In Situ Técnicas de hibridização para amostras de Coral adultas parafina

O objetivo do presente protocolo é executar hibridação in situ em amostras de coral adultas que foram incorporadas em parafina e seccionadas em lâminas de vidro. Este é um método qualitativo usado para visualizar a expressão espacial de uma sonda de anti-sentido RNA em tecidos de parafina.

Os corais são invertebrados oceano importantes que são cruciais para a saúde geral do oceano, bem como a saúde humana. No entanto, devido a impactos humanos tais como o aumento das temperaturas do oceano e a acidificação dos oceanos, os corais são cada vez mais sob ameaça. Para enfrentar esses desafios, avanços na biologia celular e molecular provaram para ser crucial para o diagnóstico da saúde dos corais. Modificar algumas das técnicas usadas em medicina humana poderia melhorar consideravelmente a capacidade dos investigadores para tratar e salvar os corais. Para resolver isso, um protocolo para a hibridação in situ utilizada principalmente em medicina humana e biologia do desenvolvimento evolutiva foi adaptado para uso em adultos corais sob estresse.

A finalidade desse método é Visualizar a expressão espacial de uma sonda de RNA no tecido coral adulto que foi incorporado em parafina e seccionado em lâminas de vidro. Este método concentra-se na remoção da parafina e reidratação da amostra, pré-tratamento da amostra para garantir a permeabilidade da amostra, pré-hibridação de incubação, hibridização da sonda RNA e visualização da sonda RNA. Este é um método poderoso quando usando organismos não-modelo para descobrir onde genes específicos são expressos, e o protocolo pode ser facilmente adaptado para outros organismos não-modelo. No entanto, o método é limitado, em que é essencialmente qualitativa, porque a intensidade de expressão pode variar dependendo da quantidade de tempo utilizado durante a etapa de visualização e a concentração da sonda. Além disso, a paciência é necessária, como este protocolo pode levar até 5 dias (e em muitos casos, mais tempo) dependendo da sonda sendo usado. Finalmente, coloração de fundo específico é comum, mas essa limitação pode ser superada.

Os corais são construtores de ecossistema crítico e importante para a biodiversidade no oceano e a saúde humana^1,2,3. Eles estão sob ameaça devido à mudança climática e outros estressores antropogênicas, e muitas espécies de corais são considerados criticamente em perigo. Assim, há uma necessidade significativa de ferramentas celulares e moleculares diagnosticar os corais sob estresse. Além disso, lá é pouco compreendida sobre onde os genes são expressos dentro tecido coral adulto e, portanto, pouca compreensão das funções destes genes. Para resolver esse problema, nós adaptamos o protocolo hibridação (ISH) em situ , comumente usado em medicina humana e biologia do desenvolvimento evolutiva, para uso em amostras de tecido de parafina de corais adultos. Esta técnica é mais poderosa quando usado em corais adultos que foram submetidos a um evento estressante como a exposição ao stress de calor. No entanto, esta técnica pode ser usada em uma ampla gama de tecidos e estágios de vida em corais e não está limitada a apenas tensão térmica corais^4,6,7. Além disso, esta técnica pode ser usada em tecidos ou células de qualquer metazoan enquanto há informações de sequência de cDNA disponível.

A finalidade desse método é a visualização de sondas de RNA dentro de tecido coral adulto que foi preservada e incorporado em parafina e seccionados em slides. Este método é uma poderosa ferramenta de diagnóstico que permite a visualização dos ácidos nucleicos dentro de tecido coral adulto. Este método foi desenvolvido inicialmente para o diagnóstico médico, e ele se tornou uma ferramenta popular em campos como a biologia do desenvolvimento e biologia evolutiva do desenvolvimento^8,9,10. ISH é também um método crítico, particularmente em sistemas não-modelo, quando genômica e dados de sequência de transcriptomic estão disponíveis, mas padrões de expressão de gene espaciais são desconhecidos. Para o trabalho de diagnóstico em sistemas não-modelo, essa técnica é poderosa porque pode indicar quais as células e tecidos expressam um gene de interesse e podem levar a mais abordagens terapêuticas alvo^{8,9,10, 11,12}. Por último, esta técnica é qualitativa e mais poderoso quando combinado com a expressão de gene quantitativa dados¹¹.

A abordagem descrita neste documento será de interesse para os investigadores que já projetou uma Digoxigenina (DIG)-rotulado sonda RNA (tanto o sentido e antisentido sondas) e estão agora prontos para realizar a hibridação in situ das sondas para uma amostra. Para executar este método, duas seções seriais de um tecido de parafina coral serão necessários para cada sonda sendo testada. Uma seção será usada para a sonda de sentido e o outro para a sonda antisentida. A sonda de sentido será um controle para indicar a ligação não-específica. Se a coloração é observada na sonda de sentido, então, a sonda antisentida não é específica para o RNA de interesse. Sondas podem ser projetadas para qualquer gene expressada. Neste protocolo, são usados vários exemplos que anteriormente foram encontrados para ser expressa durante o stress de calor em corais: homólogo B (Fos-B), proteína ativador (AP1), do oncogene viral do osteossarcoma murino de Fernandes e fator de necrose tumoral receptor 41 (41 TNFR)¹¹. ISH usando sondas de RNA escavar-etiquetadas é preferível usando sondas radioactivas porque sua manipulação é muito mais seguro,¹⁰. Além disso, esta técnica é altamente sensível e pode ser executada em uma ampla gama de tecidos e embriões além da tensão térmica corais adultos^13,14,15,16.

1. remoção da parafina

Atenção: Execute as seguintes etapas sob uma coifa.

1. Dewax os slides fino-seccionado de parafina com xilol 100% sob o capô em potes de vidro Coplin por 10 min. Não use frascos plásticos de Coplin, xileno derrete o plástico. Esterilize os frascos de Coplin em autoclave antes de usar.
2. Prepare-se quatro frascos de Coplin de vidro estéril com o seguinte: etanol 100%, 80% de etanol, etanol 70% e 60% de etanol. Dilua o etanol com água livre de RNase.
   1. Transferir os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com 100% de etanol e embeba-os por 10 min. Depois de 10 min, esvaziar o copo de Coplin e substitua por nova 100% de etanol. Mergulhe os slides novamente por 10 min.
   2. Transferi os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com 80% de etanol por 1 min.
   3. Transferi os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com etanol a 70% por 1 min.
   4. Transferi os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com etanol 60% por 1 min.

2. pré-tratamento de Slides para preparação de hibridização da sonda RNA

1. Execute as lavagens seguintes à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. Realize lavagens de temperatura em um agitador orbital a uma velocidade lenta. Use utentes slide estéril com espaço para até cinco slides para a lavagem dos slides.
2. Transferi os slides para um mailer slide estéril com 18 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS). Lavagem por 5 min à temperatura ambiente.
3. Despeje a PBS 1x e tratar imediatamente o tecido nos slides com proteinase K, para permitir a penetração da sonda do tecido. Adicionar aproximadamente 18 mL de solução de proteinase K ao mailer slide (ver tabela 1 para trabalhar a concentração da solução). Incube a 37 ° C por 15 min. Não agite.
   1. Enquanto os slides estão incubando, prepare o prehybridization buffer (Buffer de Prehybe). Coloque o Buffer de Prehybe em um banho de água fervente durante 10 minutos e, em seguida, deixe esfriar sobre um banho de gelo por 5 min. Para uma receita de Prehybe de Buffer, consulte tabela 1.
   2. Parar a digestão da reação de proteinase K derramando a solução de proteinase K e imediatamente adicionar 18 mL de solução de glicina-PBS de 0,2% para o mailer de slide. Deixe o mailer slide sentar-se à temperatura ambiente por 5 min.
   3. Deite fora a solução de glicina-PBS de 0,2% e adicionar 18 mL de solução de citrato de sódio salina (SSC) 2 x para mailer cada slide. Lave os slides no 2 x SSC por 10 min à temperatura ambiente, com agitação em 100-150 rpm.

3. prehybridization de Slides em preparação para a hibridização da sonda RNA

1. Enquanto os slides estão sendo lavados com 2 x SSC, obter um novo mailer slide estéril e colocou o mailer slide aproximadamente 18 mL de tampão de Prehybe. Coloque o mailer slide no forno na temperatura de hibridização hibridização.
   Nota: A temperatura de hibridização dependerá da sonda a ser usada, mas geralmente varia de 50-60 ° C.
2. Concluída a lavagem de 2 x SSC, despeje o 2x SSC e lugar os slides dentro o mailer slide no Buffer de Prehybe o forno de hibridização por 1h.

4. hibridização da sonda RNA

1. Enquanto os slides estão incubando com o Buffer de Prehybe no forno da hibridação, prepare a solução de hibridação-sonda.
   1. Dilua cada sonda em tampão de hibridização (0,5 µ l de sonda com 24,5 µ l de tampão de Hibridização).
      Nota: A receita para o tampão de hibridização encontra-se na tabela 1. Um exemplo de preparação de sonda e concentrações pode ser encontrado em Traylor-Knowles et al ¹¹.
   2. Coloque a sonda diluída em um bloco de calor de 86-90 ° C por 12 min e, em seguida, deixe esfriar por 1 min no gelo.
2. Remover o mailer slide do forno de hibridização e retire slides individualmente o mailer de slide usando uma pinça estéril. Coloque os slides sobre uma toalha de papel e cuidadosamente Limpe o excesso de Prehybe de Buffer ao redor as amostras de tecido. Tenha cuidado para não tocar as amostras e trabalho rapidamente para impedir a secagem das amostras de tecido.
3. Cercar o tecido com uma caneta PAP. Aplicar 25 µ l de solução diluída de sonda com uma pipeta e cobrir a amostra com uma lamela de plástico.
   1. Coloca as amostras na câmara de umidade de slide com 4 x SSC + solução de formamida 50% na parte inferior da câmara.
   2. Depois de sondas foram adicionadas a todos os slides, colocar a câmara de umidade de slide no forno hibridização pelo menos 24 h a uma temperatura de hibridação de 50-60 ° C. O tempo de incubação pode variar dependendo da concentração da sonda, mas deve ser por um período mínimo de 24 horas.
4. Após a incubação durante a noite com as sondas diluídas, remova a câmara de umidade de slide do forno de hibridização.
   1. Remova as lamelas de cada um dos slides, tomando cuidado para não deslocar o tecido. Em uma pipeta de 1000 µ l, adicionar 1000 µ l de solução de x SSC 2 e delicadamente lave o slide.
   2. Coloque o slide em um mailer slide estéril com 18 mL de solução de x SSC 2 por 5 min à temperatura ambiente. Deite fora a solução e substituí-lo com 18 mL de fresco 2 x SSC. Repeti a incubação por 5 min à temperatura ambiente com agitação suave.
   3. Despeje a solução de x SSC a 2. Adicione 18 mL de 1 solução x SSC e lavagem por 5 min à temperatura ambiente. Deite fora a solução de x SSC 1 e substituí-lo com 18 mL de fresco 1 x SSC. Repita a incubação por 5 min à temperatura ambiente com agitação suave.
   4. Deite fora a 1 x SSC. Adicione 18 mL de 0.5 x SSC e lavagem por 10 min a 42 ° C sem tremer. Deite fora a 0,5 x SSC e substituir com 18 mL de 0.5 fresco x SSC. Lave novamente por 10 min a 42 ° C, sem agitação.

5. visualização da sonda RNA

Nota: Para visualizar a sonda, o roxo BM será usado durante o processo de desenvolvimento. No entanto, antes desta etapa, várias lavagens são necessárias para preparar as amostras para a coloração.

1. Lave os slides com 18 mL de tampão de fosfatase alcalina (AP-tampão) sem MgCl₂ por 1 min. Despeje o AP-Buffer sem MgCl₂e adicionar 18 mL de tampão de bloqueio 1 x Boehringer Mannheim diluído com tampão de ácido maleico. Incube durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente em um mailer slide com agitação suave.
   Nota: Os buffers de bloqueio Boehringer Mannheim e ácido maleico utilizados foram premade e comprados na lavagem de escavação e bloco Buffer definido (disponível comercialmente).
   1. Alternativamente, pode ser realizada a incubação durante a noite a 4 ° C. Um período mais bloqueio irá diminuir a aparência de ligação não-específica.
2. Preparar os 20 mL diluídos fragmentos Fab anti-Digoxigenina-AP de escavação (anticorpo antiescavação = 2 µ l de anticorpo antiescavação + 20 mL 1 x tampão de bloqueio Boehringer Mannheim). Isto é suficiente para uso em 1 mailer corrediça plástica. Mais esta solução devem ser preparada se mais de um slide mailer é para ser usado.
3. Adicione o anticorpo antiescavação para um mailer estéril slide novo e transferir os slides para o mailer slide com a solução de anticorpo antiescavação. Incube a temperatura ambiente por 3 h com agitação suave.
4. Após a incubação, deite fora o anticorpo antiescavação e lavar as lâminas no mailer slide com 18 mL de AP-tampão sem MgCl₂ por 5 min com agitação suave.
5. Deite fora o AP-Buffer sem MgCl₂ e adicionar 18 mL de AP-tampão. Lavagem por 5 min com agitação suave. Após a incubação de 5 min, deite fora o AP-Buffer, substituí-lo com 18 mL de AP-Buffer fresco e lavar por 5 min com agitação suave.
6. No escuro, deite fora o AP-Buffer e adicionar 18ml de BM roxo ao mailer slide. A incubar à temperatura ambiente no escuro, à procura de desenvolvimento de cor roxa que cada ½ h. tempos de reação para visualização irá variar com base na sonda que está sendo desenvolvida.
   Nota: Em vez de visualização BM roxo, solução de desenvolvimento pode ser feita usando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) e nitro-azul de tetrazólio (NBT). Para obter instruções, consulte a tabela 1 .
7. Pare o desenvolvimento de cor pela transferência de slides para um mailer estéril slide novo com 18 mL de tampão Tris-EDTA (TE) por 5 min à temperatura ambiente, no escuro.
8. Despeje o tampão TE e adicionar 18 mL de água livre de RNase para o slide mailer e lavagem por 1 min, no escuro.
9. Retire as lâminas da água e seque-as ao redor das bordas do tecido. Adicionar o glicerol médio de montagem e coloque as lamelas. Armazene os slides a 4 ° C até fotos esteja prontas para ser levado.

Depois de completar este protocolo, identificação de células e tecidos que estão expressando a sonda RNA de interesse será alcançada. Os resultados representativos para este protocolo são para a AP-1, FosB e TNFR41. Estes resultados, publicados anteriormente por Traylor-Knowles et al ¹¹, sondas de mostrar a expressão espacial do RNA em corais adultos que foram expostos ao stress de calor. Dois exemplos de diferentes tipos de coloração são apresentados na Figura 1. Figura 1A é um exemplo de manchar o tecido difuso. A mancha é encontrada em todo o tecido, não só em células específicas. Aqui, a expressão de anti-sentido AP-1 é encontrada em toda a epiderme e a gastrodermis oral¹¹ (figura 1A). A coloração é difusa e não segregada para um tipo específico de célula. Para este tipo de mancha, é particularmente crítico para executar um controle de sentido ao mesmo tempo, como alguns dos resultados podem ser devido a coloração não específica.

O segundo tipo de coloração é uma célula específica, na qual a mancha só é encontrada em tipos de células específicas. Ambos FosB (figura 1B) e TNFR41 (Figura 1) mostrar este tipo de coloração. Ambas estas sondas foram utilizadas em amostras de tecido de corais adultos que tinham sido expostos a um estresse de calor¹¹. No antipainel sentido, coloração roxo é observado. TNFR41 foi expressa em diferentes tipos de cnidoblastos, uma família de tipos de células que só é encontrada dentro de cnidários (Figura 1). Especificamente, manchada que produzem a Microbase mastigophore organela (nematocistos) nematocytes e spirocytes que produzem spirocysts, todos encontrados dentro da epiderme de tecido coral. Nematocytes são também encontrados em outras camadas de tecido do coral, tais como o calicodermis; no entanto, devido o seccionamento realizados nesta amostra particular, essa informação não poderia ser reunida. FosB também manchado cnidoblastos e era específico para tanto spirocytes e nematocytes. Para ambas estas sondagens, o controle do sentido não mostrou nenhuma mancha, indicando que a mancha para a sonda em antiera sentido de fato específico. Estes são apenas dois tipos de resultados representativos (tecido difuso mancha e mancha célula específica) das técnicas de coloração que podem estar presentes com diferentes tipos de sondas. Devido a essa variabilidade, é fundamental usar um controle de sentido para determinar a coloração não específica.

Figura 1: resultado representativo do ISH que manchados células específicas. (A) no primeiro painel, controle de sentido para a sonda do AP-1 mostra que a pequena mancha está presente dentro do slide. No segundo painel, o antisonda sentido para AP-1 mostra que mancha com esta sonda é difusa por todo o tecido. A mancha é específica para o gastrodermis oral e epiderme. Com este tipo de mancha, é fundamental para executar um senso de controle para garantir que a coloração observada é específica. (B) um controle de sentido para a sonda FosB no primeiro painel mostra a pequena mancha presente. No segundo painel, a sonda antisenso para FosB mostra coloração específica para o spirocytes e nematocytes, com coloração difusa em toda a epiderme e oral gastrodermis. (C) no primeiro painel, o controle de sentido para a sonda TNFR 41 mostra que a pequena mancha está presente no slide. No segundo painel, a sonda antisenso para TNFR 41 mostra específica de coloração dentro do spirocytes, nematocytes e microblastic mastigophores. Abreviaturas: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), Microbase mastigophores (MM), contendo simbionte gastrodermal celular (SU). Esta figura foi reproduzida com permissão de¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: soluções para a realização de ações em situ hibridização. A tabela é uma lista das diferentes soluções estoque necessário para esse protocolo. Montantes totais são estimados para o desempenho de cerca de 2 utentes de slide. É aconselhável ajustar quantidades totais com base na quantidade de slides que estão sendo processadas.

O método descrito neste protocolo foi modificado do trabalho anterior em médicos e evolutiva do desenvolvimento pesquisa^8,9,10,12,17. Este protocolo incide sobre as nuances de uma hibridação in situ com uma sonda de anti-sentido RNA escavar-etiquetadas em corais adultos, que foram preservados e incorporados em parafina. Esse método pode ser facilmente transferido para amostras de organismos além de corais que também foram de parafina. Por último, esse método pode ser executado durante as fases de vida diferentes de corais (e.g., larva) ou em culturas de células, mas o protocolo exato pode ser diferente, desde que esses tipos de amostras nem sempre são de parafina^5,6 .

Existem vários passos críticos no presente protocolo, incluindo o tratamento de proteinase K, hibridização da sonda e desenvolvimento de cor da sonda. Durante o tratamento de proteinase K, o tempo é muito importante. Se o tratamento é mais do que sugeriu, tecidos podem tornar-se degradados e danificados. Além disso, a parada da reação de proteinase K deve ser realizada no ponto especificado em tempo integral. Também é fundamental para manter a amostra a uma temperatura constante de hibridação, como redução da temperatura pode causar inespecificas da sonda e complicar os resultados. Quando lavar a sonda, é importante tomar cada slide do forno de hibridização, uma em uma hora, ao invés de uma só vez, para garantir que os slides não cruzar com a sonda em uma baixa temperatura. Além disso, lavagem completa dos slides após a hibridização da sonda ajudará a evitar inespecificas. Por último, desenvolvimento de cor da sonda é uma das etapas mais críticas ainda subjetivas deste processo. O desenvolvimento de cor pode ser facilmente exagerado ou parou cedo demais. Esta etapa exige paciência e vigilância para garantir que esse excesso de coloração dos slides não ocorre.

Este protocolo de resolução de problemas pode ser um processo difícil devido ao número de etapas envolvidas. Se o protocolo produz resultados negativos, então é melhor começar examinando a sonda para certificar-se que é o antisenso (e não o sentido) sonda. Além disso, se as soluções são velhas, vale refazer ou substituí-los, então eles são frescos, ao realizar este protocolo. Modificações, como os comprimentos de hibridização e bloqueio, podem ser implementadas para aumentar as chances de hibridização da sonda ou reduzir quantidades de fundo e mancha não específica. Devido ao elevado número de etapas neste protocolo, pode ser fácil perder o controle; Portanto, é importante manter-se organizado e controlar quais partes do protocolo foram concluídas. Além disso, é fundamental para garantir que nenhuma etapa é ignorada, e que o tempo não é cortado durante a incubação do e lavagens. Uma boa regra de ouro é para permitir mais tempo ao invés de lavagens mais curtas para garantir que todos os slides são bem limpa.

A maior limitação deste método é que os resultados não são quantificáveis. Este é um método qualitativo que, em conjunto com outros métodos, como a histologia, transcriptomics e proteômica, é muito informativo. Devido às variações nos tempos de hibridação, bem como os tempos subjetivos durante a visualização, quantificar a intensidade da coloração não é facilmente realizado. É tentador dizer que uma sonda mais altamente expressa se mostra maior intensidade, mas devido às variações no presente protocolo (por exemplo, a quantidade de tempo permitido para o desenvolvimento de cor), não é possível determinar quantidades de expressão do gene.

Essa técnica não é um novo método em biologia; no entanto, é um não executada muitas vezes em corais adultos. O uso desse método em corais adultos é muito poderoso, porque ele Ancora dados da expressão do gene para um tecido ou uma célula digite¹¹. Transcriptomics e genômica tornaram-se populares e poderosas ferramentas em biologia coral; no entanto, estes métodos são geralmente feitos em homogenates do animal inteiro. Isto torna desafiador para identificar quais partes do coral estão expressando genes de interesse e, portanto, mais desafiador de compreender os mecanismos reais. Através do uso de ISH juntamente com dados da expressão do gene, é possível uma abordagem mais holística para onde e em que medida os genes são expressos. Isso vai ajudar muito na compreensão dos mecanismos responsáveis por vias de resposta diferente do stress em corais adultos.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho foi financiado pelo prêmio nenhum. OCE-1323652 através da no.1012629 nacional Science Foundation oceano ciência Postdoctoral Fellowship e prêmio da Burroughs Wellcome fundo pós-doutorado programa de enriquecimento.