Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation

Nanomateriais fornecem mecanismos versátil de entrega terapêutico controlado para tanto a ciência básica e aplicações de translação, mas sua fabricação muitas vezes requer perícia que não está disponível em laboratórios mais biomédicos. Aqui, apresentamos os protocolos para a fabricação escalável e carregamento terapêutico de diversas nanocarriers Self montado usando flash nanoprecipitation.

Nanomateriais apresentam uma ampla gama de opções para personalizar a entrega controlada de cargas moleculares simples e combinadas para aplicações terapêuticas e de imagem. Esta especificidade aumentada pode ter importantes implicações clínicas, incluindo diminuição de efeitos colaterais e doses mais baixas, com maior potência. Além disso, o em situ direcionamento controlada modulação de subconjuntos de célula específica pode melhorar investigações in vitro e em vivo dos fenômenos biológicos básicos e sonda função CÉL. Infelizmente, a experiência necessária em nanoescala ciência, química e engenharia muitas vezes proibir laboratórios sem experiência nestas áreas de fabricação e personalização de nanomateriais como instrumentos para suas investigações ou veículos para seus estratégias terapêuticas. Aqui, nós fornecemos os protocolos para a síntese e escalável montagem de um sistema de copolímero versátil tóxicos bloco favorável à formação facile e carregamento dos veículos de nanoescala para aplicações biomédicas. Nanoprecipitation flash é apresentado como uma metodologia para fabricação rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) -bl-copolímeros de poli (sulfeto de propileno). Estes protocolos permitirá laboratórios com uma vasta gama de conhecimentos e recursos para facilmente e fabricar reproducibly nanocarreador avançados sistemas de entrega para suas aplicações. Processam de concepção e construção de um instrumento automatizado que emprega uma bomba de seringa de alta velocidade para facilitar o nanoprecipitation flash e para permitir maior controle sobre a homogeneidade, tamanho, morfologia e carregamento de polymersome nanocarriers é descrito.

Nanocarriers permitir a entrega controlada de carga pequena e macromolecular, incluindo entidades activas que, se não encapsulado, seria altamente degradável ou muito hidrofóbico para administração na vivo. Das morfologias nanocarreador regularmente fabricadas, poliméricas vesículas análogas aos lipossomas (também chamados polymersomes) oferecem a capacidade de carregar simultaneamente hidrofílico e hidrofóbico carga^1,2. Apesar de suas vantagens promissoras, polymersomes ainda são raros em aplicações clínicas devido, em parte, para vários desafios-chave em sua fabricação. Para uso clínico, formulações de polymersome precisam ser feitas em lotes em grande escala, estéril e consistentes.

Um número de técnicas pode ser usado para polymersomes forma de um copolímero de diblock, como poly(ethylene glycol) -bloco-poli (sulfeto de propileno) (PEG -bl- PPS), que incluem a dispersão solvente³, película fina reidratação^{1 , 4}, microfluídica ^5,6e hidratação direta⁷. Dispersão de solvente envolve tempos de incubação longa na presença de solventes orgânicos, que podem desnaturar algumas cargas bioativas, como proteínas. Reidratação de película fina não oferece controle sobre a polidispersividade do polymersomes formado, muitas vezes exigindo técnicas de extrusão caro e demorado para conseguir monodispersity aceitável. Além disso, ambos microfluids e hidratação direta são difíceis de escala para maiores volumes de produção. O nanocarreador diferentes métodos de fabricação, flash nanoprecipitation (FNP) oferece a capacidade de fazer em grande escala e reprodutíveis formulações^8,9,10. Enquanto FNP foi anteriormente reservado para a formulação de nanopartículas de núcleo sólido, nosso laboratório recentemente expandiu o uso da FNP para incluir a formação consistente de diversas PEG -bl- PPS nanostructure morfologias^{11, 12}, incluindo polymersomes¹¹ e bicontinuous nanoesferas¹². Descobrimos que a FNP foi capaz de formar monodisperso formulações de polymersomes sem a necessidade de extrusão, resultando em valores de índice de polidispersividade superior em comparação com não-extrudados polymersomes formada pela dispersão de reidratação e solvente de película fina ¹¹. Bicontinuous nanoesferas, com seus grandes domínios hidrofóbicos, não foram capazes de ser formado por reidratação de película fina, apesar de formando sob várias condições de solventes com FNP¹².

Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada para a síntese do PEG - copolímero de diblock - PPSblusada na formação de polymersome, o misturador de jatos (CIJ) do choque confinados usado para FNP, a FNP do protocolo em si e a implementação de um sistema automatizado para Reduza a variabilidade do usuário. Informações sobre como esterilizar o sistema suficiente para produzir formulações endotoxina-livre para uso na vivoe dados representativos sobre a caracterização de polymersomes formado pela FNP está incluído. Com esta informação, os leitores com interesse em utilizar polymersomes para in vitro e in vivo de trabalho será capazes de fabricar suas próprias formulações monodisperso estéril. Leitores com experiência em formulações nanocarreador e com expertise de síntese de polímero será capazes de testar rapidamente seus próprios sistemas de polímero usando FNP como uma alternativa potencial para suas técnicas de formulação atual. Além disso, os protocolos descritos neste documento podem ser usados como ferramentas educacionais para a formulação de nanocarriers nos cursos do laboratório de nanotecnologia.

1. síntese de Poly(ethylene glycol) -bloco-poli (sulfeto de propileno)-tiol

1. Metoxi-poly(ethylene glycol) mesilato de sintetizar (Mn: 750) (MeO-PEG₁₇-Ms, eu).
   1. Dissolva 10 g de MeO-PEG₁₇-OH em 200 mL de tolueno 100% dentro de um balão de fundo redondo de 3-pescoço (RBF) sob agitação magnética a 600 rpm.
   2. Conectar a RBF 3-pescoço a um aparelho de Dean-Stark, se ligado a um condensador, manter todo o sistema sob gás inerte, ou nitrogênio ou argônio.
   3. Coloque a RBF 3-pescoço em banho de óleo, calor a 165 ° C, agitando a 600 rpm.
   4. Remova vestígios de água e 100 mL de tolueno usando Destilação azeotrópica.
   5. Remover a RBF 3-pescoço de óleo, retire o aparelho de Dean-Stark, mantendo as condições de gás inerte e deixar arrefecer à temperatura ambiente.
   6. Adicione 5,6 mL de trietilamina 100% (3 molar EQ) e 300 mL de anidro 100% de tolueno para solução de -OH₁₇MeO-PEG, agitando a 600 rpm.
   7. Mover o pescoço-3 RBF para um banho de gelo, manter agitação a 600 rpm e as condições de gás inerte.
   8. Diluir a 3,1 mL de cloreto de methanesulfonyl de 100% (3 molar EQ) em 30 mL de tolueno de 100%, adicionar lentamente para a RBF 3-pescoço através de um funil de adição, agitando a 600 rpm.
   9. Agitar durante a noite a 600 rpm, à temperatura ambiente sob condições inertes.
   10. Filtro de solução através de um funil de Buchner embalado com terra de diatomáceas (consulte Tabela de materiais) para remover os sais.
   11. Remova o tolueno através de um evaporador rotativo com o banho de água situado a 40 ° C, rotação a 120 rpm e pressão regular entre 50-100 milibares.
   12. Re-dissolver o produto em 200 mL de diclorometano 100% (DCM) e filtrar através de um funil de Buchner embalado com terra de diatomáceas (ver Tabela de materiais).
   13. Remova o DCM através de um evaporador rotativo com o banho de água situado a 40 ° C, rotação a 120 rpm e pressão regular entre 450-600 milibares.
   14. Com moderação re-dissolver o produto em 100% DCM e precipitar lentamente produto adicionando-gota a gota (através de uma pipeta Pasteur) a 500 mL de gelado 100% de éter dietílico. Manter agitação a 300 rpm.
   15. Decantar ou aspirar para remover o éter dietílico do produto precipitado, MeO-PEG₁₇- mesilato e a loja durante a noite num exsicador de vácuo para secar completamente.
   16. Usar o produto imediatamente, ou armazenar sob gás inerte a-20 º C durante vários meses.
2. Sintetiza metoxi-poly(ethylene glycol) tioacetato (₁₇-TA MeO-PEG, II).
   1. Dissolver 5 g de MeO-PEG₁₇-Ms (I) em 200 mL de 100% anidro dimetilformamida (DMF) em um 3-pescoço RBF, agitar a 600 rpm, à temperatura ambiente sob gás inerte.
   2. Adicione 2,5 g de carbonato de potássio de 100% (3 molar EQ) para agitar a solução.
      Nota: carbonato de potássio não completamente se dissolverá em solução.
   3. Diluir a 1,3 mL de ácido tioacético de 100% (3 molar EQ) em 100 mL de 100% anidro DMF e adicionar gota a gota a solução através de um funil de adição.
      Nota: O ácido tioacético tem um odor forte e desagradável. Deve ter cuidado para manter todos os objetos sujos dentro da coifa química durante a noite, antes da eliminação ou limpeza.
   4. Agite vigorosamente (rpm 600 ou maior) durante a noite em temperatura ambiente.
      Nota: A formação de sal facilmente pode interromper a agitação desta solução. Deve ter cuidado para manter a agitação durante a noite.
   5. Filtro de solução através de um funil de Buchner embalado com terra de diatomáceas (ver Tabela de materiais).
   6. Remova o DMF através de um evaporador rotativo com o banho de água situado a 60 ° C, rotação a 120 rpm e pressão regular entre 5-15 milibares.
   7. Dissolver o produto em 100 mL de 100% tetrahidrofurano (THF) e adicionar uma coluna embalada com alumina neutra para remover impurezas coloridas de vermelho/laranja.
   8. Remova o THF através de um evaporador rotativo com o banho de água situado a 40 ° C, rotação a 120 rpm e pressão regular entre 200-300 milibares.
   9. Com moderação, re-dissolva o produto em 100% do DCM. Se um sal precipitado forma, solução de filtro por 6 papel de filtro tamanho de μm de poro, usando um funil de Buchner.
   10. Precipitar lentamente o produto adicionando gota a gota através de pipeta Pasteur para 500 mL de gelado 100% de éter dietílico, agitando a 300 rpm. Éter dietílico pode precisar ser mais frio de-20 ° C em um congelador de explosão durante várias horas se precipitado não teve fora da solução a 4 ° C.
   11. Decantar ou Aspire para retirar produto precipitado, MeO-PEG17-tioacetato éter dietílico. Armazenar o produto durante a noite num exsicador de vácuo e posteriormente sob gás inerte a-20 ° C.
3. Sintetizar diblock copolímero poly(ethylene glycol) -bloco -poly(propylene sulfide)-tiol (PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, III).
   1. Dissolver o MeO-PEG₁₇-TA (II) em 10 mL de 100% anidro DMF dentro de um frasco Schlenk sob argônio, mexendo a 400 rpm em água à temperatura ambiente.
   2. Adicione 1,1 molar eq de metóxido de sódio (solução de 0,5 M em metanol), permitir a agitar a 400 rpm por 5 minutos.
   3. Adicione 35 eq molar de sulfeto de propileno de 100%, rapidamente, à solução. Permita a agitar a 400 rpm por 10 minutos.
   4. Adicionar 10 eq molar de 100% de ácido acético glacial, permitir a agitar a 400 rpm por 5 minutos.
   5. Remova o DMF através de um evaporador rotativo com o banho de água situado a 60 ° C, rotação a 120 rpm e pressão regular entre 5-15 milibares.
   6. Re-dissolver o produto com moderação em 100% do DCM, precipitar em 80 mL de metanol 100%, divididos entre dois tubos de centrifuga conico de 50 mL.
   7. Cónicos tubos de centrifugação a 7500 x g, durante 5 minutos a 4 ° C. Aspire o sobrenadante afastado.
   8. Produto de loja, PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, durante a noite num exsicador de vácuo e posteriormente sob gás inerte a-20 ° C.

2. montar PEG -bl -PPS Nanocarriers através de Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

1. (Opcional) Esterilize o misturador de jatos (CIJ) confinados do choque.
   1. Dentro de uma câmara de segurança biológica (CSB), mergulhe o misturador com todas as peças desmontadas dentro de 0.1 M NaOH durante a noite.
   2. Remonte o misturador CIJ e fluir através de água livre de endotoxinas utilizando seringas luer-lock.
   3. Testar o pH da água e continuam a fluxo de água através de até pH registos como neutro.
2. Dissolver o PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH polímero e carga hidrofóbica em THF (solução de choque 1).
   1. Pesar 20 mg de PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH em um tubo de 1,5 mL.
   2. Adicionar corantes hidrofóbicos (por exemplo,DiI, ICG), drogas (por exemplo,rapamicina), ou outra carga.
      Nota: A carga pode ser seca, ou dissolvido em um solvente miscível com água, de preferência THF. Se a carga é insolúvel em THF ou DMF, outro miscível com água solvente pode ser utilizado, mas com moderação, como o polímero é improvável que seja solúvel. A quantidade de carga que pode ser carregada é dependente sobre as propriedades da carga em si (por exemplo, o peso molecular, a hidrofobicidade, considerações estéricos) e devem ser exploradas em uma base caso-a-caso^11,12.
   3. Adicionar 500 µ l de 100% THF ao polímero e carga, vórtice vigorosamente para dissolver.
3. Dissolva a carga hidrofílica em tampão aquosa (solução de choque 2). Por isso, dissolva hidrofílica carga para ser carregado dentro de vesículas de polímero em 500 µ l de um tampão aquosa (por exemplo, tampão fosfato salino água pura, etc.), conforme necessário.
4. Adicione tampão ao reservatório.
   1. Adicione 2,5 mL de um tampão aquosa de escolha (por exemplo, 1 x solução salina tamponada fosfato) para um reservatório devidamente tamanho (por exemplo, um frasco de cintilação de vidro de 20 mL). Coloque o reservatório sob o misturador CIJ tal que a saída do misturador entra diretamente no reservatório.
5. Carregar soluções do choque em plástico seringas descartáveis de 1ml separado.
6. Afectem soluções uns contra os outros para formar nanoestruturas e carregá-los com a carga simultaneamente.
   1. Inserir as seringas em adaptadores Luer-lock na parte superior da batedeira CIJ.
   2. Em um movimento único, suave e rápido, aperte as duas seringas simultaneamente e com igual força.
      Nota: Se realizar múltiplas impingements sequenciais, colete primeiro vazão em um reservatório vazio.
   3. (Opcional) Execute múltiplas impingements. Solução de nascente nanostructure Split entre duas seringas e repita os passos 2.6.1-2.6.2 até 4 vezes mais.
   4. Coletar o escoamento no reservatório cheio de tampão aquoso preparado em 2.4.1 e agitar suavemente para garantir a mistura.
7. Remova a carga descarregada e solvente orgânico.
   1. (Opção 1) Dialize nanocarreador formulação aquoso mesmo buffer usado para choque e no reservatório, usando o tubo de um apropriado MW corte pelo menos 24 horas, pelo menos 2 trocas de amortecedor. Isso pode ser realizada à temperatura ambiente.
      Nota: Nanocarriers será retida pela tubagem com um corte de MW < 100.000 kDa e potencialmente podem ser mantidas por cortes superiores também. Esta opção mantém a esterilidade quando executada em um BSC usando tampão estéril.
   2. (Opção 2) Filtre a formulação através de uma exclusão de tamanho ou dessalinização/tampão troca coluna (por exemplo, Sepharose 6B) usando 1X PBS como o tampão aquosa.
      Nota: Esta opção mantém a esterilidade quando executada em um BSC com uma coluna que foi completamente esterilizado.
   3. (Opção 3) Remova o solvente orgânico volátil usando vácuo dessecação durante a noite.
   4. (Opção 4) Formulação usando um sistema de filtração tangencial fluxo usando um filtro de kDa de 50-100 com um caudal de 20-60 mL/min por 15 minutos para 1 hora, dependendo do peso molecular da carga desencapsulado sendo purificada fora do filtro (maior carga levará mais tempo).
8. (Opcional) Concentre-se na formulação de nanocarreador.
   1. (Opção 1) Concentre-se usando um sistema concentrador de rotação (por exemplo, rotação coluna com MW corte > 100.000), usado como descrito pelo fabricante.
      Nota: Nanocarriers pode precisar ser resuspended entre spins e podem exigir um número de rotações para concentrar-se para baixo para o volume desejado. Concentração de rotação pode reduzir a esterilidade do nanocarreador formulações.
   2. (Opção 2) Reduza o volume usando vácuo dessecação.
      Nota: A alteração de Volume é difícil de controlar sob estas condições, e deve ter cuidado para manter a osmolaridade, antes e após a concentração.
9. Loja nanocarriers a 4 ° C durante semanas a meses. Antes de usar depois de armazenamento, brevemente nanocarreador formulações de vórtice.

3. caracterizar nanocarreador formulações

1. Medir a eficiência de carregamento
   1. Se a carga é fluorescente ou absorve fortemente em um determinado comprimento de onda fora 260-450 nm, medir a fluorescência/absorvância usando um spectrophotometer/fluorímetro.
      Nota: PEG -bl- PPS absorve fortemente de 260-310 nm e formulações polymersome absorvem de 310-450 nm, que pode complicar a quantificação da carga que absorve um comprimento de onda semelhantes.
   2. Se a carga absorve ao alcance 260-450 nm e é hidrofílica, perturbar o PEG -bl- PPS nanoestruturas adicionando 25 μL da formulação de um volume igual de 1% H₂O₂ ou 1% Triton X-100 e, posteriormente, separar e distinguir carga de absorvância de polímero através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizando uma coluna de exclusão de tamanho compatível com aquosa amortecedores (por exemplo, uma coluna de 6B Sepharose) ¹¹.
   3. Se a carga absorve ao alcance 260-450 nm e é solúvel em THF ou DMF, lyophilize a formulação por congelamento 100 μL em um tubo de plástico de 1,5 mL a-80 ° C durante a noite. Em seguida, coloque o tubo em um recipiente de vidro vácuo e lugar para um liofilizador. Permitir que 24 horas para liofilização ocorrer e posteriormente re-dissolver em 50 μL de DMF ou THF antes da separação e deteção através de HPLC.
2. Medida nanocarreador tamanho e morfologia
   1. Use Difusão dinâmica da luz (DLS)¹¹ ou nanopartículas análise¹³ de rastreamento para medir o tamanho do nanocarreador.
      Nota: Nanocarriers formada de PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH deverão ter um diâmetro médio entre 100 a 200 nm, com uma polidispersividade índice < 0.3.
   2. Determine a morfologia nanocarreador usando transmissão criogênico microscopia eletrônica (cryoTEM)¹⁴.
      Nota: Nanocarriers formada de PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH são esperados ser vesículas de polímero (polymersomes) com uma membrana polimérica claramente discernível e forma em grande parte esférica.
3. (Opcional) Formulações de teste de endotoxinas
   1. (Opção 1) Use um ensaio baseados em células a presença de endotoxina, por exemplo, RAW células azul ou azul TLR4 HEK células (ver Tabela de materiais), conforme descrito pelo fabricante, em um ensaio quantitativo ou qualitativo por lipopolissacarídeos (LPS)¹³ .
   2. (Opção 2) Use um kit de ensaio de¹⁵ Limulus métodos Lysate (LAL), conforme descrito pelo fabricante.

4. fabricação de uma bomba de seringa de alta velocidade para FNP

1. Fabrica componentes instrumento personalizado.
   Nota: modelos 3D para usinagem de todas as peças personalizadas são fornecidos em materiais suplementares.
   1. Chassi de instrumento multi-camadas de ¾" folhas acrílicas da máquina e montar (ver Arquivos complementares 1-5).
      Nota: O acrílico tem pobre resistência química. Se o instrumento é para ser usado com solventes ásperos, a base de um metal considerado adequado para a aplicação da máquina.
   2. Peças de impressão 3D com impresso com plástico polilactida (PLA).
      1. O aparelho de 2 partes de expulsão (SE) seringa de impressão: SE parte 1 - bloco traseiro FNP segurando a carruagem (Figura 5F, parte cinza; Arquivo complementar 6) e SE parte 2 - guia de expulsão frontal (Figura 5F, parte preta; Arquivo complementar 7). Ver arquivo complementar 2 para esquemas.
      2. Imprimir o aparelho sensor infravermelho (Figura 5I, caixas-pretas; Arquivos complementares, 8 e 9).
      3. (Opcional) Imprima a cinta de êmbolo de seringa dupla.
2. Aperte camadas de chassi instrumento juntamente com parafusos sextavados M5 e adicionar os pés de borracha na base.
3. Configure um computador de placa única com o sistema operacional Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) (baseado no Linux Debian).
   Nota: O Software para operar o instrumento está disponível mediante pedido. Código de fonte software instrumento disponível mediante solicitação. Ao receber o arquivo zipado, baixe todas as dependências especificadas no arquivo README. Este software inclui uma interface de usuário gráfica simples que permite o controle sobre a operação do instrumento, incluindo parâmetros de execução básicos (velocidade do motor, direção, etc.). Os usuários são incentivados a expandir sobre o código-fonte existente e módulos do programa personalizado sob medidos para usam em suas próprias experiências. Todo o software foi escrito usando Python 2.7.12 e não é atualmente compatível com Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy e módulos de multiprocessamento são utilizados. O arquivo Leiame contém informações detalhadas sobre a licença de distribuição de software.
4. Instale um 24 V escovado motor DC (Figura 5A) e slide de precisão (4.5"(114,3 mm) derrame; parafuso de 1,27 mm chumbo) (Figura 5).
   Nota: A 24 V DC motor usado aqui tem um RPM_máx, eu_máximae torque de plena carga de 4.252 RPM, 4,83 A e ~0.2 N * m, respectivamente.
   1. (Opcional) Coloque o enchimento sob o motor para amortecer a vibração durante a operação.
      Nota: É recomendável que uma almofada de borracha grossa de 2-3 mm é cortada para caber as dimensões do motor de transporte da base de instrumento.
   2. Monte o slide de precisão para a base do instrumento.
      1. Remova a haste roscada temporariamente.
      2. Montagem slide usando dois parafusos de máquina plana de #8-32.
   3. Motor da C.C. do monte de slide de precisão utilizando feixe metade do acoplamento (1-1/4" de comprimento) contendo 6/16" e 1/4" de diâmetro bores.
      Nota: Dependendo da espessura do acrílico usado para as camadas de base do instrumento da máquina, calços podem ser necessários para nivelar os eixos do motor e precisão de slide.
5. Monte a plataforma de expulsão de placas de metal e aparelho de canto em L (Figura 5). Montar a plataforma de metal base a plataforma deslizante (ligada à haste de rosca) com parafusos #6-32. Consulte o diagrama esquemático de slide de precisão fornecido pelo fabricante para obter detalhes sobre as restrições de montagem.
6. Monte a configuração de sistema de expulsão de seringa.
   1. Anexe blocos de travesseiro de movimento linear (plataformas de montagem + rolamento do movimento linear) para M8 cromada aço inoxidável trilhos (os trilhos de aço paralelos podem ser facilmente observados na Figura 5).
   2. Segmento de trilhos através de trilhos de guia/apoio e bloqueio do eixo linear. Use três guias por trilho. Monte SE as partes 1 e 2 para blocos de travesseiro com parafusos de máquina de M4.
   3. Vagamente Junte SE partes 1 e 2 com parafusos M8. Configure o espaço entre SE parte 1 e 2 com helicoidais molas de compressão cobrindo cada parafuso que estão presos entre dois interior buchas de nylon opostas (ver Figura 5F). Monte essas buchas na parte exterior do SE-parte 1 e parte SE 2.
7. Circuito de fio (veja a Figura 6 para o diagrama de fiação do núcleo)
   1. Conectem o I2C/SDA, 3.3 V, o controlador do motor e pinos de GND o computador de placa única.
   2. Terminais de motor DC para ligar as M - e M + blocos da placa controlador do motor. Conectar-se a 24 V, 2,5 A fonte de alimentação (Figura 5B) para os blocos V + e GND do controlador do motor (o controlador é envolto em uma caixa simples eletrônica no projeto final, veja a Figura 5 H).
   3. Conecte os pinos 3V3 e 5V do Conselho de controle de motor aos respectivos pinos no computador de placa única. Conecte pinos SDA e SCL do controlador do motor para os pinos 3 e 5 do computador de placa única, respectivamente.
      Nota: Comandos são emitidos ao motor DC a partir do computador de placa única, através de um controlador do motor. Velocidade do motor é controlada regulando a tensão entre os terminais do motor através da modulação de largura de pulso. Nesta configuração, a corrente máxima atravessa o motor de 24 V DC (plena carga amperagem: 4,83 A) é limitado a 2.5 uma por fonte de alimentação de 24 V. Recomenda-se que o circuito está ligado através de uma normalmente fechado (NC) paragem de emergência (Figura 5J). Isso fornece um meio para interromper o circuito para permitir uma operação básica de desligamento de emergência.
   4. Conecte dianteiro e traseiro de proximidade infravermelho sensores (sensores de distância digital, Figura 5I) aos pinos GPIO RPi 24 e 23, respectivamente.
      1. Fiação de sensor de rota através de condutas na base do instrumento.
         Nota: Os sensores de infravermelhos são sensores de movimento sem contato pausa-viga com uma gama de deteção de 2 a 10 cm.
      2. 4.7.4.2 encaixar os sensores de infravermelhos com fio no aparelho 3D-impresso sensor infravermelho (Figura 5I, caixas-pretas) e montar a base do instrumento. Quando corretamente definido para a chave, a face do sensor deve se projetar para fora do 14 x 7 mm retangular abertura do contraventamento.
         Nota: estas chaves de sensor podem ser temporariamente montados usando Velcro ou um adesivo (montagem temporária é útil para adequadamente ajustar e otimizar o posicionamento do sensor IR). Alternativamente, permanentemente monte guia pequenos furos na base do instrumento e fixando as chaves com parafusos M2.
   5. Conectar um display touchscreen LCD de 7" a 5V, GND e exibir os pinos da interface serial (DSI) do computador de placa única. O 7" RPi e LCD exibir montagem é mostrada na Figura 5.

5. fabricar Polymersomes através de FNP usando a bomba de seringa de alta velocidade sob medida

1. (Opção 1) Use o modo de execução automática.
   1. Selecione Auto executar do menu principal. O sistema solicitará que os usuários para permitir que o motor posicionar automaticamente a plataforma de expulsão de seringa para o início do slide precisão. Certifique-se de que o caminho à frente e atrás da placa de metal é claro antes de continuar.
   2. Carrega as seringas de plástico de 1 mL conforme descrito na seção 2.5 e montagem de seringas para os conectores Luer fêmeas do mixer CIJ. Carregar o misturador CIJ (com seringas anexadas) na abertura retangular do transporte posterior expulsão (ver Figura 5E).
   3. Definir a velocidade desejada do motor (unidades: rpm) usando o controle deslizante na GUI (ver nota abaixo para considerações importantes). A velocidade do motor ideal dependerá da bomba específica e instalação, mas deve garantir uma vazão de pelo menos 1 mL/s para as dimensões de canal misturador CIJ fornecidas aqui.
      Nota: Considere o seguinte ao taxa de fluxo de configuração. Na vertical manual FNP configuração, reagentes são expulsos das seringas a uma taxa de ~ 1 mL/s, mas pode ser altamente variável quando conduzida mão. Isto é simplesmente a taxa de fluxo através do cano de seringa, que é controlada pela taxa na qual o usuário avança o êmbolo da seringa. Note que a taxa de 1 mL/s é não referindo-se a taxa de fluxo de saída do bocal diâmetro menor. No acima especificado dimensões do canal, ~ 1 mL/s deve ser mantido para assegurar o número do Reynold um apropriado para mistura turbulenta¹⁰. Taxas de fluxo diferentes podem ser usadas desde que o diâmetro do canal é ajustado para manter o número do Reynold que suporta condições turbulentas. Os êmbolos da seringa são avançados por uma placa de metal perpendicular, que se move ao longo de uma lâmina de alumínio de alta precisão atrelados a 24 V DC motor escovado. Nesta configuração, a taxa de fluxo máxima barril é influenciada por uma série de fatores, incluindo (1) a velocidade máxima do motor (rpm 4.252) e a liderança de parafuso de precisão slide (1,27 mm) que é acoplado ao motor do eixo (2) o torque do motor (~0.2 N * m do cheio-l oad de torque), que é necessário para superar a resistência ao fluxo (3) contribuições de contrapressão de entrada fluida em e a saída do misturador da CIJ e (4) a força das seringas usadas (os usuários devem estar conscientes das forças atuando sobre as seringas e utilize seringas de força apropriada). Sobre o ponto (2), quando o aumento do fluxo binário suficiente taxa é necessário para evitar enrolar o motor, mantendo constante expulsão sob crescente pressão de retorno. Taxas de fluxo de cano – para ilustrar o fluxo de barril a taxa que o referido regime pode alcançar, considere o caso onde a FNP é executada usando reagentes carregados em duas seringas de 1 mililitro. Para obter um fluxo de 1 mL/s taxa através do tambor, o motor deve avançar a placa de metal a distância definida pelo comprimento êmbolo (~ 68 mm para uma seringa típica 1 mL) em um segundo. Desde a liderança de 1,27 mm parafuso da corrediça precisão, segue-se que um motor de corrente contínua operando em 4.252 rpm é capaz de fazer avançar a plataforma até ~ 90 mm/s (rev/s 71 * 1,27 mm/rot). Isso corresponde a uma taxa de fluxo de cano de ~1.3 mL/s, que exceder a 1 mL/s taxa de alvo.
   4. Antes da execução do instrumento, verifique o sistema para garantir que o caminho da plataforma está livre de obstruções, e que os detectores de proximidade IR dianteiros e traseiros são claros de obstruções (os sensores de infravermelhos são as caixas-pretas pequenas perto do slide de precisão terminais; Ver Figura 5I). Também certifique-se de que a saída do tubo capilar do misturador CIJ é roteada em um recipiente de recolha apropriado (ex: vidro, copo, etc.).
   5. Para expulsar os reagentes de seringas e no misturador CIJ, pressione o botão executar na interface do software.
2. (Opção 2) Modo de execução manual de uso. Consulte as instruções do Modo de Auto Run acima e observe as seguintes alterações para a etapa 5.1.5: Pressione o botão Avançar continuamente pressionado através da conclusão da execução (ou seja, a plataforma avança em resposta a um evento na imprensa e o motor de vai parar em resposta a um evento na liberação).
3. (Opção 3) Use a plataforma manual posicionamento modo; Este modo permite aos usuários posicionar a plataforma executando o motor a uma velocidade baixa (20% de energia) em resposta aos botões de frente e verso sobre a interface do software.

Aqui, apresentamos um protocolo simples para a formulação de nanocarriers capaz de carregar carga hidrofílica e hidrofóbica que são seguros para o rato na vivo e primatas não humanos administração^11,13. Incluímos também um protocolo detalhado para a síntese do polímero usado em nossos resultados representativos, juntamente com uma descrição para a fabricação de um instrumento personalizado para o choque mecanicamente controlado de soluções na batedeira CIJ. A Figura 1 fornece uma visão geral das etapas executadas para produzir PEG₁₇-bl- PPS₃₅síntese-SH, o copolímero de diblock usado auto-montagem polymersome nanocarriers. Uma visão geral do protocolo FNP para montagem polymersomes PEG-bl-PPS carregado com terapêutica e/ou agentes de imagem é demonstrada na Figura 2. O polímero foi impingido em um misturador CIJ (esquemático mostrado na Figura 3a, originalmente descrita em ¹⁰) para formar monodisperso polymersomes como a morfologia de agregados, que pode ser validado pela luz dinâmica espalhamento (DLS) e criogênicos microscopia eletrônica de transmissão (cryoTEM) (Figura 3b-3 -c). Polymersomes formados por FNP tornam-se menores (Figura 3d) e mais monodisperso (Figura 3e) com impingements subsequentes e pode ser carregados com carga hidrofílica e hidrofóbica (por exemplo, fez o corante lipofílico, pequena molécula terapêutica, proteína, etc.; Figura 4a). Nanocarriers formados sob condições estéreis acima descritas são endotoxinas livres pelos ensaios de endotoxina tanto azul cru e leite e, portanto, adequada para uma ampla gama de aplicações in vitro e in vivo (figura 4b, dados não mostrados).

Por último, temos projetado e construído um instrumento para mecanicamente-controle a taxa de fluxo e o choque resultante das soluções na batedeira CIJ (Figura 5). A criação deste instrumento é essencial, como bombas de seringa comercialmente disponíveis não podem atingir as taxas de fluxo necessárias para a FNP. Com excepção de modificações personalizadas, bombas de seringa comercialmente disponíveis têm limitações de velocidade impostas pela sua utilização de motores de passo de baixa velocidade, que são projetados para dispensar confiantemente fluido de forma lenta e constante. Em nosso instrumento, expulsão de reagente é controlada por uma lâmina de precisão, sob o controle de um 24 V DC motor, que pode alcançar muito maior velocidade (4.252 rpm) escovado do que os motores de passo lento encontrados em bombas de seringa comercial. Executando em um computador de placa única de software personalizado é usado para operar o instrumento (Figura 6). Desenhos 2D foram fornecidos além de modelos em 3D das peças. Todos os desenhos e modelos foram criados em FreeCAD (paramétrico 3D CAD modelagem de software de código aberto) para garantir que eles são altamente acessíveis para a comunidade de pesquisa. O software para operar o instrumento foi escrito em Python 2.7.12, permitindo o rápido desenvolvimento de procedimentos personalizados da FNP para garantir a produção congruente de nanocarriers (tamanho, morfologia, etc.). Software para operar o instrumento será disponibilizado mediante pedido. Usuários devem notar que o software não é atualmente compatível com Python 3; no entanto, isso pode mudar em futuras atualizações. Controlando a taxa de expulsão de reagente, este instrumento elimina a variável de erro humano de mão-operação.

Figura 1. Esquema de síntese para a síntese de PEG₁₇- bl-PPS₃₆-sh. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Produção de polymersomes através de FNP em um misturador CIJ orientado a mão. Diagrama da formação de polymersomes usando a FNP. O polímero PEG-bl-PPS é dissolvido em solvente orgânico juntamente com carga hidrofóbica e é impingido contra solvente aquoso com carga hidrófila dissolvida. Mistura rápida ocorre dentro do misturador da CIJ e efluxo pode repetidamente ser impingido ou permitido para concluir o processo de formação através da diluição em um reservatório de solvente aquoso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Caracterização de polymersomes formado pela FNP. (a) desenho esquemático da batedeira CIJ utilizado neste estudo. Todas as medidas são em milímetros. (b) distribuição de tamanho de polymersomes formada pela FNP após impingements 1 e 5, medida pelo DLS. n = 6 formulações, média das amostras são graficamente. (c) imagens de cryoTEM exemplo de polymersomes formaram após 1 e 5 impingements através do mixer do CIJ, escala bar = 100 nm. Diâmetro (d) e polidispersividade índice (e) de polymersomes formado pela FNP, medido por DLS. Para comparação, polymersomes formado por reidratação de película fina, com (TF-E) ou sem extrusão posterior (TF-NE), e formado pela dispersão de solvente (SD) também foram medido, n = 3, barras de erro representam o desvio padrão. Subfigures (c)-(e) tomadas com a permissão de Allen et al . ¹¹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Caracterização de eficiência e endotoxinas de carregamento. (a) carregando a eficiência dos pequenos e macromoléculas dentro polymersomes, n = 3, barras de erro representam o desvio padrão. (b) ensaio de LPS azul cru de polymersomes formado pela FNP estéril, n = 6, barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Instrumento para o controle mecânico de choque de solução na batedeira CIJ. (a) 24 V escovado Motor DC. (b) alimentação (24 V, 2.5 uma). (c) 4.5" derrame precisão slide com 1,27 mm parafuso chumbo (conectado ao eixo do motor por um acoplamento de feixe de parafuso). plataforma de expulsão (d) construída de chapas de metal retangulares e em forma de L chaves de canto. misturador da CIJ (e) . carruagem de expulsão (f) . (g) placa única computador e 7" touchscreen. (h) placa de controle mMotor envolvida em caixa de plástico (83 milímetros x 53 x 35 mm). (i) sensores de infravermelhos (sensores de movimento sem contato pausa-feixe). (j) botão de paragem de emergência (NC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Diagrama de fiação do núcleo. As ligações primárias entre o computador de placa única, controlador do motor e sensores de infravermelhos são exibidas. As conexões de touchscreen LCD não são exibidas aqui, como este componente é não-essenciais (usuários podem optar por usar um monitor de computador padrão e mouse em vez disso). Note que na configuração exibida, a alimentação do motor V 24 e fonte de alimentação de computador de placa única são separados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nós fornecemos instruções detalhadas para a preparação rápida de polymersomes usando PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH como o copolímero de diblock. Polymersomes vesiculares são a morfologia de agregação primária montada para esta relação de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloco molecular peso. Quando invadiam várias vezes, eles têm um diâmetro e polidispersividade que corresponde a polymersomes extrudados através de uma membrana de nm 200 depois de ter sido formada através de hidratação de película fina. Este protocolo, portanto, elimina a necessidade de etapas de extrusão adicional durante a fabricação de monodisperso polymersome nanocarriers. Polymersomes formado através de FNP carregar carga hidrofílica e hidrofóbica e manter a bioatividade dessas moléculas através do processo de formulação¹¹. Protocolos adicionais são descritos para garantir a esterilidade quando necessário, permitindo a formação de formulações de polymersome que são livres de endotoxinas e, portanto, apropriado para ensaios bioquímicos e imunológicos, bem como seguro para administração in vivo . O misturador CIJ manual é simples de configurar e fornece facilidade de uso para o usuário, mas introduz a possíveis problemas de controle de qualidade devido à variabilidade do usuário. Para manter a consistência do fluxo, procuramos criar um instrumento capaz de alcançar e manter reproducibly um caudal comparáveis. Importante, no acima especificado dimensões do canal, bombas de seringa comercial não podem alcançar taxas de fluxo suficientemente alta (~ 1 mL/s) devido a ser equipados com motores de passo de baixa velocidade. Para combater este problema e para permitir maior controle sobre a taxa de fluxo, a fabricação de uma bomba de seringa de alta velocidade para a FNP foi descrita. Cuidado foi tomado para utilizar o código-fonte aberto e software facilmente personalizável para o sistema so e código.

Controle sobre taxas de fluxo alternativo oferece a possibilidade de ajustar a formulação nanocarreador e fornece oportunidades para explorar o conjunto de nanocarreador diversas morfologias. O número de Reynolds e o correspondente tempo de mistura anteriormente foi mostrado para afetar o tamanho do núcleo sólido nanocarriers formado via FNP⁹, mas não está claro qual o impacto que teria sobre a formação de polymersomes. Este é um tópico de investigação atual, com a atual taxa recomendada ser de 0,5 a 2 mL/s, com os resultados representativos realizada a cerca de 1 mL/s. Para aumentar o controle sobre a taxa de fluxo ainda mais, pode ser necessário substituir o sistema operacional baseado em Linux com controle em tempo real sobre o motor da bomba de seringa.

Além de ajustar a taxa de fluxo, há um número de maneiras que este protocolo FNP pode ser modificado para necessidades específicas de suíte ou aplicações. Quantidades maiores ou menores de polímero podem ser usadas. Concentrações tão elevadas quanto 100 mg/mL e baixa como 1 mg/mL têm sido utilizadas para formar nanocarriers estável. Volumes maiores podem ser utilizados para choque, embora a aplicação consistente de pressão durante a FNP orientado a mão é mais difícil em volumes superiores a 1 mL por seringa. O volume do reservatório também pode ser modificado. Final orgânico: rácios de solventes aquosos de maior que 1:3 pode resultar na formação incompleta do nanocarriers, e como tal devem ter cuidado para não diminuir o volume do reservatório sem confirmar a formação de nanocarriers. Agregação pode ocorrer ao tentar carregar a altas concentrações de carga hidrofóbica, que geralmente pode ser aliviado, aumentando a proporção molar do polímero: carga.

Um tópico adicional aberto para exploração é a expansão da formação de polymersome FNP para incluir outros sistemas polímero além do PEG -bl-PPS. De fato, outros sistemas têm sido utilizados anteriormente na formação de micelas e sólido-núcleo drogas nanocarriers^16,17. No entanto, é que não está claro se há um conjunto de parâmetros que podem levar à formação de polymersomes através de FNP usando esses outros sistemas de polímero. Dado o número de variáveis possíveis para explorar, é inteiramente possível que outros polímeros podem formar polymersomes ou outras nanoarchitectures macio através de FNP com parâmetros experimentais ajustados, tais como vazão, temperatura, seleção de solvente e concentração de polímero.

Como com todas as técnicas de formulação, existem limitações a FNP e restrições que podem fazer com que certas aplicações insustentável. O processo de mistura rápido requer que os solventes orgânicos e aquosos miscível, que impede o uso de alguns solventes comuns utilizados para a dissolução de muitos diblock copolímeros, por exemplo, diclorometano e clorofórmio. Alguns polímeros podem portanto ser tornados incompatíveis com FNP se eles não são capazes de ser dissolvido em um solvente orgânico miscível com água. O protocolo FNP descrito aqui utiliza uma proporção de 1:1 de orgânicos para solvente aquoso, o que pode diminuir a atividade de cargas sensíveis a altas concentrações de solventes orgânicos, tais como algumas proteínas bioativas. Note que influências na Bioatividade dependerá da proteína, como anteriormente encontramos efeitos mínimos sobre a atividade enzimática da fosfatase alcalina após carregamento dentro polymersomes por FNP¹¹. Misturadores de entrada multi vórtice¹⁸ são uma plataforma FNP mais caro mas mais personalizável que fornece controle adicional sobre a relação de orgânicos para solventes aquosos, oferecendo uma alternativa versátil para misturadores CIJ para estes contextos.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Reconhecemos que o suporte pessoal e instrumentação da instalação de biologia estrutural da Universidade de Northwestern. Reconhece-se o apoio da R.H. Lurie abrangente Cancer Center da Universidade do noroeste e as instalações de biologia estrutural Universidade Northwestern. O detector de elétrons direto Pauo K2 foi comprado com fundos fornecidos pelo consórcio biomédica de Chicago com o apoio dos fundos Searle em Chicago comunidade Trust. Agradecemos também as seguintes facilidades da Northwestern University: Centro Interdisciplinar de ciência superfície de Keck, o instrumento de biologia estrutural, a facilidade de imagem biológica, o centro de imagem Molecular Avançada e a analítica Núcleo de equipamentos bio-nanotecnologia. Esta pesquisa foi apoiada pela concessão do National Science Foundation do 1453576, os institutos nacionais de saúde diretor novo prêmio inovador 1DP2HL132390-01, o centro de regenerativa nanomedicina Catalyst Award e o prêmio de catalisador de McCormick de 2014. SDA foi apoiada em parte pelo NIH predoctoral biotecnologia formação Grant T32GM008449.