Avaliação da coagulação do Plasma no tecido do fígado em um modelo Animal grande na Vivo

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar experimentalmente a coagulação do plasma no tecido do fígado na vivo. Em um modelo de suínos, microcirculação é examinada pelo laser Doppler, profundidade de coagulação é medida histologicamente, temperatura no local de coagulação por termômetro infravermelho câmera termográfica e duto efeito de vedação é documentada por pressão de ruptura experimentos.

Coagulação do plasma como uma forma de eletrocautério é usada em cirurgia de fígado por décadas para selar a superfície de corte grande fígada após grande hepatectomy para prevenir hemorragias em um estágio posterior. Os efeitos exatos de coagulação do plasma no tecido do fígado são examinados somente mal. No nosso modelo de suínos, os efeitos de coagulação podem ser examinados perto a aplicação clínica. Um combinado do laser Doppler fluxômetro e espectrofotômetro documentos microcirculação muda durante a coagulação, a profundidade do tecido de 8 mm canaliza, fornecendo informações quantificáveis sobre hemostasia além da impressão clínica subjetiva. A temperatura no local de coagulação é avaliada com uma termômetro infravermelho prior e post coagulação e com uma câmera termográfica durante a coagulação, a medição da temperatura do feixe de gás não é possível devido o limite superior dos dispositivos. A profundidade da coagulação é medida microscopicamente em hematoxilina/eosina manchada seções após a calibração de um micrômetro de objeto e dá uma informação exata sobre a configuração-coagulação profundidade-relação de poder. O efeito da selagem é examinado em ductos biliares, como não é possível para um Coagulador plasma selar vasos maiores. São realizados experimentos de pressão de ruptura na explantados órgãos para governar para fora a pressão arterial relacionados com efeitos.

Coagulação de plasma de argônio (APC) é um instrumento amplamente utilizado em cirurgia abdominal por mais de três décadas,^1,2. É uma técnica padrão para a realização da hemostasia secundária depois de superfície para evitar posteriores hemorragias³de corte principal hepatectomy selando o fígado. Coagulação do plasma é uma forma especializada de radiofrequência eletrocautério, que fornece a energia elétrica através de um arco de gás ionizado. Fornecendo monopolar hemostática electrotécnico, esta técnica sem contacto tem a vantagem de prevenir o eletrodo para manter o tecido⁴. O feixe de gás ionizado é automaticamente direcionado para a área da menor resistência elétrica e é virado quando a resistência aumenta devido à dessecação para outras áreas ainda não ressecadas. Isso produz uma profundidade limitada uniforme de coagulação^5,6. Fatores que influenciam o efeito de coagulação são a ativação tempo, a potência do dispositivo da coagulação e a distância da sonda para o tecido. Hélio é outro gás de transporte, que pode ser usado para de coagulação do plasma⁷. Clínicos recentes estudos concentrados em desfechos clínicos, ao invés de^8,achados histológicos e funcional^3,9, enquanto estudos experimentais centrada-se em vitro investigações¹⁰ ou experimentos em órgãos perfundidos isolados¹¹.

O protocolo subjacente permite o estudo dos efeitos de coagulação do plasma em um modelo animal grande perto a aplicação clínica, usando o equipamento padrão humano em suínos: microcirculação é avaliada de forma não invasiva por um fluxômetro Doppler laser e Espectrofotômetro, que é uma ferramenta padrão clínica para esta indicação^12,13. Mudanças de temperatura durante a coagulação são monitoradas com um termómetro de infravermelho e uma câmera termográfica. A profundidade da coagulação é medida em hematoxilina/eosina histológica manchada seções após a colheita de amostras de tecido. Para a comparação com outros meios para hemostasia secundária, são realizados experimentos de pressão de explosão. Em contraste com as técnicas descritas anteriormente¹⁴, estas são realizadas em órgãos explantados excluir pressão arterial relacionados com efeitos. Além da descrito investigações sobre os efeitos locais de coagulação do plasma, testes de sangue padrão também possa ser realizado em modelo porcino.

Foram seguidas as regras regidas pela legislação alemã para estudos em animais, bem como princípios de laboratório Cuidado Animal (National Institutes of Health publicação Ed. 8, 2011). É dada permissão oficial do escritório governamental de cuidado animal (turismo für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemanha).

1. os animais

1. Use os porcos landrace alemão feminino (25-30 kg de peso) alojados em gaiolas abertas.
2. Use 5 animais por grupo (argônio e hélio).
3. Permitir que os animais se adapte ao ambiente pelo menos uma semana antes dos experimentos. Animais rápidos durante 24 h antes da cirurgia, com livre acesso à água.

2. anestesia

1. Bom os animais com uma injeção intramuscular de atropina (0,1 mg/kg BW), ketamina (15 mg/kg de peso corporal [BW]) e xilazina (10mg/kg BW) 10 minutos antes da indução da anestesia.
2. Acesso venoso periférico é estabelecido pela colocação de uma cânula de calibre 22, em uma veia da orelha.
3. Induzi anestesia geral por injeção intravenosa de propofol 2 mg/kg de peso corporal.
4. Coloque o animal na posição supina e realizar uma incisão longitudinal da pele no sulco jugular ao longo de um comprimento de 2 cm. Locate veia mediante a preparação romba do tecido subcutâneo. Inserir a cânula, então o fio de Seldinger.
5. Retrair a cânula e inserir 14 p. cateter sobre o fio-guia. Recue o fio guia. Conectar o cateter à extensão e fixar o cateter por uma cinta ou uma sutura.
6. Puxe a língua para fora e insira o laringoscópio reta. Use a ponta do laringoscópio para puxar para baixo a epiglote. Introduza o tubo pelas cordas vocais. Coloque a braçadeira no âmbito da glote e inflar.
7. Ventile com oxigênio de 40% em 20-26 respirações/min e um volume corrente de 10 ml/kg para manter a tensão de dióxido de carbono parcial end-tidal entre 36 e 42 mm Hg.
8. Manter a anestesia com isoflurano em uma concentração de 1-1,5% e fentanil em uma concentração de 3-4 µ g/kg/h.
9. Fornecemos a solução de lactato de Ringer em uma taxa inicial de 4 mL/kg/h e a aumentar após a laparotomia para uma taxa de infusão constante de 8 mL/kg/h.

3. cirurgia e coagulação do Plasma

1. Coloque o animal na posição supina sobre uma mesa cirúrgica padrão.
2. Desinfectar a pele através da aplicação de um desinfetante cirúrgico padrão (2-Propanol 45 g/100 g, 1-Propanol 10 g / 100g, bifenil-2-ol 0,2 g/100 g) com um cotonete cirúrgico por 3 vezes.
3. Realizar uma laparotomia mediana ampla do processo xifoide até o púbis com um bisturi e instalar retractores cirúrgicos.
4. Ligue o dispositivo de coagulação do plasma, abrir a garrafa de gás argônio ou hélio, dependendo o gás portador usados. Ajuste o fluxo de gás para a potência de saída de 3 L/min. coagulação selecionar dispositivo conforme desejado.
   Nota: Ambos os gases nobres, o argônio ou hélio, pode ser usados para a coagulação do plasma. Efeitos de coagulação são comparáveis. Consulte a referência⁷ para obter detalhes.
5. Execute coagulação do plasma no lobo esquerdo do fígado, como descrito anteriormente,⁷. Use um molde de titânio (abertura quadrada 1 x 1 cm²) para padronizar a zona de coagulação. Coagular por 5 s, com uma distância de sonda de 1 cm. Os coagulations com as configurações de energia diferentes podem ser executadas lado a lado com uma curta distância entre os coagulations de 5 mm (Figura 1).
6. Para a colheita do fígado, divida todas as conexões ligamentares para o fígado. Isolar e dividir o pedículo hepático acima a flexão duodenal superior deixando partes longas de veia porta e ducto biliar comum. Dividir a veia cava acima e abaixo do fígado e recuperar o órgão.
7. Depois da colheita, o fígado, os porcos foram sacrificados por administração intravenosa de 0,16 g/kg BW pentobarbital.
8. Para os experimentos de pressão de ruptura, metade do lobo hepático medial esquerdo ressecção com tesoura afiada. O corte de plasma-coagular (100W de potência de saída) de superfície ou selar a superfície de corte com selante de fibrina (Figura 2).

4. a microcirculação medição

Nota: Espectroscopia Doppler Laser pode determinar o fluxo de sangue no tecido através da medição o efeito Doppler causado pelo movimento de eritrócitos. O sinal do Laser se correlaciona com o número de eritrócitos em movimento. Espectroscopia Doppler laser está em uso clínico (por exemplo, transplante de medicina) e tem sido validado várias vezes¹⁵.

1. Ligue o medidor de fluxo Doppler laser e Espectrofotômetro. Use uma sonda plana.
2. Tome medidas de linha de base para o fluxo e a velocidade. Salvar ou anotar os valores.
3. Realize a coagulação conforme descrito abaixo dos 3,5.
4. Coloque a sonda plana em sites de coagulação e medida de fluxo e velocidade. Mais uma vez, salvar ou anotar valores.
5. Repita para todas as configurações de energia do dispositivo coagulador.

5. temperatura medição

1. Alternar o sistema (câmera termográfica, caderno e termômetro infravermelho) e deixá-lo correr pelo menos 1h antes de realizar as medições.
2. Ajustar o foco e ver os quadros da câmera termográfica no site da coagulação. Sequências de infravermelhas podem ser detectadas com a resolução espacial de 1024 x 768 pixels com uma resolução de temperatura maior que 20 mK. Ter em conta, que a região da coagulação e do tecido circundante — afectados pela transferência de calor — situa-se no meio da exibição.
   Nota: Deve incluir tantos pixels do quadro quanto possível para uma ótima resolução espacial.
3. Registar o processo de coagulação com o Coagulador plasma na superfície do fígado com a câmera termográfica durante um período de 2-min.
4. Analisar sequências de imagem com o software de análise de Termografia: definir regiões de interesse.
   Nota: O Software calcula o curso da temperatura média correspondente ao longo do tempo.

6. medição de profundidade coagulação

1. O lobo hepático medial esquerdo da colheita com uma tesoura afiada.
2. Impostos especiais de consumo os sites de coagulação com 1 cm de espessura. Cortado em segmentos longitudinais espessura de 3 mm para processamento adicional.
3. Amostras de tecido Fix a 4 ° C durante a noite com neutro 10% tamponada de formalina. Aqueça a parafina 2 ° C, sobre o ponto de fusão e incorporar as fatias. Processo durante a noite.
4. Realize a coloração de hematoxilina/eosina.
   1. Deparaffinize e hidratar o tecido posteriormente mergulhando em 2 x xileno, 100% de etanol (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, deionizada H₂O por 2 min cada.
   2. Manche a amostra de tecido com solução de hematoxilina Meyer por 3 min.
   3. Agora lave na água da torneira por 5 min.
   4. Manche o tecido com solução de eosina por 3 min.
   5. Enxaguar em 2 x EtOH 95% e, em seguida, xileno por 3 min cada. Monte com o meio de montagem padrão.
5. Ligue o sistema (microscópio câmera conectada, software de imagem). Ver todas as secções com ampliação de 40 X.
6. Criar a imagem de um micrômetro de objeto em uma ampliação de 40 X. Recalibrar pressione o botão na janela de objectivos. Selecione calibração manual. Desenhe uma linha na imagem micrômetro de 100 µm. Enter 0,1 mm de caixa de diálogo e pressionar Okey.
7. Selecione o comprimento no modo de exibição > controles de análise > janela de anotações e medições. Medida da superfície do fígado à margem de coagulação com o mouse. Exportar ou observe o resultado. Repita a medição em outro local no mesmo slide.
   Nota: Profundidade de coagulação pode ser facilmente diferenciada do tecido hepático normal pela margem afiada entre os cordões de hepatócitos normais e a zona de necrose com citoplasma encolhida, núcleos picnóticos e zonas de hemorragia.
8. Calcule a média de duas medições.

7. explosão de medição de pressão

1. Ligue o sistema (bombas automáticas, medidor de pressão). Prepare as amostras de fígado de acordo com a etapa de 3.7.
   Nota: Use duas bombas paralelas ligadas através de uma torneira de 3 vias. A pressão máxima de 1.500 mm Hg não pode ser obtida com uma única bomba.
2. Isole a veia porta, artéria hepática comum e ducto biliar com tesoura no pedículo tátil. Prenda a veia porta com uma pinça overholt e ligate com uma sutura monofil 4-0. Fixar a artéria hepática comum uma pinça overholt e ligate com uma sutura monofil 4-0.
3. Insira o cateter Ch-16 no ducto biliar comum e ligate com uma sutura de seda 2-0. Conectar o cateter às bombas automáticas, instalar a torneira de 3 vias com medidor de pressão (Figura 3).
4. Encha a seringa de perfusão com soro fisiológico.
5. Comece bombas automáticas com uma taxa de entrega de 99 mL/h.
6. Monitorar o medidor fígado corte de superfície e pressão para pressão de ruptura de escapamento e registro.
   Nota: Para mais fácil reconhecimento de fugas, azul patente pode ser adicionado à solução salina (azul patente 2ml + soro 18ml). É mais fácil de observar a pressão de ruptura até notar o tempo de perda de pressão no medidor de pressão.

Microcirculação: Utilizar o dispositivo de diagnóstico para hemostasia após a coagulação do plasma pode ser demonstrada por alterações da microcirculação. Sangue capilar fluxo (exibido como unidades arbitrárias (AU)) diminui de um valor de base de 142.7 ± 76.08 AU para 57.78 ± 49.57 AU em 25 W dispositivo potência, para 48,5 ± 7.26 AU em 50 W e para 5,04 ± 1,31 AU em 100 W (Figura 4).

Temperatura: Temperatura dos locais de coagulação foi medida com uma câmera termográfica (Figura 5). As mudanças de temperatura somente insignificante foram documentadas com um termómetro de infravermelho. Ele mostrou uma temperatura de base de 32.42 ± 2,27 ° C. Após a coagulação com 25 W, a temperatura era de 33.33 ± 1,81 ° C. Coagulação com laser 50 W rendeu uma temperatura de ± 31.17 2,13 ° C. Após a coagulação com a potência máxima de 100 W, a temperatura era na maior parte inalterada com 30,17 ± 3,19 ° C (Figura 6).

Profundidade de coagulação: Coagulação do plasma cria uma zona superficial de necrose com pode ser facilmente distinguida do parênquima hepático normal (Figura 7). A profundidade de necrose pode ser medida em várias seções e mostra um aumento não é completamente linear com aumento dos níveis de energia do coagulador plasma. Após a coagulação do plasma de hélio, a profundidade da coagulação é 230.2 ± 57.83µm em 25W, 314.6 ± 87.39 µm em 50 W, 292.2 ± 45.65 µm em 75W e 412.9 ± 160,9 µm em 100 W dispositivo potência (Figura 8). A potência de saída do dispositivo pode ser escolhida livremente e escolheu uma correlação positiva com coagulação profundidade⁷.

Pressão de ruptura: Medições de pressão de ruptura não realizados na superfície de corte do lobo hepático medial esquerdo explantados mostra nenhuma diferença depois de hélio (1254±578.7 mmHg) ou coagulação de plasma argônio (1003 ± 554.4 mmHg) (Figura 9). Pressões de ruptura são mais baixos em comparação com Selantes de fibrina⁷ mas parecem adequadas para uso clínico.

Figura 1: lobo hepático medial esquerdo após a coagulação do plasma de argônio. Oito sites de coagulação no lobo hepático medial esquerdo (da parte superior esquerda para embaixo à direita: 10 W, 15 W, 20 W, 25 W, 30 W, 50 W, 75 W, 100 W). A extensão da coagulação padronizada com o molde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: preparação do enxerto hepático para medições de pressão de ruptura. Metade do fígado lobo é ressecado, e superfície de corte fígado é vedado com selante de fibrina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: equipamento para medições de pressão de ruptura. Bomba automática (seringa preenchida com solução salina) e medidor de pressão ligado através de uma torneira de 3 vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: alterações da microcirculação. Alterações no sangue (exibido como unidades arbitrárias) antes e após a coagulação de plasma de argônio com 25 W, 50 W e dispositivo de 100 W potência de saída (n = 3-6). * = P< 0.05, 1-way ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: temperatura em locais de coagulação medido com uma câmera termográfica. A exemplar imagens com uma câmera termográfica durante a coagulação do plasma Hélio com dispositivo de 40W de potência de saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: temperatura em locais de coagulação medido com um termômetro infravermelho. A temperatura dos locais de coagulação medida com um termómetro de infravermelho antes e após a coagulação do plasma de argônio (n = 3-6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: zona de necrose superficial após a coagulação do plasma de hélio. Hematoxilina/eosina manchados fígada seção ampliação de 40 X. A zona de necrose mostra uma perda de arquitetura de cabo de hepatócitos, células com citoplasma encolhida e zonas de hemorragia. As setas indicam a profundidade da coagulação em dois locais diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: profundidade de coagulação após a coagulação do plasma de hélio. Profundidade de coagulação em níveis diferentes de potência (25W, 50W, 75W e 100W, n = 6). * = P< 0.05, * * * = P< 0,001, 1-way ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: pressão de ruptura. Estourar as medições da pressão na superfície de corte fígada após coagulação de plasma de argônio ou hélio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: resultados do teste de sangue. Selecionados parâmetros de gás bioquímica e sangue clínico, os resultados são mostrados antes e seguir coagulação de plasma de argônio. Não há mudanças significativas ocorrem, demonstrando os efeitos de coagulação do plasma limitada a alterações locais no site da coagulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Modelos de roedores para cirurgia hepática são estabelecidos por um longo tempo¹⁶. No entanto, grandes modelos animais oferecem certas vantagens: nenhum equipamento microcirúrgico é necessária como equipamento operacional padrão para os seres humanos pode ser aplicado, técnicas cirúrgicas são comparáveis para uso clínico e métodos de avaliação clínica padrão podem ser transferido para os experimentos. Por exemplo, testes de sangue padrão clínico pode ser realizado sem a necessidade de métodos de ensaio de laboratório especial (Figura 10).

Suínos são animais de laboratório adequado para investigação cardiorrespiratória como sua fisiologia se assemelha a humana¹⁷. Por causa da similaridade no tamanho, estrutura segmentar e histologia, os porcos são também um dos animais de padrão de laboratório para cirurgia experimental hepática¹⁸. Coagulação do plasma foi avaliada no modelo de suínos devido a benefícios (semelhança com a fisiologia humana e avaliação de equipamento clínico padrão)⁷. Em contraste com as técnicas cirúrgicas, gestão de anesthesiologic não pode ser extrapolado facilmente. Especialmente a gestão das vias respiratórias pode ser difícil¹⁷. A distância entre os incisivos para a glote é muito longa e a anatomia é diferente para os seres humanos, dificultando a intubação orotraqueal para o pesquisador inexperiente. Além disso, a ventilação máscara é quase impossível em porcos, então estratégias de salvamento (por exemplo, traqueostomia) devem estar presentes.

Para obter resultados comparáveis em coagulação do plasma, o pesquisador deve estritamente tomar atenção para padronizar a distância da sonda e a duração da coagulação. Enquanto é relativamente fácil de manter a distância de sonda, um cronômetro pode ser usado para contar os 5 s da coagulação. A técnica descrita de coagulação do plasma na superfície do fígado foi usada em pesquisa básica sobre os efeitos subjacentes de coagulação do plasma no fígado em vivo⁷. As técnicas descritas acima de coagulação de anestesia, cirurgia e plasma suína também podem ser usadas para examinar o grande ressecção hepática e comparar as diferentes técnicas de superfície de corte depois de vedação.

O medidor de fluxo Doppler laser o espectrofotômetro para medições de microcirculação é uma ferramenta clínica padrão¹⁹ e provou para ser muito útil para a avaliação da circulação diretamente sobre o parênquima do órgão. Valores para o fluxo de sangue e velocidade do fluxo de sangue são calculados com a vantagem de não-invasivity. Microcirculação parâmetros só estão medidas indirectas do efeito de coagulação, para que medições Doppler devem ser correlacionadas com um parâmetro objetivo para a coagulação. Em nossos experimentos, usamos profundidade histológica de coagulação para correlação.

Uma lacuna da medição da temperatura é a incapacidade de medir a temperatura do feixe de plasma durante a coagulação, porque a temperatura do feixe de plasma estiver acima do limite superior de ambos os dispositivos. O termômetro infravermelho é fácil de aplicar, Considerando que a instalação de câmera termográfica é mais complexa, mas fornece dados mais precisos. A temperatura de base antes de coagulação é inferior ao esperado (porcina corpo temperatura ~38.5 ° C¹⁷), demonstrando os efeitos pertubadores da laparotomia na temperatura corporal. A temperatura medida não aumenta durante e após a coagulação, demonstrando a excelente perfusão do fígado. Este efeito térmico roubando do fígado é conhecido de radiofrequência ablação²⁰. Gerências de pressão de explosão foram conduzidas no sistema de ductos biliares, em vez de vasos hepáticos por uma razão simples: é impossível para coaguladores plasma (como para selantes de fibrina) para selar os vasos maiores. Ambos os meios da hemostasia secundária Selem a superfície de corte do órgão ressecado, enquanto os maiores navios são ligados durante a ressecção. Nossos experimentos de pressão de explosão foram ligeiramente modificados em comparação com o relatado técnica¹⁴. Medimos a pressão de ruptura em órgãos explantados por motivos organizacionais. Estas regras fora pressão arterial relacionados com efeitos e são muito mais fáceis de aplicar do que para uso perfundidos ou órgãos in vivo . Valores da pressão experimentos podem, portanto, diferir perfundidos / mediçõesin vivo devido a fígado alterada estruturam (geralmente altas pressões sobre órgãos explantados). A técnica de pressão de ruptura acima descritas também pode ser realizados in vivo.

Os autores não têm nada para divulgar.

Os autores têm sem agradecimentos.