Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

Nanomateriales ofrecen versátiles mecanismos de entrega terapéutica controlada para aplicaciones aplicadas y ciencia básica, pero su fabricación a menudo requiere conocimientos que no está disponible en laboratorios biomédicos más. Aquí, presentamos protocolos de fabricación escalable y carga terapéutica de diversos nanocarriers uno mismo-montado usando flash nanoprecipitation.

Nanomateriales presentan una amplia gama de opciones para personalizar la entrega controlada de cargas moleculares individuales y combinados para aplicaciones terapéuticas y proyección de imagen. Esta especificidad creciente puede tener importantes implicaciones clínicas, incluyendo la disminución de efectos secundarios y dosis más bajas con mayor potencia. Además, el en situ dirigidos a modulación controlada de subconjuntos específicos de la célula puede mejorar las investigaciones in vitro e in vivo de fenómenos biológicos básicos y sonda en función de la célula. Por desgracia, los conocimientos requeridos en ciencia de la nanoescala, la química y la ingeniería a menudo prohíben laboratorios sin experiencia en estos campos de fabricación y personalización de nanomateriales como herramientas para sus investigaciones o vehículos para su estrategias terapéuticas. Aquí, le ofrecemos protocolos para la síntesis y ensamblaje escalable de un sistema de copolímero de bloque no tóxico versátil susceptible a la fácil formación y carga de los vehículos de escala nanométrica para aplicaciones biomédicas. Nanoprecipitation flash se presenta como una metodología para la fabricación rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) -bl-copolímeros de poli (sulfuro de propileno). Estos protocolos permitirá laboratorios con una amplia gama de conocimientos y recursos para fácil y reproducible fabricar nanocarrier avanzados sistemas para sus aplicaciones. Procesan de diseño y construcción de un instrumento automatizado que emplea una bomba de jeringa de alta velocidad para facilitar el nanoprecipitation flash y para permitir mayor control sobre la homogeneidad, tamaño, morfología y carga de nanocarriers de polymersome es se describe.

Nanocarriers permiten la liberación controlada de carga pequeña y macromolecular, incluya entidades activas, que si no encapsulado, sería altamente degradable o demasiado hidrofóbico para administración en vivo. De las morfologías nanocarrier regularmente fabricadas, vesículas poliméricas análogas a liposomas (también llamados polymersomes) ofrecen la posibilidad de cargar simultáneamente hidrofílicos e hidrofóbicos carga^1,2. A pesar de sus ventajas prometedoras polymersomes son todavía raros en aplicaciones clínicas debido, en parte, a varios retos en su fabricación. Para uso clínico, polymersome formulaciones deben ser en lotes a gran escala, estériles y consistentes.

Un número de técnicas puede utilizarse para forma polymersomes de un copolímero del diblock, tales como poly(ethylene glycol) -bloque-poli (sulfuro de propileno) (PEG -bl- PPS), que incluyen dispersión solvente³, película delgada rehidratación^{1 , 4}, ^5,de microfluídica⁶e hidratación directa⁷. Solvente dispersión implica tiempos de incubación en presencia de solventes orgánicos, que puedan desnaturalizar algunas cargas bioactivos, como las proteínas. Rehidratación de película delgada no ofrece control sobre la polidispersidad de la polymersomes formado, a menudo requiere técnicas de extrusión costoso y desperdiciador de tiempo para lograr monodispersity aceptable. Además, microfluids e hidratación directa son difíciles de escala para grandes volúmenes de producción. De los métodos de fabricación diferentes nanocarrier, flash nanoprecipitation (FNP) ofrece la posibilidad de hacer formulaciones a gran escala y reproducible^8,9,10. Mientras que la FNP estaba reservado previamente para la formulación de nanopartículas de núcleo macizo, nuestro laboratorio ha ampliado recientemente el uso de FNP para incluir la formación constante de diversos PEG -bl- PPS nanoestructura morfologías^{11, 12}, incluyendo polymersomes¹¹ y bicontinuas nanoesferas¹². Se encontró que la FNP fue capaz de formar monodispersa formulaciones de polymersomes sin necesidad de extrusión, resultando en valores de índice de polidispersidad superior comparados con no sacó polymersomes formado por dispersión de rehidratación y solvente de película delgada ¹¹. bicontinuas nanoesferas, con sus grandes dominios hidrofóbicos, no fueron capaces de formar por rehidratación de película delgada, a pesar de formar un número de condiciones solvente con FNP¹².

Aquí, ofrecemos una descripción detallada para la síntesis de la PEG - copolímero de diblockbl- PPS usado en la formación de polymersome, el mezclador de jets (CIJ) de choque confinado utilizado para la FNP, el FNP protocolo sí mismo y la implementación de un sistema automatizado para reducir la variabilidad del usuario. Información sobre cómo esterilizar el sistema lo suficiente como para producir formulaciones libres de endotoxinas para uso en vivoy datos representativos acerca de la caracterización de polymersomes formado por FNP está incluida. Con esta información, los lectores con interés en utilizar polymersomes para trabajo in vitro e in vivo podrán fabricar sus propias formulaciones monodispersa estéril. Lectores con experiencia en formulaciones nanocarrier y con conocimientos de síntesis del polímero será capaces de probar rápidamente sus propios sistemas de polímero mediante FNP como una alternativa posible a sus actuales técnicas de formulación. Además, los protocolos descritos pueden utilizarse como herramientas educativas para la formulación de nanocarriers en los cursos de laboratorio de nanotecnología.

1. síntesis de Poly(ethylene glycol) -bloque-poli (sulfuro de propileno)-tiol

1. Sintetizar el mesilato de metoxi-poly(ethylene glycol) (Mn: 750) (MeO-PEG₁₇-Ms, ).
   1. Disolver 10 g de MeO-PEG₁₇-OH en 200 mL de tolueno de 100% dentro de un matraz de fondo redondo cuello 3 (RBF) bajo agitación magnética a 600 rpm.
   2. Conecte el RBF 3-cuello con un aparato de Dean-Stark, sí mismo unido a un condensador, mantener todo el sistema bajo gas inerte, nitrógeno o argón.
   3. Coloque el cuello 3 RBF en baño de aceite, calor a 165 ° C mientras que revuelve a 600 rpm.
   4. Quitar agua del rastro y 100 mL de tolueno usando destilación azeotrópica.
   5. Quitar el RBF 3-cuello del aceite, desconecte el aparato de Dean-Stark manteniendo condiciones de gas inerte y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
   6. Agregar 5,6 mL de trietilamina 100% (3 EC. molar) y 300 mL de tolueno anhidro de 100% a MeO-PEG₁₇-OH solución removiendo a 600 rpm.
   7. Mover el RBF 3-cuello a un baño de hielo, mantener la agitación en 600 rpm y condiciones de gas inerte.
   8. Diluir 3,1 mL de cloruro de metanosulfonilo 100% (3 EC. molar) en 30 mL de tolueno de 100%, añadir lentamente el RBF 3-cuello a través de un embudo de adición mientras que revuelve a 600 rpm.
   9. Revolver durante la noche a 600 rpm a temperatura ambiente bajo condiciones inertes.
   10. Solución de filtrado a través de un embudo de Buchner lleno con tierra de diatomeas (véase Tabla de materiales) para eliminar las sales.
   11. Eliminar tolueno mediante un rotavapor con el baño de agua a 40 º C, giro a 120 rpm y presión entre 50-100 milibar.
   12. Volver a disolver el producto en 200 mL de diclorometano (DCM) de 100% y filtrar con un embudo Buchner con tierra de diatomeas (véase Tabla de materiales).
   13. Quitar DCM mediante un rotavapor con el baño de agua a 40 º C, giro a 120 rpm y presión entre 450-600 milibares.
   14. Escasamente re-disolver producto en 100% DCM y precipitar lentamente producto añadiendo gota a gota (a través de una pipeta de Pasteur) a 500 mL de helado 100% dietil éter. Mantener la agitación 300 RPM.
   15. Decantar o aspirar para eliminar el éter dietílico de producto precipitado, MeO-PEG₁₇- mesilato y tienda durante la noche en desecador de vacío se seque por completo.
   16. Inmediatamente el uso del producto o tienda bajo gas inerte a-20 ° C durante varios meses.
2. Sintetizar thioacetate metoxi-poly(ethylene glycol) (MeO-PEG₁₇-TA, II).
   1. Disolver 5 g de MeO-PEG₁₇-Ms (I) en 200 mL de 100% anhidro dimetilformamida (DMF) en un RBF 3-cuello, revuelva a 600 rpm a temperatura ambiente bajo gas inerte.
   2. Agregar 2,5 g de carbonato de potasio 100% (3 EC. molar) para agitación de la solución.
      Nota: carbonato de potasio no totalmente disolverá en la solución.
   3. Diluir 1,3 mL de ácido thioacetic de 100% (3 EC. molar) en 100 mL de 100% DMF anhidra y añadir gota a gota a la solución mediante un embudo de adición.
      Nota: El ácido Thioacetic tiene un olor fuerte y desagradable. Debe tener cuidado de mantener todos los objetos sucios dentro de la campana química durante la noche antes de la eliminación o limpieza.
   4. Revuelva vigorosamente (rpm 600 o más) durante la noche a temperatura ambiente.
      Nota: Formación de sal puede alterar fácilmente la agitación de la solución. Debe tenerse cuidado para mantener la agitación durante la noche.
   5. Solución de filtrado a través de un embudo de Buchner lleno con tierra de diatomeas (véase Tabla de materiales).
   6. Quitar DMF a través de un rotavapor con el baño de agua a 60 ° C, rotación a 120 rpm y presión entre 5-15 milibar.
   7. Disolver el producto en 100 mL de tetrahidrofurano (THF) de 100% y añadir a una columna de alúmina neutra para eliminar impurezas coloreadas de rojo/naranja.
   8. Quitar THF mediante un rotavapor con el baño de agua a 40 º C, giro a 120 rpm y presión entre 200 y 300 milibares.
   9. Escasamente re-disolver producto en DCM de 100%. Si forma un precipitado de la sal, solución de filtrado a través de 6 μm poro tamaño filtro de papel con un embudo de Buchner.
   10. Lentamente precipitado producto añadiendo gota a gota mediante pipeta Pasteur al 500 mL de helado 100% éter dietílico, revolviendo a 300 rpm. Éter dietílico puede necesitar más deben enfriarse a-20 ° C en un congelador a prueba de explosiones durante varias horas si no desplome precipitado fuera de solución a 4 ° C.
   11. Decantar o aspirar para eliminar el éter dietílico de producto precipitado, MeO-PEG17-Thioacetate. Almacenar el producto durante la noche en un desecador de vacío y posteriormente bajo gas inerte a-20 ° C.
3. Sintetizar diblock copolímero poly(ethylene glycol) -bloque -poly(propylene sulfide)-tiol (PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, III).
   1. MeO-PEG₁₇-TA (II) se disuelven en 10 mL de 100% DMF anhidra dentro de un matraz Schlenk bajo argón, agitación a 400 rpm en un baño de agua temperatura ambiente.
   2. Añadir 1,1 eq molar del methoxide del sodio (solución al de 0,5 M en metanol), permite remover a 400 rpm por 5 minutos.
   3. Añadir 35 eq molar de sulfuro de propileno 100%, rápidamente, a la solución. Permiten remover a 400 rpm por 10 minutos.
   4. Añadir eq 10 molar de ácido acético glacial al 100%, permiten remover a 400 rpm por 5 minutos.
   5. Quitar DMF a través de un rotavapor con el baño de agua a 60 ° C, rotación a 120 rpm y presión entre 5-15 milibar.
   6. Volver a disolver el producto con moderación en DCM 100%, precipitan en 80 mL de metanol al 100%, dividido entre dos tubos de centrífuga cónico de 50 mL.
   7. Tubos cónicos de centrífuga a 7500 x g durante 5 minutos a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante lejos.
   8. Almacene el producto, PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, durante la noche en un desecador de vacío y posteriormente bajo gas inerte a-20 ° C.

2. Monte PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

1. (Opcional) Esterilizar el mezclador de jets (CIJ) de choque confinado.
   1. Dentro de un gabinete de seguridad biológica (BSC), sumerja el mezclador con todas las piezas desmontadas dentro de 0,1 M NaOH durante la noche.
   2. Vuelva a montar el mezclador de la CIJ y fluir a través de agua libre de endotoxinas mediante jeringas luer-lock.
   3. El pH del agua de prueba y continúa fluyendo agua a través de hasta registros de pH como neutral.
2. Disolver PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH polímeros y cargas hidrofóbico en THF (solución 1 de choque).
   1. Pesan 20 mg de PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH en un tubo de 1,5 mL.
   2. Añadir tintes hidrofóbicos (por ejemplo,DiI, ICG), medicamentos (por ejemplo,la rapamicina) y otra carga.
      Nota: La carga puede ser seco o disuelto en un solvente miscible con agua, preferiblemente de THF. Si el cargo es insoluble en THF o DMF, otro solvente miscible con agua puede usarse, pero con moderación, ya que el polímero es poco probable que sea soluble. La cantidad de carga que se puede cargar depende de las propiedades de la carga sí mismo (por ejemplo, el peso molecular, la hidrofobicidad, consideraciones estérico) y debe ser explorado en una base caso-por-caso^11,12.
   3. Añadir 500 μl del 100% THF al polímero y carga, vortex vigorosamente para disolver.
3. Disuelve hidrofílica carga en buffer acuoso (solución 2 de choque). Para ello, disolver carga hidrofílico para ser cargado dentro de las vesículas de polímero en 500 μl de un buffer acuoso (por ejemplo, tampón fosfato salina agua, pura, etc.) según sea necesario.
4. Agregar buffer a depósito.
   1. Añadir 2,5 mL de un tampón acuoso de elección (por ejemplo, 1 x de tampón fosfato salino) a un depósito convenientemente tamaño (por ejemplo, un vial de centelleo de vidrio de 20 mL). Coloque el depósito bajo mezclador CIJ tal que la salida del mezclador entra directamente en el depósito.
5. Cargar soluciones de choque plástico jeringas desechables 1 mL separadas.
6. Afectar las soluciones cara a cara al mismo tiempo formar nanoestructuras y cargar con la carga útil.
   1. Inserte las jeringas adaptadores Luer-lock en la parte superior de la mezcladora de la CIJ.
   2. En un movimiento único, suave y rápido, Presione ambas jeringas simultáneamente y con igual fuerza.
      Nota: En caso de vulneración secuenciales múltiples, recoger primero la salida en un depósito vacío.
   3. (Opcional) Realizar múltiples vulneración. Solución de nanoestructura naciente dividida entre dos jeringas y repita los pasos 2.6.1-2.6.2 hasta 4 veces más.
   4. Recoge la salida en el depósito lleno de tampón acuoso preparado en 2.4.1 y revuelva suavemente para asegurar una mezcla.
7. Retire carga descargada y solvente orgánico.
   1. (Opción 1) Dializan nanocarrier formulación en el mismo buffer acuoso utilizado para el choque y en el embalse, utilizando tubería de un adecuado corte de MW durante al menos 24 horas con al menos 2 cambios de tampón. Esto puede realizarse a temperatura ambiente.
      Nota: Nanocarriers se mantendrá por la tubería con un atajo de MW < 100.000 kDa y potencialmente puede conservarse por más atajos así. Esta opción mantiene esterilidad cuando se realiza en un BSC utilizando tampón estéril.
   2. (Opción 2) Filtro de formulación a través de una exclusión de tamaño o columna de intercambio de la desalación en solución tampón (por ejemplo, sefarosa 6B columna) usando 1 x PBS buffer acuoso.
      Nota: Esta opción mantiene esterilidad cuando se realiza en un BSC con una columna que ha sido bien esterilizado.
   3. (Opción 3) Quite el solvente orgánico volátil mediante desecación vacío durante la noche.
   4. (Opción 4) Filtro de formulación utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial usando un filtro de 50-100 kDa con un caudal de 20-60 mL/min durante 15 minutos a 1 hora, dependiendo del peso molecular de la carga unencapsulated ser purificada a (la más grande carga tardará más).
8. (Opcional) Concentrar la formulación nanocarrier.
   1. (Opción 1) Concentrado usando un sistema concentrador de vuelta (por ejemplo, giro columna con MW corte > 100.000), utilizados según lo descrito por el fabricante.
      Nota: Nanocarriers puede necesitar ser suspendidas entre giros y puede requerir un número de tiradas para concentrarse hasta el volumen deseado. Concentración de spin puede reducir la esterilidad de nanocarrier formulaciones.
   2. (Opción 2) Reducir el volumen mediante desecación vacío.
      Nota: Cambio de volumen es difícil de controlar bajo estas condiciones, y debe tenerse cuidado para mantener la osmolaridad antes y después de la concentración.
9. Almacenar nanocarriers a 4 ° C durante semanas a meses. Antes de usarlo después de almacenaje, brevemente las formulaciones nanocarrier vortex.

3. caracterizar las formulaciones Nanocarrier

1. Medir la eficiencia de carga
   1. Si la carga es fluorescente o absorbe fuertemente a una determinada longitud de onda fuera de 260-450 nm, medir fluorescencia/absorbancia con un espectrofotómetro de Fluorímetro.
      Nota: PEG -bl- PPS absorbe fuertemente de 260-310 nm y formulaciones polymersome absorben de 310-450 nm, que puede complicar la cuantificación de la carga que absorbe a una longitud de onda similar.
   2. Si carga absorbe dentro de la gama de 260-450 nm y es hidrofílica, interrumpir PEG -bl- PPS nanoestructuras añadiendo 25 μL de la formulación a un volumen igual de 1% H₂O₂ o 1% Tritón X-100 y posteriormente separar y distinguir carga de absorción del polímero mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) utilizando una columna de exclusión de tamaño compatible con acuosa tampones (por ejemplo, una columna de sefarosa 6B) ¹¹.
   3. Si carga absorbe dentro de la gama de 260-450 nm y es soluble en THF o DMF, liofilizar la formulación por congelación 100 μL en un tubo de plástico de 1,5 mL a-80 ° C durante la noche. Luego coloque el tubo en un recipiente vacío de vidrio y colóquelo en un liofilizador. Deje transcurrir 24 horas para la liofilización se producen y posteriormente volver a disolver en 50 μL de DMF o THF antes de la separación y detección por HPLC.
2. Medida nanocarrier tamaño y morfología
   1. Utilice dispersión ligera dinámica (DLS)¹¹ o nanopartículas análisis¹³ de seguimiento para medir tamaño nanocarrier.
      Nota: Nanocarriers formado de PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH se espera que tenga un diámetro promedio entre 100 y 200 nm, con una polidispersidad índice < 0.3.
   2. Determinar morfología nanocarrier utilizando transmisión criogénico microscopia electrónica (cryoTEM)¹⁴.
      Nota: Nanocarriers formado de PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH se espera que sean las vesículas del polímero (polymersomes) con una membrana polimérica claramente discernible y forma principalmente esférica.
3. (Opcional) Formulaciones de la prueba de endotoxinas
   1. (Opción 1) Utilizar un análisis basado en la célula por la presencia de endotoxinas, por ejemplo, las células azul crudo o las células de HEK azul TLR4 (véase Tabla de materiales), según lo descrito por el fabricante, en un análisis cuantitativo o cualitativo de lipopolisacáridos (LPS)¹³ .
   2. (Opción 2) Utilice un kit de ensayo de¹⁵ de amebocitos de Limulus Lysate (LAL), descrito por el fabricante.

4. fabricación de una bomba de jeringa de alta velocidad para la FNP

1. Fabricar componentes de instrumento personalizado.
   Nota: materiales complementarios disponen de modelos 3D para trabajar a máquina todas las piezas de encargo.
   1. Chasis del instrumento varias capas de ¾" las hojas de acrílico de la máquina y montar (ver Archivos complementarios 1-5).
      Nota: Acrílico tiene mala resistencia química. Si el instrumento debe ser utilizado con solventes agresivos, la base de un metal que se considere conveniente para el uso de la máquina.
   2. Impresión 3D de las partes con impresión con plástico polylactide (PLA).
      1. El aparato de 2 partes de expulsión (SE) jeringa de impresión: SE parte 1 - bloque FNP posterior con carro (figura 5F, parte gris; Archivo complementario 6) y SE parte 2 - Guía de expulsión frontal (figura 5F, parte negra; Archivo suplementario 7). Ver 2 archivo complementario para esquemas.
      2. Imprimir las llaves de sensor de infrarrojos (figura 5I, cajas negras; Archivos complementarios 8 y 9).
      3. (Opcional) Imprimir el soporte de émbolo de la jeringa dual.
2. Fijar las capas de instrumentos chasis con pernos hexagonales M5 y añadir pies de goma a la base.
3. Configurar una computadora single-board con Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) sistema operativo (basado en Linux Debian).
   Nota: Software para el funcionamiento del instrumento está disponible a petición. Instrumento software código fuente disponible bajo petición. Al recibir el archivo comprimido, descargar todas las dependencias especificadas en el archivo README. Este software incluye una interfaz gráfica sencilla que permite control sobre la operación del equipo, incluyendo los parámetros básicos de funcionamiento (velocidad del motor, dirección, etc.). Animamos a los usuarios ampliar el código fuente existente y módulos personalizados de programa a medida para usan en sus propios experimentos. Todo el software fue escrito usando Python 2.7.12 y no es actualmente compatible con Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy y módulos de multiprocesamiento se utilizan. El archivo Léame contiene información detallada acerca de la licencia de distribución de software.
4. Instale un 24 V cepillado motor de corriente continua (figura 5A) y la diapositiva de precisión (4.5"(114,3 mm) carrera; tornillo 1,27 mm plomo) (figura 5).
   Nota: El motor de 24 V DC utilizado aquí tiene un RPM_máximo, lo_máximoy par de plena carga de 4.252 RPM, 4.83 A y ~0.2 N * m, respectivamente.
   1. (Opcional) Coloque el relleno por debajo del motor para amortiguar la vibración durante el funcionamiento.
      Nota: Se recomienda que se corte una almohadilla gruesa de 2-3 mm para adaptarse a las dimensiones del carro motor de la base del instrumento.
   2. Monte la corredera de precisión para la base del instrumento.
      1. Retire temporalmente la varilla roscada.
      2. Diapositiva de montaje usando dos tornillos de máquina plana #8-32.
   3. Agujerea el motor de la C.C. de Monte a la diapositiva de precisión usando tornillo viga acoplamiento (1-1/4" de longitud) que contiene 6/16" y 1/4" de diámetro.
      Nota: Dependiendo del grosor del acrílico utilizado para las capas base de instrumento de la máquina, puede usar cu_as para nivelar los ejes del motor y de la precisión de la diapositiva.
5. Montar la plataforma de expulsión de las placas de metal y abrazaderas de las esquinas en forma de L (figura 5). Metal base de plataforma a plataforma deslizante (conectado a la varilla roscada) de montaje usando los tornillos #6-32. Ver esquema de diapositivas de precisión proporcionada por el fabricante para obtener detalles sobre las restricciones de montaje.
6. Montar la jeringa expulsión configuración del sistema.
   1. Coloque bloques de almohadilla de movimiento lineal (plataformas de montaje + rodamiento de movimiento lineal) sobre M8 cromado rieles de acero inoxidable (los carriles de acero paralelos pueden ser fácilmente observados en la figura 5).
   2. Carriles a través de carriles de guía y soporte y bloqueo eje lineal del hilo de rosca. Utilizar a tres guías por el carril. Piezas de montaje SE 1 y 2 sobre los bloques de almohadilla con tornillos de máquina M4.
   3. Libremente unir SE partes 1 y 2 con tornillos hexagonales M8. Configurar el espacio entre SE parte 1 y 2 con helicoidales compresión resortes que cubre cada perno que se fijan entre dos hacia adentro casquillos de nylon revestimiento (ver figura 5F). Monte los casquillos en el exterior de la SE parte 1 y parte SE 2.
7. Circuito de alambre (ver figura 6 para el esquema de base)
   1. Conectar el controlador motor a I2C/SDA, 3,3 V, y GND de los pernos la sola computadora de tablero.
   2. Conecte los terminales motor DC al M - y M + bloques de la tarjeta controladora del motor. Conectar 24 V, 2.5 suministro eléctrico (figura 5B) a los bloques de V + y GND del motor controlador (el controlador está encerrado en una caja electrónica simple en el diseño final, ver figura 5 H).
   3. Conectar las patillas 3V3 y 5V de la placa de control del motor con los pernos respectivos de la sola computadora de tablero. Conectar pines SDA y SCL del controlador motor a los pines 3 y 5 de la sola computadora de tablero, respectivamente.
      Nota: Comandos se emiten para el motor de la C.C. de la sola computadora de tablero a través de un controlador de motor. Velocidad del motor se controla mediante la regulación de la tensión en los bornes del motor mediante la modulación de anchura de pulso. En esta configuración, la máxima corriente pasando por el motor de 24 V DC (amperaje a carga plena: 4.83 A) se limita a 2,5 A por la fuente de alimentación de 24 V. Se recomienda que el circuito del motor está conectado a través de una normalmente cerrado (NC) parada de emergencia (figura 5J). Esto proporciona un medio para interrumpir el circuito del motor para permitir una operación de desconexión de emergencia básica.
   4. Conectar delantero y trasero proximidad infrarrojo sensores (sensores de distancia digital, figura 5I) a los pines GPIO RPi 24 y 23, respectivamente.
      1. Cableado del sensor de la ruta a través de conductos en la base del instrumento.
         Nota: Los sensores IR son sensores de movimiento sin contacto break-beam con un rango de detección de 2 a 10 cm.
      2. 4.7.4.2 ajustar los sensores IR por cable en las abrazaderas para sensor infrarrojo 3D impreso (figura 5I, cajas negras) y montar en la base del instrumento. Cuando se establece correctamente en el soporte, la cara del sensor debe sobresalir hacia el exterior de 14 mm x 7 mm abertura de la abrazadera rectangular.
         Nota: estas llaves de sensor pueden temporalmente montarse utilizando un adhesivo o Velcro (montaje temporal es útil para ajustar y optimizar la colocación de sensor de IR adecuadamente). Por otra parte, permanentemente Monte guía pequeños agujeros en la base del instrumento y asegurar las abrazaderas con tornillos de M2.
   5. Conectar una pantalla táctil LCD de 7" a 5V, GND y mostrar pines de interfaz en serie (DSI) de la sola computadora de tablero. El 7" RPi y montaje de la exhibición del LCD se muestra en la figura 5.

5. fabricar Polymersomes mediante FNP usando la bomba de jeringa de alta velocidad a medida

1. (Opción 1) Utilice el modo de funcionamiento del automóvil.
   1. Seleccione Auto Run en el menú principal. El sistema solicitará a los usuarios que permita que el motor automáticamente Coloque la plataforma de expulsión de la jeringa al principio de la diapositiva de precisión. Asegúrese de que el camino por delante y por detrás de la placa metálica es claro antes de proceder.
   2. Cargar las jeringas de plástico 1 mL como se describe en la sección 2.5 y jeringas de montaje sobre los conectores Luer hembra del mezclador de la CIJ. Cargar mezclador CIJ (con jeringas adjuntadas) en la abertura rectangular del carro posterior de expulsión (ver figura 5E).
   3. Seleccione la velocidad deseada del motor (unidades: rpm) usando el control deslizante en el GUI (ver nota a continuación para consideraciones importantes). La velocidad óptima del motor dependerá de la bomba específica y setup pero debe asegurar un caudal de al menos 1 mL/s para las dimensiones de canal de mezclador CIJ que aquí.
      Nota: Considere lo siguiente mientras que la tasa de flujo de valor. En la configuración vertical de FNP para manuales, reactivos son expulsados de las jeringas a una velocidad de ~ 1 mL/s, pero puede ser muy variable cuando guiadas a mano. Esto es simplemente la velocidad de flujo a través del barril de la jeringa, que es controlada por la tasa a la que el usuario avanza el émbolo de la jeringa. Tenga en cuenta que la velocidad de 1 mL/s es no referirse a la tasa de flujo de salida de la boquilla de diámetro más pequeño. En el anterior especifica dimensiones del canal, ~ 1 mL/s debe mantenerse para asegurar el número de Reynold de una apropiada mezcla turbulenta¹⁰. Las tasas de flujo diferentes pueden utilizarse siempre y cuando el diámetro del canal se ajusta en consecuencia para mantener el número de Reynold que soporta condiciones turbulentas. Los émbolos son avanzados por una placa metálica perpendicular, que se mueve a lo largo de una lámina de aluminio de alta precisión junto a 24 V DC motor cepillado. En esta configuración, el cañón máximo caudal está influenciado por varios factores, incluyendo (1) la velocidad máxima del motor (rpm 4.252) y el plomo del tornillo de la precisión diapositiva (1,27 mm) que está acoplada al motor del eje (2) el esfuerzo de torsión del motor (~0.2 N * m de l completo OAD de torsión), que es necesario vencer la resistencia para fluir (3) contribuciones de la presión de entrada del fluido en y salir de la mezcladora de la CIJ y (4) la fuerza de las jeringas que utilizan (los usuarios deben ser consciente de las fuerzas que actúan sobre las jeringas y usar jeringas de fuerza apropiada). En cuanto al punto (2), al aumentar el flujo de par suficiente tasa es necesaria para evitar el atascamiento del motor manteniendo constante expulsión bajo una creciente presión. Tasa de caudal cañón – para ilustrar el flujo de barril que dicho sistema puede alcanzar, considere el caso donde la FNP se realiza utilizando el reactivo cargado en dos jeringas de un mililitro. Para lograr un flujo mL/s 1 tarifa a través del cañón, el motor debe avanzar la placa metálica la distancia definida por la longitud del émbolo (~ 68 mm para una jeringa típica 1 mL) en un segundo. Siempre y cuando el plomo 1,27 mm del tornillo de la corredera de precisión, se deduce que un motor de C.C. en 4.252 rpm es capaz de avanzar hasta la plataforma ~ 90 mm/s (rev/s 71 * 1.27 mm/rev). Esto corresponde a un caudal de barril de ~1.3 mL/s, superior a 1 mL/s velocidad de la blanco.
   4. Antes de ejecutar el instrumento, compruebe el sistema para asegurarse de que el camino de la plataforma esté libre de obstrucciones, y que los detectores de proximidad de infrarrojos delanteros y traseros son libres de obstrucciones (los sensores IR son las pequeñas cajas negras cerca de la corredera de precisión terminales; Ver figura 5I). También asegúrese de que la salida de la tubería capilar de la mezcladora de la CIJ se encamina en un recipiente apropiado (ex: de vidrio vaso de precipitados, etc.).
   5. Para expulsar los reactivos de las jeringuillas y en el mezclador CIJ, presione el botón Ejecutar en la interfaz del software.
2. (Opción 2) Usar el modo manual run. Consulte las instrucciones del Modo de funcionamiento anteriores y nota el cambio siguiente para paso 5.1.5: Presione el botón de avance presiona continuamente a través de la realización de la carrera (es decir, la plataforma avanza en respuesta a un evento en la prensa y el motor detendremos en respuesta a un evento de lanzamiento).
3. (Opción 3) Manual plataforma posicionamiento modo; este modo permite a los usuarios colocar la plataforma ejecutando el motor a baja velocidad (20% de potencia) en respuesta a los botones adelante y atrás en la interfaz del software.

Aquí, hemos presentado un protocolo simple para la formulación de nanocarriers capaz de cargar carga hidrofílico e hidrofóbico que son seguros para el en vivo de ratón y primates no humanos administración^11,13. También hemos incluido un protocolo detallado para la síntesis del polímero utilizado en nuestros resultados representativos, junto con una descripción para la fabricación de un instrumento personalizado para el choque controlado mecánicamente de soluciones en el mezclador de la CIJ. Figura 1 ofrece un resumen de los pasos de síntesis realizado para producir PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH, el copolímero del diblock solía uno mismo-montar polymersome nanocarriers. Un resumen del protocolo FNP para montar polymersomes PEG-bl-PPS cargado de terapéutica o agentes imagen es diagramado en la figura 2. El polímero fue afectado en un mezclador CIJ (esquemático se muestra en la figura 3a, originalmente descrito en ¹⁰) para formar monodispersa polymersomes como la morfología del agregado, que puede ser validado por la luz dinámica dispersión (DLS) y criogénicos microscopía electrónica de transmisión (cryoTEM) (figura 3bc -3). Polymersomes formados por FNP se convierten más pequeños (Figura 3d) y más monodispersa (figura 3e) con posterior vulneración y puede ser cargados con carga hidrofílico e hidrofóbico (por ejemplo, lo tinte lipofílico, molécula pequeña terapéutica, proteína etc.; Figura 4a). Nanocarriers formados en las condiciones estériles descritas son endotoxinas libres por análisis de endotoxinas azul crudo y LAL y así conveniente para una amplia gama de aplicaciones in vitro e in vivo (Figura 4b, datos no mostrados).

Por último, hemos diseñado y construido un instrumento mecánicamente-controlar el flujo y el choque resultante de soluciones en el mezclador CIJ (figura 5). La creación de este instrumento es esencial, como bombas de la jeringuilla disponible comercialmente no pueden alcanzar el caudal necesario para el FNP. A excepción de modificaciones personalizadas, bombas de jeringas disponibles comercialmente tienen limitaciones de velocidad impuestas por el uso de motores de baja velocidad paso a paso, que están diseñados para dispensar confiablemente líquido de manera lenta y constante. En nuestro instrumento, expulsión de reactivo es controlado por un tobogán de precisión bajo el control de 24 V DC motor, que puede alcanzar mucho mayor velocidad (rpm 4.252) cepillado que los motores paso a paso lento encontrados bombas de la jeringuilla comercial. Software a medida en una sola computadora de tablero se utiliza para hacer funcionar el instrumento (figura 6). Dibujos en 2D se han proporcionado además de modelos 3D de las piezas. Todos los dibujos y modelos fueron creados en FreeCAD (paramétrico 3D CAD modelado software de código abierto) para asegurarse de que son muy accesibles a la comunidad de investigación. El software para operar el instrumento fue escrito en Python 2.7.12, permitiendo el rápido desarrollo de procedimientos personalizados de FNP para asegurar la producción congruente de nanocarriers (tamaño, morfología, etc.). Software para el funcionamiento del instrumento se harán disponible a petición. Los usuarios deben tener en cuenta que el software no es actualmente compatible con Python 3; sin embargo, esto puede cambiar en el futuro actualizaciones. Controlando la tasa de expulsión de reactivo, este instrumento elimina la variable de errores humanos de operación de la mano.

Figura 1. Esquema de síntesis para la síntesis de PEG₁₇- bl-PPS₃₆-SH Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Producción de polymersomes mediante FNP en un mezclador mano-conducido de la CIJ. Diagrama de la formación de polymersomes mediante FNP. Los polímeros de PEG-bl-PPS se disuelven en solvente orgánico junto con carga hidrofóbico y es afectado contra el solvente acuoso con carga hidrofílico disuelto. Mezcla rápida ocurre dentro de la mezcladora de la CIJ, y emanación puede ser repetidamente afectada o le permitirá que complete el proceso de formación a través de la dilución en un reservorio de solvente acuoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Caracterización de polymersomes formado por FNP. (a) diseño esquemático de la mezcladora CIJ utilizada en este estudio. Todas las medidas están en milímetros. (b) distribución de tamaño de polymersomes formado por FNP después vulneración 1 y 5, según lo medido por DLS. n = 6 formulaciones, se graficó la media de las muestras. (c) imágenes de cryoTEM ejemplo de polymersomes forman después de 1 y 5 vulneración a través del mezclador de la CIJ, la escala de la barra = 100 nm. Diámetro (d) y polidispersidad índice (e) de polymersomes formado por FNP, medido por DLS. Para la comparación, polymersomes formado por rehidratación de película fina, con (TF-E) o sin protuberancia posterior (TF-NE), y formado por solvente dispersión (SD) también fueron medido, n = 3, barras de error representan la desviación estándar. Subfigures (c)-(e) tomado con permiso de Allen et al. ¹¹. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Carga de caracterización de la eficiencia y la endotoxina. (a) carga la eficiencia de las pequeñas y macromoléculas dentro polymersomes, n = 3, barras de error representan la desviación estándar. (b) ensayo de crudo azul LPS de polymersomes formado por FNP estéril, n = 6, barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Instrumento para el control mecánico del choque de la solución en el mezclador de la CIJ. (a) 24 V había cepillado Motor de DC. (b) alimentación (24 V, 2.5 A). (c) 4.5" movimiento precisión diapositiva con plomo del tornillo 1,27 mm (conectado al eje del motor mediante un acoplamiento de tornillo de la viga). (d) expulsión plataforma construida de chapas rectangulares en forma de L soportes de la esquina. mezclador CIJ (e) . (f) transporte de expulsión. (g) placa única Computadoras y 7" de pantalla táctil. (h) mMotor de mandos en caja de plástico (83 x 53 x 35 mm). (i) sensores IR (sensores de movimiento sin contacto break-beam). (j) botón de parada de emergencia (NC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Diagrama de cableado base. Se muestran las principales conexiones entre la sola computadora de tablero controlador de motor y sensores IR. Las conexiones de la pantalla táctil de LCD no aparecen aquí, ya que este componente es no esencial (los usuarios pueden optar por usar un monitor estándar de computadora y mouse en lugar de otro). Tenga en cuenta que en la configuración mostrada, la 24 V motor alimentación y fuente de alimentación de ordenador monoplaca son separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hemos incluido instrucciones detalladas para la fabricación rápida de polymersomes usando PEG₁₇-bl- PPS₃₅-SH como el copolímero del diblock. Polymersomes vesiculares son la morfología total primaria montada en esta relación de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloque molecular peso. Cuando afectado varias veces, tienen un diámetro y polidispersidad que polymersomes sacada a través de una membrana nm 200 después de ser formado por hidratación de película delgada. Este protocolo elimina así la necesidad de pasos adicionales de extrusión durante la fabricación de nanocarriers de polymersome monodispersa. Polymersomes formado mediante FNP carga carga hidrofílico e hidrofóbico y mantener la actividad biológica de las moléculas a través de la formulación proceso¹¹. Protocolos adicionales se describen para garantizar la esterilidad cuando sea necesario, que permite la formación de las formulaciones de polymersome que son libre de endotoxinas y por lo tanto adecuado para análisis bioquímicos e inmunológicos como seguro para la administración en vivo . El mezclador CIJ manual es fácil de configurar y proporciona facilidad de uso al usuario, pero introduce posibles problemas de control de calidad debido a la variabilidad del usuario. Para mantener la consistencia del flujo, se buscó crear un instrumento capaz de lograr y reproducible mantener un caudal comparable. Lo importante, en el anterior especifica dimensiones del canal, bombas de jeringa comercial no pueden alcanzar caudales suficientemente alta (~ 1 mL/s) debido a estar equipado con motores paso a paso de baja velocidad. Para combatir este problema y permitir un mayor control sobre el caudal, fabricación de una bomba de jeringa de alta velocidad para la FNP fue descrito. Se tuvo cuidado para utilizar open source y software fácilmente adaptable para el sistema OS y código.

Control sobre las tasas de flujo alternativo ofrece la posibilidad de ajustar la formulación nanocarrier y ofrece oportunidades para explorar más a fondo el conjunto de nanocarrier diversas morfologías. El número de Reynolds y el correspondiente tiempo de mezclado fue demostrado previamente para afectar el tamaño de núcleo macizo nanocarriers formado mediante FNP⁹, pero no está claro qué impacto tendría en la formación de polymersomes. Este es un tema de investigación actual con la actual dosis recomendada es de 0.5 a 2 mL/s, con los resultados representativos en, aproximadamente 1 mL/s. Para aumentar el control sobre la velocidad de flujo, puede ser necesario reemplazar el sistema operativo basado en Linux con control en tiempo real sobre el motor de la bomba de jeringa.

Aparte de ajustar la velocidad de flujo, hay varias maneras de que este protocolo FNP puede modificarse a las necesidades específicas de la suite o las aplicaciones. Pueden utilizarse más o menos grandes cantidades de polímero. Concentraciones tan altas como 100 mg/mL se han utilizado para formar nanocarriers estable y bajas como 1 mg/mL. Volúmenes más grandes pueden usarse para el choque, aunque consistente aplicación de presión durante la FNP basada en la mano es más difícil en volúmenes superiores a 1 mL por jeringa. También puede modificar el volumen del embalse. Final orgánico: relaciones solvente acuosos de mayor que 1:3 puede resultar en la formación incompleta de nanocarriers, y como tal debe tenerse cuidado para no disminuir el volumen del embalse sin confirmar la formación de nanocarriers. La agregación puede ocurrir cuando se intenta cargar las altas concentraciones de carga hidrofóbico, que generalmente se pueden aliviar mediante el aumento de la fracción molar de polímero: carga.

Un tema adicional abrir para la exploración es la ampliación de la formación de polymersome FNP para incluir otros sistemas de polímeros más allá de PEG -bl-PPS. De hecho, otros sistemas han sido utilizados previamente en la formación de micelas y droga de núcleo macizo nanocarriers^16,17. Sin embargo, no está claro si hay un conjunto de parámetros que pueden conducir a la formación de polymersomes mediante FNP utilizando los otros sistemas de polímeros. Dado el número de variables posibles a explorar, es enteramente posible que otros polímeros pueden formar polymersomes u otro nanoarchitectures suave mediante FNP con ajustados parámetros experimentales, tales como caudal, temperatura, solvente selección y concentración de polímero.

Como con todas las técnicas de formulación, hay restricciones que pueden hacer que ciertas aplicaciones insostenible y de FNP. El rápido proceso de mezcla requiere que los solventes orgánicos y acuosos miscibles, que impide el uso de algunos solventes comunes usados para la disolución de muchos copolímeros del diblock, por ejemplo, diclorometano y cloroformo. Algunos polímeros pueden por lo tanto resultar incompatibles con FNP si no son capaces de disolverse en un solvente orgánico miscible con agua. El protocolo FNP descrito aquí utiliza una proporción de 1:1 de materia orgánica al solvente acuoso, que puede disminuir la actividad de cargas sensibles a las altas concentraciones de disolventes orgánicos, como algunas proteínas bioactivas. Cabe señalar que las influencias en la bioactividad dependerá de la proteína, como previamente hemos encontrado efectos mínimos sobre la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina después de carga dentro de polymersomes FNP¹¹. Multi-entrada vortex mezcladores¹⁸ son una plataforma FNP más caro pero más personalizable que proporciona control adicional sobre la relación de orgánicos en disolventes acuosos, ofreciendo una alternativa versátil a mezcladores CIJ para estos contextos.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Reconocemos instrumentación y personal de apoyan de la instalación de biología estructural en la Universidad de Northwestern. Se reconoce el apoyo de la derecha Lurie integral cáncer centro de la Universidad Northwestern y la instalaciones de la Universidad noroeste de biología estructural. El detector de electrones directo de Gatan K2 fue comprado con fondos proporcionados por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust. También agradecemos a las siguientes instalaciones en Universidad del noroeste: el centro de ciencia de superficie interdisciplinario Keck, la instalación de biología estructural, la instalación de la proyección de imagen biológica, centro de imagen Molecular avanzada y el análisis Bionanomedicina equipo núcleo. Esta investigación fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias 1453576, Director de los institutos de salud nacional Premio innovador nuevo 1DP2HL132390-01, centro para la concesión de catalizador de nanomedicina regenerativa y el 2014 McCormick catalizador premio. SDA fue apoyado en parte por NIH predoctoral biotecnología formación Grant T32GM008449.