伴います。Juxtacrine に対し^9,10、それの応答をトリガー、近くの別のセルの対応する受容体によって感知される 1 つのセルによって特定のシグナル伝達因子の分泌を含むパラ分泌シグナル信号 2 つのセル関係^11,12細胞成分の直接の接触が必要です。

このような信号だけでなく、腫瘍微小環境における組織の恒常性の重要なコンポーネントです。がん細胞の恩恵癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs)、免疫細胞、脂肪細胞^13,14,,1516など、腫瘍・間質の細胞からパラクリン juxtacrine 要因。パラクリン シグナル並置配位子と Notch シグナル、またはインテグリンと、それぞれの相互作用と同様に受容体を含む juxtacrine シグナリング、成長因子、サイトカイン、ケモカインなどによって媒介されることができます。細胞外マトリックス蛋白質。我々 は、腫瘍の進展と転移¹⁴で卵巣癌のセルと CAFs との相互作用の重要性を実証しました。キーのマイクロ Rna と癌細胞転移増殖^17,を促進する転写因子同様に、転移性卵巣癌細胞転移を覆う中皮細胞の相互作用を調節します。¹⁸。

パラクリン シグナル伝達に関するほとんどの研究と 2 番目のセルのタイプの治療に 1 つのセル型から収集した馴化培地の使用を含みます。このアプローチは広く使用されて、それは効果的に受容細胞の微小環境における分泌因子のローカライズされた高濃度を複製してないです。また、1 つのセルによって生成されて分泌因子の連続的な流れの動態を再現するは失敗し、隣接セルによって受信されました。パラクリン シグナル分泌因子、ソース セルの近くでのみ必要な濃度で拡散し、を希釈する距離が長くなる傾向があると短い距離で効果的です。このローカライズされた高濃度分泌因子の受容細胞の応答をトリガーに不可欠です。また、受信者の細胞応答も新しく分泌因子と劣化、バインド、および受信者のセル、ソース セルから拡散の国際化を通じて継続的な枯渇のバランスに依存しているです。馴化培地は、微小環境に存在高いローカライズされた濃度のアカウントに集中することができますが、ことは、正確な濃度を正確に複製することはできません。さらに、生産の自然動態と関与する因子の枯渇を模倣することはできません。正確にパラ分泌シグナルをレプリケートし、juxtacrine シグナリング メカニズムから分離、我々 は多孔質膜のいずれかのサーフェスの 2 つのセルのタイプを育てることを含む近位培養法を考案しました。毛穴が小さく、juxtacrine やり取りを防ぐためし、まだローカライズされた高濃度に分泌因子の交換を許可します。その方法では、このシステムは、生産の動力学とパラクライン因子の枯渇を保持します。

プロトコルは、インディアナ大学の制度的規制委員会のガイドラインに従います。

1. セル準備

1. ひと中皮細胞の分離と培養
   1. 分離ひと中皮細胞 (HPMCs)^17,18を前述とのそれらを育てる人間の大網から完了成長培地 [ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 1% を含むペニシリン-ストレプトマイシン, 1% 非本質的なアミノ酸、および 1% ビタミン] 37 ° C および 5% の CO₂。
      注: HPMCs は、通常 100% 合流点 (図 1 a) を栽培しています。
2. 卵巣癌の細胞の成長条件
   1. 37 ° C、5% CO₂で完全培地に HeyA8 卵巣癌細胞を成長します。
      注: 使用 HeyA8 セル成長する約 80% 合流 (図 1 b)。

2. 細胞培養

1. 近位文化セットアップ
   1. 使用 Transwell 0.4 μ m 孔 (10⁸毛穴/cm²) と 4.67 cm²成長分野 10 μ m 厚い組織文化扱われるポリカーボネート膜 6 ウェル プレートを挿入します。必要な場合は、成長の表面積によると播種された細胞の数を拡大することで異なる挿入サイズの最適化します。温かみのある完全な成長媒体、トリプシン、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 使用前に 37 ° c。
2. 挿入の準備
   1. 挿入の膜の下の表面の HeyA8 細胞をシードするには、滅菌ピンセットを使用してパッケージからドライブベイ カバーを取り外し、滅菌 15 cm 培養皿で反転配置。
   2. 反転挿入に対応する適切な滅菌コンテナーとそれの代わりに深さがあり、15 cm 皿を使用します。実験によって 15 cm 皿に挿入の必要な数を配置します。
   3. 3 つのコントロールと 3 つの実験条件をそれに応じてラベル挿入の端にマーカーで。
3. がん細胞を準備
   1. 25 cm²フラスコ (10 の⁶セル × 2 ~) 80% 合流で育った HeyA8 細胞を trypsinize 40-60 s のトリプシン (0.25%) の 1 つの mL を追加し、6 ml の完全培のトリプシンを中和します。
   2. 室温 (RT) 3 分間で 500 x gで細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、5 ml の完全培細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除法を使用して生きているセルをカウントします。
4. 癌細胞の播種
   1. 100,000 セル/mL の完全培地に生きている HeyA8 のセルを中断します。慎重に種 80,000 HeyA8 細胞懸 (これは今直面している、それが反転するので) 挿入の下に完全な成長媒体の 800 μ L。
   2. ドームのような形を形成するので、セルの挿入 (図 1) のままに細胞を播きます。膜の中心から開始し、ゆっくりとピペッティングしながら同心円の外側に移動します。あらゆる媒体の流出を防ぐためにエッジから 3 mm 以上を行くことを避けてください。
      注: セルの成長率と実験の期間に播種された細胞の数によって異なります。この近位文化のシード HeyA8 細胞数を最適化した、セルは、3 日目の終わりに 80-90% の合流になります。
5. 癌細胞の接着
   1. カバー 15 cm 皿、CO₂インキュベーターへの挿入を含む料理を慎重に移動します。培地およびこの手順で挿入のセルのドロップを破壊することが重要です。挿入にアタッチする癌細胞を許可する 4 h の 37 ° C で細胞を残します。
6. 中皮細胞の準備
   1. 約 4 時間後 100 %2 ml のトリプシン (0.25%) に 1-2 分の 75 cm²フラスコ (10 の⁶セル × 4 〜) で合流で成長して HPMCs を trypsinize、12 ml の完全培のトリプシンを中和します。
   2. 500 x gで RT 3 分で細胞を遠心分離機、10 mL の完全培に細胞ペレットを再懸濁します、トリパン ブルー色素排除法を使用して生きているセルをカウントします。
7. 中皮細胞を播種
   1. 完全培地にライブ HPMCs の 300,000 細胞/ml を中断します。6 ウェル プレートの各ウェルに新鮮な完全な成長媒体の 2.5 mL を追加します。うちバイオ セーフティ フードへの挿入を含む 15 cm の料理をもたらす慎重に。滅菌鉗子を使用して、挿入を反転し、6 ウェル プレートのウェルに配置、完全な成長媒体 (図 1) に浸漬下面に接続されている HeyA8 細胞直立。
   2. シード 450,000 HPMCs または HPMC コントロールの HeyA8 セルなし挿入 (図 1) 井戸の底の面に接続 HeyA8 細胞とインサートの内側の成長培地の 1.5 mL で中断します。細胞成長培地の 1.5 mL を HeyA8 コントロールに追加します。
8. 近位の文化を育てる
   1. 72 h の 37 ° C で 5% CO₂ CO₂インキュベーターで育つ近位文化をしましょう。必要な場合、媒体をとおり補充することができます。
      1. カバーの内側、750 μ L を削除し、完全な新鮮な成長媒体の 750 μ L を追加します。
      2. 挿入 (6 ウェル プレート) の外、1 mL を削除し、新鮮な完全な成長培地 1 mL を追加します。1 mL は、1 つのステップの中での利便性のために選ばれました。に応じて、1.25 mL を削除、代わりに交換することができます。
9. セルの収集
   1. 近位文化の 72 時間後セルを収集します。セル HPMCs。 Trypsinize と HeyA8 細胞のクロスコンタミネーションを防ぐためにこの段階で特別な注意を取る、それらを遠心し、交差汚染を防ぐために膜に細胞を溶解ではなくペレットを溶解します。
10. 細胞をトリプシン
    1. 1x PBS で挿入の両側をすすいでください。
    2. 新しい井戸に挿入を転送し、トリプシンを追加します。カバーの内側に 0.5 mL のトリプシンと挿入の下面に接続されているがん細胞を trypsinize に 6 ウェル プレートに 2 mL のトリプシンを追加します。37 ° C で 2 分間プレートを孵化させなさい
11. トリプシンを中和
    1. トリプシンを中和、ピペットの上下、および、細胞を取るし、ラベル コレクションの管にそれらを転送にカバーの内側に完全な成長培地 1 mL を追加します。中和を完全に完全な成長媒体の追加 2 mL を追加します。細胞のクロスコンタミネーションを防ぐためにピペッティングしながら細胞膜に穴を開けるように注意が必要があります。
    2. セルを挿入の下に収集、底面に 12.2 手順で追加した 2-3 x セル 6 ウェル プレートの底に落ちるように 2 mL のトリプシンをピペットします。6 ml の成長媒体のプレートの底にトリプシンを中和し、プレートの内容をラベル コレクション チューブに転送します。
12. 収集し、細胞を溶解
    1. 500 x g 3 分で細胞を遠心し、メディアを吸引します。再懸濁します、RNA 抽出用の溶解試薬のフェノールとグアニジン-チオシアン酸塩-ベースの 0.7 ml 細胞ペレットを溶解させます。任意の適切なキットを使用して RNA を分離します。

3 量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応

注: 次の手順は、近位の文化の結果として遺伝子の表現の変更を検討する、リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) をについて説明します。

1. QPCR の RNA のサンプルからの cDNA を準備します。対応するバッファーとランダム プライマーすべて mRNA の逆のトランスクリプションを確保するため任意の適切な逆転写酵素を使用 (材料の表を参照してください)。
2. フィブロネクチン (FN1) と E-カドヘリン (CDH1) の mRNA 発現量の変化を評価し、内部統制としてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) と qPCR による成長因子 β 1 (TGFβ1) を変換します。標準化された市販遺伝子式の試金 (材料の表を参照) を使用するかプライマーを設計することが可能です。
3. HeyA8 コントロールと HPMCs と HPMC コントロールと近位文化で育つ HPMCs 近位の文化で育った HeyA8 細胞を比較します。

転移性卵巣癌細胞¹⁹腹腔内転移の部位に中皮細胞が発生します。成功した転移^{17,18,20,21 を有効にすると卵巣癌のセルの適応応答の誘導に中皮細胞の助けを借りて生産パラクリンと juxtacrine 相互作用}.近位培養法の有効性をテストするため HeyA8 卵巣癌細胞と HPMCs のパラクリンの相互作用をテストしました。以前、HPMCs と HeyA8 細胞の培養結果 HPMCs²¹におけるフィブロネクチンの発現を増強する報告されています。このフィブロネクチン発現誘導は、HeyA8 セル²¹TGFβ の増加分泌によって媒介されます。したがって、両方のこれらの細胞のフィブロネクチンと TGFβ の mRNA のレベルに及ぼす近位培養 HeyA8 細胞と HPMCs をテストしました。予想通り、HeyA8 細胞の近位の文化は挿入 (図 2 a) 下面に接続されている HeyA8 細胞播種のコントロールに比べて HPMCs におけるフィブロネクチンの発現の増加で起因しました。同様に、前者 (図 2 b) で TGFβ の発現の増加で起因した細胞 HeyA8 と HPMCs の近位文化。フィブロネクチンと TGFβ の両方の式は、コントロールと比較する HPMCs と近位文化 HPMCs が挿入 (図 2および2 D) の上面に播種したない HeyA8 細胞でも大幅増加しました。

古典的なエアコン中のアプローチの効果を比較するには、HPMC エアコン媒体と HeyA8 セルを扱う実験を行った。ファイブロネクチン発現の減少、HPMC 調整培 HeyA8 細胞 TGFβ に大きな変化があった。(図 3 aと3 b)。また、近位の文化における中和抗体を分泌 TGFβ をブロックする可能性をテストしました。TGFβ 中和抗体による治療は、HPMCs (図 3) と近位培養 HeyA8 細胞 TGFβ の誘導で大幅な減少で起因しました。ただし、TGFβ の中和抗体微増コントロール HeyA8 細胞における TGFβ の発現 (図 3) の代償反応としておそらく。

さらに、また上皮性マーカー E-カドヘリンの発現レベルに及ぼす近位文化をテストしました。HeyA8 細胞の近位文化 HPMCs (図 2 e) の E-カドヘリンの発現が微増、E-カドヘリンの著しい減少コントロール (図 2 f) と比較すると HPMCs の近くで育った HeyA8 細胞で観察されました。一緒に取られて、これらの結果は卵巣癌細胞と転移中に両方の細胞の種類の遺伝子発現に影響を与えるサイトで正常細胞間シグナリング パラクリンの勉強に近位文化システムの有効性を示す、転移の植民地化のプロセス。

図 1: 近位文化システムのアセンブリです。(A) パネルを示しています人間のプライマリ中皮の細胞 (HPMCs)。(B) このパネルは、HeyA8 卵巣癌のセルを示しています。スケール バー 200 μ m (A ・ B) を =。(C) HeyA8、transwell の低い表面の細胞を播種は 0.4 μ m の気孔を挿入します。セルが接続されると、挿入は成長媒体を含んでいる 6 ウェル プレートのウェルに配置されました。中皮細胞は、上面に接続されているし、が HeyA8 細胞から膜で隔てられて、挿入で播種しました。0.4 μ m 孔膜の交換を許可要因を分泌はセル間の直接接触.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: mRNA の発現におよぼす近位栽培します。フィブロネクチン (A) と (B) TGFβ1 発現ひと中皮細胞 (HPMCs) の qPCR 培養近位 HeyA8 セル、コントロール HPMCs に比較する最初の 2 つのパネルを。次の 2 つのパネルを qPCR フィブロネクチン (C) と (D) TGFβ1 式 HeyA8 細胞での HPMCs に近位培養、細胞制御 Heya8 と比較しています。最後の 2 つのパネル (E) HPMCs HeyA8 細胞と培養近位に HPMCs N (F) HeyA8 細胞に培養近位での E-カドヘリン発現の qPCR の表示 = 3、* p < 0.01。誤差範囲は、3 つの繰り返しの標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 人間原発中皮細胞 (HPMC) の効果-HeyA8 細胞の mRNA 発現に対する中治療を完備します。トップの 2 つのパネルは、HeyA8 細胞のフィブロネクチン (A) と (B) TGFβ1 式の qPCR を表示します。(C) この最後のパネルは、 N HPMCs と近位文化に HeyA8 TGFβ1 式中和抗体 (TGFβ1 Ab) で分泌された TGFβ1 を抑制する効果、3 を = * p < 0.01。p < 0.05。誤差範囲は、3 つの繰り返しの標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

パラクリンの juxtacrine 細胞間シグナル伝達機構を理解することは、正常組織の恒常性と病気の条件^7,8のよりよい知識を開発するため不可欠です。ほとんどパラクリン シグナルにより収集実施エアコンから 1 つのセルの種類とその他の細胞のタイプの治療に使用中。このメソッドでは、その本来のシンプルさの利点があります。しかし、それはない正確に再現細胞の微小環境における分泌因子のローカライズされた濃度または生産の動態と関与する因子の枯渇。前者はある程度対処することができます、しかし正確に、馴化培地を集中してだ動態を再現する非常に困難。セル挿入と井戸の底を育てること transwell 挿入の使用はある程度の生産と消耗速度論的効果を取り戻すことができます。ただし、セルの挿入と、井戸の底の間の距離によって区切られ、したがって、パラクリン因子のローカライズされた濃度を再作成できません。分泌因子のローカライズされた高濃度だけでなく、生産率と要因の枯渇のダイナミクスを保った相互パラクリン シグナル伝達、勉強する近位文化法の開発を報告しました。

原理の実証研究では、卵巣癌細胞と HPMCs の相互作用は報告された効果の再現に近位培養法の有効性を示した。さらに、上皮性マーカー HeyA8 細胞で E-カドヘリンと HPMCs の式で相互パラクリン作用の反対の効果についてもしました。我々 の実験は、3 日間の期間にわたって、細胞を培養を行って、短いに合わせることができるまたは細胞数の初期値を調整することによって長い時間ポイント シードします。これにより、パラクリン シグナル短期と長期の効果や経時的研究を実施する研究者。この簡単な方法は、パラクリン シグナル伝達、免疫学、血管新生、セルの開発、創傷治癒、腫瘍微小環境の研究に加えてなど 2 つの付着性のセル型の間の研究に潜在的適用できます。

この方法の重要な手順は、膜の下の表面の細胞を播種、エンドポイントで両方の表面から細胞を採取します。最初反転挿入中の大規模なドロップとして、細胞を播種して低い表面のシードを達成しました。研究の 2 つのより付着性のセルは、底面にシードする必要があります。ケアは、中断からの媒体のこの blob を避けるために抱卵中の挿入を邪魔しないようにする必要があります。シリコーンゲルは、こぼれる液体の泡の破裂を避けるために挿入のエッジに適用できます。近位培養実験の終わりには、細胞膜の両側が順番にトリプシンの代わりに、直接分離孔を通って lysates の膜リスクの交差汚染にそれらを溶解するため。それらを彼らの個々 のコンパートメントにトリプシンと世話を媒体とトリプシンのボリュームはプロトコルの規定量を超えることはありません、すべての交差汚染を回避できます。遠心分離、別の管で各セル型が収集され、細胞ペレットを分離するか。

この手法は、明白な直接的な相互作用を避けながらパラクリン作用の効果的な学習を使用できますが、ナノチューブ (TNTs) をトンネルを通して相互作用を排除できません。これら TNTs のいくつかは、0.4 μ m の細孔を通過するには十分に狭いと膜の 10 μ m の厚さをスパンする十分な長さをすることができます。共焦点顕微鏡による毛穴の彼らの存在を確認する我々 の試みでしたが決定的な (データは表示されません)、電子顕微鏡が自分の存在を確認する潜在的採用されている可能性があります。したがって、このメソッドは TNTs を通じて潜在的な細胞間コミュニケーションを除外しない候補細胞がそれらを形成し、それらを介して相互作用することができる場合。同様に、相互拡散防止増加増殖細胞膜の両側によって毛穴の潜在的なブロックの結果としてシグナルを排除することはできません。

エクソソームの潜在的な交換ができます 0.4 μ m の孔を持つ膜のいずれかの表面の細胞を成長しています。エクソソーム伝統的細胞、ゴミ袋として考えられていたが、最近の研究は、パラクリン セルラー通信²²の重要なメディエーターとしての DNA とも Mrna マイクロ Rna は、タンパク質、積荷でこれらの小胞を使用することを示しています^,23,24. エクソソームを介して携帯電話通信を勉強する近位文化メソッドを効果的に使用できますしたがって。さらに、このメソッドは分泌リガンドまたは対応する受容体シグナリングまたは中和抗体の特異的阻害剤による治療を受けやすい。要約すると、我々 は傍分泌細胞の直接相互作用を防止しながら信号を正確に複製することができますシンプルで汎用の近位文化メソッドの開発を報告しました。この方法のシンプルさは、がん生物学、開発、免疫学などの分野で広く応用できます。

著者が明らかに何もありません。

これらの実験の組織コレクションに参加するため患者さんにお世話になっております。国防総省 OCRP 卵巣癌アカデミー賞 (W81XWH-15-0253) および Anirban k. ミトラにコリーンの夢財団からパイロット賞は、この研究をサポートしました。