In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

L'obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.

I coralli sono invertebrati oceano importanti che sono critici per la salute generale dell'oceano così come la salute umana. Tuttavia, a causa di impatti antropici come aumento delle temperature dell'oceano e l'acidificazione degli oceani, coralli sono sempre più minacciati. Per affrontare queste sfide, i progressi nella biologia cellulare e molecolare hanno dimostrato di essere fondamentale per la diagnosi della salute dei coralli. Modificare alcune delle tecniche comunemente utilizzate in medicina umana potrebbe migliorare notevolmente la capacità dei ricercatori di trattare e salvare i coralli. Per risolvere questo problema, un protocollo per l'ibridazione in situ utilizzato principalmente in medicina umana e biologia inerente allo sviluppo evolutiva è stato adattato per l'uso in adulti Coralli sotto stress.

Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda RNA in tessuto adulto corallo che è stato incastonato in paraffina e sezionato su vetrini. Questo metodo si concentra sulla rimozione della paraffina e reidratazione del campione, il pretrattamento del campione per garantire permeabilità del campione, pre-l'ibridazione incubazione, ibridazione della sonda RNA e la visualizzazione della sonda RNA. Si tratta di un metodo potente quando si utilizza organismi non-modello per scoprire dove sono espressi geni specifici, e il protocollo può essere facilmente adattato per altri organismi non-modello. Tuttavia, il metodo è limitato in quanto è soprattutto qualitativa, perché espressione intensità può variare a seconda della quantità di tempo utilizzata durante il punto di visualizzazione e la concentrazione della sonda. Inoltre, pazienza è necessaria, in quanto questo protocollo può richiedere fino a 5 giorni (e in molti casi, più a lungo) a seconda della sonda viene utilizzata. Infine, una colorazione di fondo non specifico è comune, ma questa limitazione può essere superata.

Coralli sono costruttori di ecosistema critico e importante per la biodiversità nell'oceano e salute umana^1,2,3. Sono minacciata a causa del cambiamento climatico e altri fattori di stress antropogenici, e molte specie di corallo sono considerate in pericolo critico. Così, c'è un forte bisogno di strumenti molecolari e cellulari per diagnosticare Coralli sotto stress. Inoltre, là poco è capito circa dove i geni sono espressi all'interno di tessuto adulto corallo e quindi poca comprensione delle funzioni di questi geni. Per risolvere questo problema, abbiamo adattato il in situ (ISH) protocollo di ibridazione, comunemente utilizzato in medicina umana e biologia evolutiva dello sviluppo, per l'uso su campioni di tessuto paraffina-incastonato di coralli adulti. Questa tecnica è più potente quando viene utilizzato su Coralli adulti che hanno subito un evento stressante come l'esposizione allo stress da calore. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata su una vasta gamma di tessuti e fasi della vita di coralli e non è limitata al solo calore-sollecitato coralli^4,6,7. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata su tessuti o cellule di qualsiasi metazoi finché sono disponibili informazioni di sequenza di cDNA.

Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare le sonde del RNA all'interno di tessuto adulto corallo che è stata conservata e inclusi in paraffina e sezionati sui vetrini. Questo metodo è un potente strumento di diagnostica che permette di visualizzare degli acidi nucleici all'interno di tessuto adulto corallo. Inizialmente questo metodo è stato sviluppato per la diagnostica medica, e da allora è diventato uno strumento popolare in campi come la biologia dello sviluppo e biologia inerente allo sviluppo evolutiva^8,9,10. ISH è anche un metodo critico, specialmente in sistemi non-modello, quando genomica e trascrittomica dati di sequenza sono disponibili ma pattern di espressione genica spaziale sono sconosciuti. Per lavoro diagnostico in sistemi non-modello, questa tecnica è potente perché può indicare quali cellule e tessuti esprimono un gene di interesse e possono portare a ulteriori approcci terapeutici mirati^{8,9,10, 11,12}. Infine, questa tecnica è più potente quando accoppiato con espressione genica quantitativa dei dati¹¹e qualitativa.

L'approccio descritto in questo articolo sarà di interesse per i ricercatori che hanno già progettato un digossigenina (DIG)-scritta sonda RNA (sonde sia il senso e antisenso) e sono ora pronti per eseguire in situ di ibridazione delle sonde ad un campione. Per eseguire questo metodo, due sezioni di serie di un tessuto paraffina corallo saranno necessari per ogni sonda in fase di test. Una sezione sarà utilizzata per la sonda di senso e l'altra per la sonda antisenso. La sonda di senso sarà un controllo per indicare il legame non specifico. Se si osserva una colorazione della sonda di senso, quindi la sonda antisenso non è specifica per il RNA di interesse. Sonde possono essere progettati per qualsiasi gene espresso. In questo protocollo, alcuni esempi sono utilizzati che precedentemente sono stati trovati per essere espressi durante lo stress da calore in Coralli: omologo FBJ osteosarcoma murino oncogene virale B (Fos-B), proteina dell'attivatore (AP1) e fattore di necrosi tumorale recettore 41 (TNFR 41)¹¹. ISH usando le sonde Scavare-contrassegnate RNA è preferito rispetto all'uso di sonde radioattive perché la loro gestione è molto più sicuro¹⁰. Inoltre, questa tecnica è altamente sensibile e può essere eseguita su una vasta gamma di tessuti ed embrioni oltre ha sottolineato calore adulto coralli^13,14,15,16.

1. rimozione di paraffina

Attenzione: Eseguire la procedura seguente sotto cappa aspirante.

1. Sparaffinatura le diapositive di paraffina sottile-sezionato con xilene 100% sotto il cofano in barattoli di vetro Coplin per 10 min. Non usare barattoli di plastica Coplin, come xilene si scioglie la plastica. Sterilizzare i barattoli di Coplin in autoclave prima dell'uso.
2. Preparare quattro barattoli di Coplin di vetro sterili con il seguente: etanolo al 100%, 80% etanolo, etanolo al 70% e 60% di etanolo. Diluire l'etanolo con acqua RNAsi-libera.
   1. Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 100% e metterli a bagno per 10 min. Dopo 10 min, svuotare la vaschetta di Coplin vetro e sostituire con etanolo al 100% nuove. Immergere i vetrini ancora per 10 min.
   2. Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo di 80% per 1 min.
   3. Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 70% per 1 min.
   4. Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 60% per 1 min.

2. pretrattamento di diapositive per la preparazione della sonda del RNA ibridazione

1. Eseguire i seguenti lavaggi a temperatura ambiente, se non specificato diversamente. Eseguire lavaggi a temperatura ambiente su agitatore orbitale a bassa velocità. Utilizzare buste sterili diapositiva con spazio per fino a cinque scivoli per il lavaggio dei vetrini.
2. Trasferire i vetrini per un mailer di diapositiva sterile con 18 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS). Lavare per 5 min a temperatura ambiente.
3. Versare il PBS 1X e immediatamente trattare il tessuto sulle diapositive con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda del tessuto. Aggiungere circa 18 mL di soluzione di proteinasi K per il mailer di diapositiva (Vedi tabella 1 per la concentrazione della soluzione di lavoro). Incubare a 37 ° C per 15 min. Non ti agitare.
   1. Mentre le diapositive sono incubando, preparare il prehybridization buffer (Buffer di Prehybe). Posizionare il Buffer di Prehybe in un bagno di acqua bollente per 10 minuti, poi raffreddare su un bagno di ghiaccio per 5 min. Per una ricetta di Prehybe Buffer, vedere tabella 1.
   2. Interrompere la digestione della reazione proteinasi K versando la soluzione di proteinasi K e immediatamente aggiungere 18 mL di soluzione di glicina-PBS 0,2% per il mailer di diapositiva. Lasciate che il mailer di diapositiva riposare a temperatura ambiente per 5 min.
   3. Versare la soluzione di glicina-PBS 0,2% e aggiungere 18 mL di soluzione di citrato di sodio Salina (SSC) 2 x mailer ogni diapositiva. Lavare i vetrini in 2 x SSC per 10 min a temperatura ambiente con agitazione a 100-150 giri/min.

3. prehybridization di diapositive in preparazione per l'ibridazione della sonda del RNA

1. Mentre le diapositive sono essere lavate con 2 x SSC, ottenere un nuovo mailer diapositiva sterile e messo circa 18 mL di Buffer di Prehybe nel mailer di diapositiva. Inserire il mailer di diapositiva in forno a temperatura di ibridazione ibridazione.
   Nota: La temperatura di ibridazione dipenderà la sonda utilizzata ma solitamente varia da 50-60 ° C.
2. Una volta completato il lavaggio x SSC 2, versare il 2 x SSC e posto le diapositive all'interno il mailer di diapositiva nel Buffer di Prehybe al forno di ibridazione per 1 h.

4. l'ibridazione della sonda RNA

1. Mentre le diapositive sono incubando con il Buffer di Prehybe al forno di ibridazione, preparare la soluzione di ibridazione-sonda.
   1. Diluire ogni sonda in tampone di ibridazione (0,5 µ l di sonda con 24,5 µ l di tampone di ibridazione).
      Nota: La ricetta per il tampone di ibridazione si trova nella tabella 1. Un esempio di preparazione della sonda e concentrazioni può essere trovato in Traylor-Knowles et al. ¹¹.
   2. Posizionare la sonda diluita su un blocco di calore 86-90 ° C per 12 min, poi raffreddare per 1 min sul ghiaccio.
2. Rimuovere il mailer di diapositiva dal forno ibridazione e individualmente Togliere i vetrini dal mailer di diapositiva utilizzando pinzette sterili. Posare le diapositive su un asciugamano di carta e pulire con cura tampone in eccesso Prehybe intorno i campioni di tessuto. Fare attenzione a non toccare i campioni e lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione dei campioni di tessuto.
3. Circondano il tessuto con una penna PAP. 25 µ l di soluzione della sonda diluita con una pipetta e riguardano il campione con un vetrino coprioggetto di plastica.
   1. Porre i campioni nella diapositiva umidità camera con 4x SSC + 50% formammide soluzione nella parte inferiore della camera.
   2. Una volta che le sonde sono state aggiunte a tutte le diapositive, è possibile posizionare la camera di umidità diapositiva nel forno ibridazione per almeno 24 ore ad una temperatura di ibridazione di 50-60 ° C. Il tempo di incubazione può variare a seconda della concentrazione della sonda ma dovrebbe essere per un minimo di 24 ore.
4. Dopo l'incubazione overnight con le sonde diluite, è necessario rimuovere la camera di umidità diapositiva dal forno ibridazione.
   1. Rimuovere le lamelle da ciascuna delle diapositive, facendo attenzione a non spostare il tessuto. In una pipetta 1000 µ l, 1000 µ l di soluzione di x SSC 2 e lavare delicatamente il vetrino.
   2. Porre il vetrino in un mailer di diapositiva sterile con 18 mL di soluzione di x SSC 2 per 5 min a temperatura ambiente. Versare la soluzione e sostituirlo con 18 mL di fresco 2 x SSC. Ripetere l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   3. Versare la soluzione di x SSC 2. Aggiungere 18 mL di 1 x SSC soluzione e lavare per 5 min a temperatura ambiente. Versare la soluzione di x SSC 1 e sostituirlo con 18 mL di fresco 1 x SSC. Ripetere l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   4. Versare il 1 x SSC. Aggiungere 18 mL di 0.5 x SSC e lavare per 10 min a 42 ° C senza agitazione. Riversare il 0,5 x SSC e Sostituisci con 18 mL di 0.5 fresco x SSC. Lavare nuovamente per 10 min a 42 ° C senza agitazione.

5. visualizzazione della sonda RNA

Nota: Per visualizzare la sonda, viola BM verrà utilizzato durante il processo di sviluppo. Tuttavia, prima di questo passaggio, alcuni lavaggi sono necessari per preparare i campioni per la colorazione.

1. Lavare i vetrini con 18 mL di buffer di fosfatasi alcalina (AP-buffer) senza MgCl₂ per 1 min. Pour il buffer di AP senza MgCl₂e aggiungere 18 mL di tampone bloccante di Boehringer Mannheim 1x diluito con il tampone acido maleico. Incubare per almeno 1 h a temperatura ambiente in un mailer di diapositiva con agitazione delicata.
   Nota: Il tampone bloccante Boehringer Mannheim e acido maleico buffer utilizzato erano premade e acquistati nel lavaggio DIG e blocco Buffer Set (disponibile in commercio).
   1. In alternativa, può essere eseguita incubazione overnight a 4 ° C. Un periodo di blocco più diminuirà l'aspetto del legame non specifico.
2. Preparare i 20 mL di diluito frammenti Fab di DIG anti-digossigenina-AP (anticorpo anti-DIG = 2 µ l di anticorpo anti-DIG + 20 mL 1 x tampone bloccante Boehringer Mannheim). Questo è sufficiente per l'uso in 1 mailer di scivolo di plastica. Più di questa soluzione deve essere preparata se più di una slide mailer è utilizzabile.
3. Aggiungere l'anticorpo anti-scavare un nuovo mailer diapositiva sterile e trasferire i vetrini per il mailer vetrino con la soluzione di anticorpo anti-DIG. Incubare a temperatura ambiente per 3 ore con agitazione delicata.
4. Dopo l'incubazione, versare l'anticorpo anti-DIG e lavare i vetrini in mailer diapositiva con 18 mL di Buffer di AP senza MgCl₂ per 5 min con agitazione delicata.
5. Versare il buffer di AP senza MgCl₂ e aggiungere 18 mL di Buffer di AP. Lavare per 5 minuti con agitazione delicata. Dopo l'incubazione di 5 minuti, versare il AP-tampone, sostituirlo con 18 mL di fresco AP-Buffer e lavare per 5 minuti con agitazione delicata.
6. Nel buio, versare il buffer di AP e aggiungere 18 mL di BM viola per il mailer di diapositiva. Incubare i vetrini a temperatura ambiente al buio, il controllo per lo sviluppo di colore viola che ogni ½ h. tempi di reazione per visualizzazione variano basato sulla sonda che è in fase di sviluppo.
   Nota: Invece di visualizzazione BM viola, soluzione di sviluppo può essere fatto utilizzando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) e nitro blu di tetrazolio (NBT). Per istruzioni, vedere la tabella 1 .
7. Interrompere lo sviluppo del colore trasferendo le diapositive a un mailer nuova diapositiva sterile con 18 mL di tampone Tris-EDTA (TE) per 5 min a temperatura ambiente al buio.
8. Versare il tampone TE e aggiungere 18 mL di acqua RNAsi-libera la diapositiva mailer e lavaggio per 1 min, al buio.
9. Rimuovere le diapositive dall'acqua e asciugarle intorno ai bordi del tessuto. Aggiungere glicerolo mezzo di montaggio e inserire i coprioggetti. Memorizzare le diapositive a 4 ° C fino a quando le immagini sono pronte per essere adottate.

Dopo aver completato questo protocollo, si otterrà l'identificazione di cellule e tessuti che stanno esprimendo la sonda RNA di interesse. I risultati rappresentativi per questo protocollo sono per AP-1, FosB e TNFR41. Questi risultati, precedentemente pubblicati da Traylor-Knowles et al. ¹¹, Visualizza espressione spaziale di RNA sonde sui coralli adulti che sono stati esposti allo stress da calore. Due esempi di diversi tipi di colorazione sono presentati nella Figura 1. Figura 1A è un esempio di colorazione tissutale diffusa. La macchia si trova in tutto il tessuto, non solo in celle specifiche. Qui, l'espressione di anti-senso di AP-1 si trova in tutta l'epidermide e l' orale gastroderma¹¹ (Figura 1A). La colorazione è diffuso e non segregata per un tipo specifico delle cellule. Per questo tipo di colorazione, è particolarmente critica per eseguire un controllo di senso allo stesso tempo, come alcuni dei risultati può essere a causa della colorazione aspecifica.

Il secondo tipo di colorazione è cellula-specifico, in cui la macchia si trova solo in tipi cellulari specifici. Sia FosB (Figura 1B) e TNFR41 (Figura 1) Mostra questo tipo di colorazione. Entrambe queste sonde sono state utilizzate sui campioni di tessuto dei coralli adulti che erano stati esposti a un calore stress¹¹. Nel pannello anti-senso, si osserva una colorazione viola. TNFR41 è stato espresso in diversi tipi di cnidocisti, una famiglia di tipi di cellule che si trovata solo all'interno di cnidari (Figura 1). In particolare, esso macchiato nematociti che producono microbasic mastigophore organello (nematocisti) e spirocytes che producono spirocysts, tutti trovati all'interno dell'epidermide del tessuto corallo. Nematociti si trovano anche in altri strati di tessuto del corallo, come la calicodermis; Tuttavia, dovuto il sezionamento eseguita su questo particolare esempio, tali informazioni potrebbero non essere raccolti. FosB anche macchiato cnidocisti ed era specifici spirocytes e nematociti. Per entrambe queste sonde, il controllo di senso ha mostrato nessuna colorazione, che indica che la colorazione per la sonda anti-senso era infatti specifica. Questi sono solo due tipi di risultati rappresentativi (macchiatura diffuso del tessuto e cellula-specifico di colorazione) delle tecniche di colorazione che possono essere presenti con diversi tipi di sonde. A causa di questa variabilità, è fondamentale utilizzare un controllo di senso per determinare colorazione aspecifica.

Figura 1: risultato rappresentativo di ISH che ha macchiato le cellule specifiche. (A) nel primo pannello, controllo di senso per la sonda di AP-1 dimostra che la colorazione poco è presente all'interno della diapositiva. Nel secondo pannello, la sonda anti-senso per AP-1 dimostra che la macchiatura con questa sonda è diffusa in tutto il tessuto. La macchia è specifica per l'orale gastroderma e dell'epidermide. Con questo tipo di colorazione, è fondamentale per eseguire un controllo di senso per garantire che la colorazione osservata è specifica. (B) un controllo di senso per la sonda di FosB nel primo pannello mostra colorazione poco presente. Nel secondo pannello, la sonda anti-senso per FosB Mostra colorazione specifica per il spirocytes e nematociti, con la macchiatura diffusa in tutta l'epidermide e orale gastroderma. (C) nel primo pannello, il controllo di senso per la sonda di TNFR 41 dimostra che la colorazione poco è presente nella diapositiva. Nel secondo pannello, la sonda anti-senso per TNFR 41 Mostra specifica colorazione all'interno del spirocytes, nematociti e microblastic mastigophores. Abbreviazioni: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocita (NE), microbasic mastigophores (MM), contenenti simbionte gastrodermal cell (SU). Questa figura è stata riprodotta con permesso¹¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: soluzioni per l'esecuzione di riserva in situ ibridazione. La tabella è un elenco delle diverse soluzioni stock necessario per questo protocollo. Importi totali sono stimati per le prestazioni di circa 2 buste di diapositiva. Si consiglia di regolare la quantità totale dipende dalla quantità di diapositive che vengono elaborati.

Il metodo descritto in questo protocollo è stato modificato dal lavoro precedente in ricerca inerente allo sviluppo evolutivo medico^8,9,10,12,17. Questo protocollo si concentra sulle sfumature di un'ibridazione in situ con una sonda di scavare-contrassegnate RNA anti-senso sui coralli adulti, che sono stati conservati e inclusi in paraffina. Questo metodo può essere facilmente trasferito ai campioni di organismi di là di coralli che sono stati anche paraffina-incastonato. Infine, questo metodo può essere eseguito durante diverse fasi della vita di coralli (ad es., larva) o all'interno di colture cellulari, ma il protocollo esatto può variare poiché tali tipi di campioni non sono sempre paraffina^5,6 .

Ci sono diversi passaggi critici nel presente protocollo, compreso il trattamento di proteinasi K, ibridazione della sonda e lo sviluppo del colore della sonda. Durante il trattamento di proteinasi K, la tempistica è molto importante. Se il trattamento è più lungo rispetto a quanto suggerito, i tessuti possono diventare degradati e danneggiati. Inoltre, l'arresto della reazione proteinasi K deve essere eseguita al tempo pieno punto specificato. È inoltre fondamentale per mantenere il campione ad una temperatura costante di ibridazione, come abbassamento della temperatura può causare legame non specifico della sonda e complicare risultati. Quando si lava la sonda, è importante prendere ogni diapositiva fuori dal forno di ibridazione uno alla volta, piuttosto che tutto in una volta, per garantire che le diapositive non ibridato con la sonda a bassa temperatura. Inoltre, lavaggio accurato delle diapositive dopo l'ibridazione della sonda aiuta a prevenire il legame non specifico. Infine, lo sviluppo del colore della sonda è uno dei passaggi più critici ancora soggettivi di questo processo. Lo sviluppo del colore può essere facilmente esagerato o smesso troppo presto. Questo passaggio richiede pazienza e vigilanza per garantire che over-macchiatura delle diapositive non si verifica.

Risoluzione dei problemi di questo protocollo può essere un processo scoraggiante a causa del numero di passaggi necessari. Se il protocollo produce risultati negativi, allora è meglio iniziare esaminando la sonda per assicurarsi che è l'anti-senso (e non il senso) sonda. Inoltre, se le soluzioni sono vecchi, vale la pena di rifacimento o la loro sostituzione, quindi sono freschi durante l'esecuzione di questo protocollo. Modifiche, come le lunghezze di ibridazione e di blocco, possono essere implementate per aumentare le possibilità di ibridazione della sonda o riducendo la quantità di sfondo e colorazione aspecifica. Dovuto l'alto numero di punti in questo protocollo, può essere facile perdere traccia; Pertanto, è importante rimanere organizzati e tenere traccia di quali parti del protocollo sono state completate. Inoltre, è fondamentale per garantire che nessun passaggi vengono ignorati, e che il tempo non è stato abbattuto durante le incubazioni e lavaggi. Una buona regola empirica è per consentire più lungo piuttosto che lavaggi più brevi per garantire che tutte le diapositive vengono pulite accuratamente.

La principale limitazione di questo metodo è che i risultati non sono quantificabili. Si tratta di un metodo qualitativo che, di concerto con altri metodi quali l'istologia, trascrittomica e proteomica, è molto istruttivo. A causa di variazioni nei tempi di ibridazione, nonché tempi soggettivi durante la visualizzazione, quantificare l'intensità della colorazione non è facilmente realizzabile. Si è tentati di dire che una sonda più altamente è espresso se dimostra una maggiore intensità, ma a causa delle variazioni in questo protocollo (ad esempio la quantità di tempo consentito per lo sviluppo del colore), non è possibile determinare la quantità di espressione genica.

Questa tecnica non è un nuovo metodo in biologia; Tuttavia, è uno non eseguita molto spesso sui coralli adulti. L'utilizzo di questo metodo sui coralli adulti è molto potente perché e ' ancore dati di espressione genica di un tessuto o una cella di tipo¹¹. Genomica e trascrittomica è diventati popolari e potenti strumenti in corallo biologia; Tuttavia, questi metodi sono generalmente fatto in omogeneati dell'intero animale. Questo rende difficile identificare quali parti del corallo esprimono i geni di interesse e così più difficile capire i reali meccanismi. Attraverso l'uso di ISH insieme a dati di espressione genica, è possibile un approccio più olistico per dove e in quale misura i geni sono espressi. Questo sarà molto utile nella comprensione dei meccanismi responsabili per vie di risposta differenti di sforzo nei coralli adulti.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo lavoro è stato finanziato dal premio no. OCE-1323652 attraverso la National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship e il premio no.1012629 dal programma di arricchimento Postdoctoral di Burroughs Wellcome fondo.