Custom Engineered moldes de cultura de tecidos de Masters gravados a Laser

Aqui apresentamos um método rápido, fácil e baixo custo para a fabricação de moldes de polidimetilsiloxano personalizado que podem ser usados para a produção de tecidos de engenharia baseada em hidrogel com geometrias complexas. Adicionalmente descrevemos os resultados de avaliações mecânicas e histológicos realizados na engenharia tecidos cardíacos produzidos utilizando esta técnica.

Como o campo da engenharia de tecidos tem continuado a amadurecer, tem havido crescente interesse em uma ampla gama de parâmetros de tecido, incluindo a forma de tecido. Manipulando a forma de tecido sobre o micrômetro para escala centímetro pode direcionar o alinhamento da célula, alterar propriedades mecânicas eficazes e resolver limitações relacionadas com a difusão de nutrientes. Além disso, o recipiente em que um tecido é preparado pode transmitir restrições mecânicas no tecido, resultando em campos de stress que mais podem influenciar a estrutura da célula e a matriz. Em forma de tecidos com dimensões altamente reprodutíveis também tem utilidade para ensaios em vitro no qual amostra dimensões são críticos, tais como tecido de toda a análise mecânica.

Este manuscrito descreve um método alternativo de fabricação utilizando moldes mestre negativos, preparados a partir de acrílico gravada a laser: Estes moldes executar bem com polydimethylsiloxane (PDMS), permitem projetos com dimensões na escala de centímetros e recurso tamanhos menores que 25 µm e pode ser rapidamente projetada e fabricada a baixo custo e com experiência mínima. Os requisitos de custo e tempo mínimo permitem moldes gravadas a laser que será rapidamente em cima até um projeto ideal é determinado e ser facilmente adaptadas para se adequar a qualquer ensaio de interesse, incluindo aqueles além do domínio da engenharia de tecidos.

Nas últimas duas décadas, litografia macia tem sido amplamente utilizada como uma técnica de fabricação para apoiar a investigação científica, nomeadamente nos domínios da microfluídica, pesquisa de materiais e tecidos engenharia^{1,2, 3}. Moldagem de réplica, na qual um objeto com uma forma desejada é criado a partir de um molde negativo de mestre, oferece um conveniente e de baixo custo método de produzir positivo que PDMS Replica que pode ser usado para fundição em forma de hidrogel. No entanto, os moldes de mestre negativos necessários normalmente são produzidos usando técnicas microfabrication que são caro, demorado, limitado em tamanho, e exigem espaço de sala limpa e equipamentos sofisticados. Enquanto a impressão 3D oferece uma alternativa potencial, sua utilidade é limitada devido aos limites da resolução de impressoras de baixo custo e as interações químicas entre polímeros de impressora 3D comuns e PDMS que pode inibir a polimerização.

Sistemas de cortador laser capaz de corte e gravura materiais tais como plástico, madeira, vidro e metal tornaram-se recentemente drasticamente menos caro e, portanto, mais acessível para a fabricação de ferramentas de pesquisa. Cortadores de laser da classe comercial são capazes de fabricar objetos na escala de centímetros com características mínimas menores que 25 µm e requerem mais treinamento mínimo, conhecimentos e tempo para usar. Enquanto a ablação a laser de PDMS foi anteriormente usada na fabricação de dispositivos de microfluídica, para o nosso conhecimento nenhum manuscrito descreveu um processo pelo qual milímetros e centímetros escala moldes podem ser fabricados de laser cortar moldes mestre negativos⁴ .

Usamos esta técnica principalmente para manipular a forma dos tecidos projetados para melhorar a difusão de nutrientes, o alinhamento celular e propriedades mecânicas^5,6,7. No entanto, a versatilidade desta técnica permite a utilização em qualquer campo onde hidrogel moldados é de interesse, tais como drogas entrega e material ciência pesquisa⁸. Com acesso a um cortador do laser, PDMS molde repetições podem ser feitas para quase qualquer geometria sem saliências (que iria inibir a remoção sem um molde multi-parte, que está além do escopo deste manuscrito) e que se encaixa dentro das dimensões da cama do laser.

1. criar projetos de molde a vetor formato Master

1. Montar a geometria do molde desejado em formato vetorial usando um programa de gráficos vetoriais (ver materiais, equipamentos e tabela de Software). Selecione o arquivo | Nova e criar uma tela de dimensões apropriadas com formato de cor RGB. Crie a geometria desejada usando as ferramentas de forma no painel da esquerda: digite as dimensões desejadas na parte superior da janela (clique no botão transformar no topo se não inicialmente visível) para definir precisamente os tamanhos de forma.
   Nota: Geometrias de molde deverá permitir pelo menos uma fronteira de 6 mm entre a borda das características ultraperiféricas da linha de corte para permitir a remoção do menisco PDMS após a fundição do molde. Isso permitirá que o molde terminado para leigos nivelado com o fundo de um prato de cultura. Além disso, geometrias de molde devem levar em limitações de consideração associadas com o modelo de cortador do laser que será usado, incluindo largura de corte e tamanho mínimo de recurso. O laser usado para o trabalho descrito neste documento (ver materiais, equipamentos e tabela de Software) apresentava uma largura de corte de 0,2 mm e um tamanho mínimo recurso gravado de 25 µm (DPI máximo de 1.000). Dimensões do molde podem ser escolhidos para acomodar um navio cultura desejada, como um prato de 10 cm, ou 6 - ou 24-bem placas.
2. Abra o seletor de cores no canto superior esquerdo da janela e definir novas amostras de cores compatíveis com o software do cortador do laser.
   Nota: Nós usamos vermelho (RGB 255, 0, 0) para o corte e azul (RGB 0, 0, 255) para gravura. Amostras adicionais podem ser definidas dependendo dos requisitos para o projeto (por exemplo, se mais de uma gravura profundidade é desejada).
   1. Atribua essas cores de amostra para caminhos de corte selecionando o caminho e, em seguida, selecionando a amostra de corte para a cor do caminho e [Nenhum] para a cor de preenchimento no seletor de cores.
3. Da mesma forma, atribua cores amostra a gravura caminhos, selecionando o objeto e selecione o caminho de gravura para a cor de preenchimento e [Nenhum] para a cor do caminho no seletor de cores.
4. Salve projetos como formatos de arquivo de 300Kb de either.ai, dependendo do vetor gráficos programa e laser cortador compatibilidade (figura 1A e Arquivo complementar).

2. corte os moldes de acrílico Master de laser

1. Selecione um material de molde mestre negativo.
   Nota: Quarto-polegada grosso acrílico é bem adequado para esta aplicação, devido à sua compatibilidade com corte a laser, custo relativamente baixo e espessura que permite recursos até ~ 5,5 mm de altura. Contudo, outros materiais que satisfaçam as condições seguintes podem ser utilizados também: (i) não-reativo com PDMS cura; (ii) não-porosa/fortemente adesivo para PDMS curado; (iii) corta e grava de forma limpa com um cortador do laser; (iv) mantém um vítreo do estado até 60 ° C; (v) de espessura compatível com a altura máxima de característica desejada.
2. Prepare o cortador do laser para o corte de acordo com as especificações do fabricante. Certifique-se que é usada uma ventilação suficiente e que a altura da cama é devidamente calibrada para a espessura do material escolhido molde mestre negativo.
3. Abra o arquivo de projeto em um programa de gráficos de vetores no computador conectado ao cortador do laser e clique arquivo | Impressão. Certifique-se de que o cortador do laser é definida como a impressora e que "Não escala" é selecionado no Scaling deixe cair para baixo o menu para evitar distorção do desenho antes de clicar no botão Imprimir na parte inferior da caixa de diálogo de impressão.
4. No utilitário de impressão de cortador do laser, clique no botão configurações no canto inferior direito. Atribua poder, velocidade e pulsos por polegada (PPI) configurações para cada uma das cores previamente escolhidas para definir parâmetros de corte/etch para todas as características de projeto.
   Nota: Aqui, o laser cortador equipado com um 75 W a laser (ver materiais, equipamentos e tabela de Software), configurações usadas dos seguintes: poder de 100%, 1% da velocidade e 1.000 PPI limpamente corta ¼" acrílico; 100% de potência, velocidade de 8% e 500 PPI grava a uma profundidade de 2,75 mm em acrílico; e 5% de 100% de potência, velocidade, 500 PPI grava a uma profundidade de 3,50 mm de acrílico. Se desconhecido para uma configuração de cortador do laser ou material, esses parâmetros podem ser determinados empiricamente através de tentativa e erro com um pedaço de teste.
5. Clique o botão verde grande no software do cortador do laser, a laser etch e cortar os moldes mestre negativos.
6. Prepare os moldes mestre negativos para fundição de PDMS, removendo todos os resíduos de corte residual com pincéis pequenos e/ou ar comprimido (figura 1B).

3. preparar os moldes PDMS para celular ou cultura de tecidos

1. Prepare uma mistura de fundição de PDMS de acordo com as especificações do seu fabricante. Prepare-se 0,35 mL/cm² do molde mestre; Isso irá variar com base nas características do molde e altura.
2. Degas o PDMS preparado em uma câmara de vácuo conectado a uma linha de vácuo de laboratório padrão (< 500 mmHg) por 1h, ou até todas as bolhas foram eliminadas.
3. Fita da borda externa do molde com vinil ou fita adesiva (rótulo colorido fita funciona bem), tal que a fita se estende > 3 mm acima da face gravada do molde mestre negativo. Pressione a fita firmemente contra o lado do molde para evitar vazamentos mais tarde.
   Nota: Se o molde mestre acrílico apresenta através de furos, pode ser necessário aplicar fita à parte inferior do molde também (Figura 1).
4. Despeje o PDMS desgaseificado sobre o rosto gravado do molde mestre negativo.
   Nota: O alvo de espessura PDMS dependerá da aplicação, apesar de PDMS espessura do molde fundos pode fazer imagem desafiadora. Uma espessura mínima de ~ 1.5 mm atinge um bom equilíbrio entre as considerações de imagens e a facilidade de remoção do molde.
5. Coloque o molde mestre negativo PDMS-revestido em uma câmara de vácuo e desgaseificar novamente por 1h, ou até todas as bolhas foram eliminadas.
6. Coloque desgaseificado PDMS-revestido negativo mestre molde em um forno de 60 ° C para curar pelo menos 6 h. Certifique-se de que a prateleira do forno é de nível. Alternativamente, permitir que o PDMS curar a 37 ° C durante a noite, ou à temperatura ambiente para ~ 72 h.
7. Se vários moldes foram lançados no mesmo molde mestre negativo, use uma lâmina de barbear para cortar estes moldes separados enquanto elas ainda estão no molde mestre negativo. Em seguida, descasque cada molde PDMS fora o molde mestre negativo. Certifique-se de que os moldes PDMS são recolhidos lentamente e com cuidado para evitar o recurso de molde rasgar durante a coleta.
8. Usando uma lâmina de barbear, retire as regiões com o menisco do casting, que impediria o molde de material liso, bem como qualquer excesso mentiroso ou detritos (Figura 1).
9. Se necessário, prepare moldes para fundição de célula/tecido por autoclavagem.

4. molde o colágeno e fibrina hidrogel tecidos

Nota: Use um procedimento asséptico adequado para manter a esterilidade.

1. Aderem os moldes para o fundo da embarcação desejada. Aderir a novo moldes para o fundo de uma placa de cultura de não-tecidos Tratado pressionando firmemente o molde contra o plástico não tratado (devido a hidrofobicidade de PDMS).
   Nota: No entanto, se a cultura de tecidos tratados policarbonato é para ser usado, ou no caso de moldes re-utilizados, que tendem a aderir menos firmemente, uma cola natural ou sintética (como selante de fibrina ou silicone curado durante a noite) pode ser usada para garantir a fixação.
2. Prepare o fibrinogênio, trombina e neutralizado colágeno Projetando soluções, tal que a concentração desejada de cada um será alcançada no tecido molde. Manter o colágeno no gelo até a fundição.
   Nota: Fibrinogênio e trombina não devem ser permitidos para misturar até imediatamente antes da fundição. Se necessário, as soluções de fibrinogênio e a trombina podem também ser refrigeradas para aumentar o tempo de polimerização. Nós usamos uma concentração de fibrinogênio final entre 0-8 mg/mL, uma concentração de trombina final entre 10 a 100 U/mL e uma concentração final de colágeno entre 0,8 - 2,0 mg/mL (Figura 2). Para tecidos cardíacos projetados, muitas vezes usamos cardiomyocytes 12 x 10⁶ células/ml, com 1,6 mg/mL, fibrinogênio 4mg/mL e 20 trombina U/mL (trombina é adicionada imediatamente antes da fundição). Optimal concentrações (mesmo fora destes intervalos sugeridos) devem ser determinadas empiricamente.
3. Colheita de células a seguir protocolos padrão e ressuspender em concentrações adequadas para atingir a densidade de pilha inicial desejado no tecido molde.
   Nota: Cardiomyocytes humanas pluripotentes induzidas de células-tronco derivadas foram colhidas conforme descrito no Lian et al . ⁹ manter as células colhidas no gelo. Volume de células deve ser contabilizado ao preparar a suspensão de eritrócitos. Nós usamos concentrações de células que variam de 9 a 18 x 10⁶ células/mL, embora intervalos ideais são esperados para variar com população celular (Figura 2).
4. Combine o fibrinogênio, colágeno neutralizado e suspensão de células (consulte a etapa 4.2 por exemplo) para criar uma mistura de fundição. Mantenha a mistura de fundição no gelo.
   Nota: Concentrações e temperaturas de fibrinogênio e trombina irão determinar a cinética de polimerização; a fim de evitar a polimerização durante a fundição, pode ser necessário preparar lotes separados da carcaça mistura dependendo do número e volume das construções que serão lançados.
5. Tratar as superfícies do molde que será exposto para a mistura de fundição para mitigar a hidrofobicidade PDMS (hidrofobicidade PDMS irá aumentar a adsorção de proteínas e dificultar a carcaça).
   1. Alcançar a modificação da superfície hidrofílica, tratando com plasma de oxigênio, como com um gerador portátil de alta frequência (por exemplo, BD-20A de Litton engenharia). Expor todas as superfícies do molde que entre em contato com a mistura de célula/gel para o tratamento de plasma para 3-5 s, cerca de 5 min antes de fundição.
   2. Alternativamente, trate com um surfactante, como Pluronic F-127 (1% p/v)¹⁰. Realize o tratamento de superfície como perto do carcaça de tempo possível, como a mudança de polaridade irá deteriorar-se ao longo do tempo.
6. Imediatamente antes da fundição, adicione a trombina para a mistura de fundição e mistura completamente pipetando para cima e para baixo sem a introdução de bolhas.
7. Trabalhando rapidamente, pipetar o mix de fundição em moldes, usando conta depositar a mistura em todos os cantos e fendas do molde. Evite a ejeção de pipeta, além da primeira parada para evitar a formação de bolhas dentro as construções.
8. Repita as etapas de 4.6 e 4.7 conforme necessário para qualquer lotes adicionais de mistura de fundição.
9. Coloque o recipiente de cultura de tecido em uma incubadora de 37 ° C por 45 min. Se a incubadora não é bem úmida, deposite mídia celular ao redor os moldes antes da incubação, para prevenir a desidratação de construção.
   Nota: O tipo de mídia de célula dependerá o tipo de célula, mas para construções de engenharia de tecido cardíaco usamos RPMI 1640 + suplemento B27.
10. Depois de 45 min, retorne as construções para o capô e tampa com mídia de célula antes de retornar para a incubadora.
11. Alterar a mídia de célula cada 48-72 h conforme necessário para a célula e construir o tipo.
    Nota: A mudança de mídia deve ser planejada segundo as instruções recomendadas fornecidas pelo fornecedor para garantir a saúde celular máxima. Tome cuidado ao mudar os meios de comunicação para evitar perturbar as construções. Não vivemos problemas com construções flutuante, mas se isso ocorrer, pode ser evitada adicionando altos postos para o projeto de molde que se estendem para além do nível de mídia.
12. Após o uso, lavar os moldes sequencialmente com 10% de lixívia, etanol a 70% e água destilada. Depois do ar seco e autoclave para reutilização até ~ 10 vezes.

5. análise técnicas: Tecido de compactação

Nota: Compactação resultante da remodelação da matriz é um indicador de viabilidade de tecido e desenvolvimento que pode ser facilmente medido através da análise de microscopia e imagem óptica.

1. Recolha imagens de microscopia óptica das construções nos moldes em incrementos de tempo variando de 2 h para 96 h após a fundição.
   Nota: Devido ao baixo grau de ampliação necessária, um microscópio de dissecação com um monte de câmera é bem adequado para esta aplicação.
2. Rastrear a área de construção visível em uma suíte de análise de imagem tais como ImageJ (código-fonte aberto, imagej.nih.gov/ij/).
3. Analise a taxa e o grau final de compactação (Figura 2).

6. análises técnicas: Teste de tração

Nota: Ambos mecânica ativa (forças ou tensões geradas por um tecido projetado por causa da atividade das células) e passiva mecânica (forças ou tensões geradas em resposta às tensões aplicadas ou forças) é características funcionais críticas de muitos engenharia tecidos e isto é particularmente verdadeiro para os tecidos cardíacos engenharia. O analisador Micromecânico usado para as análises é descrito na Tabela de materiais. Outros aparelhos de testes mecânicos poderiam ser aplicados da mesma forma assumindo que eles permitem testar hidratado e são capazes de controle do comprimento e forçar a medições por escalas e resoluções pertinentes para o tecido. Para tecidos com áreas transversais da ordem de milímetros quadrados simples e stiffnesses da ordem de dezenas de kPa, uma célula de carga de 5 mN é um bom ajuste. Materiais de maiores e mais aguerridos exigiria uma célula de carga maior. Antes do teste, certifique-se de que o transdutor de força e o controlador de comprimento são devidamente calibrados.

1. Ligue o controlador de comprimento, forçar o transdutor, gerador de pulso e controlador de temperatura.
2. Encher o cocho de teste mecânico com solução de Tyrode (1,8 mM de cloreto de cálcio, 1,0 mM de cloreto de magnésio, 5,4 mM de cloreto de potássio, 140 mM de cloreto de sódio, fosfato de sódio 0,33 mM, 10 mM HEPES e glicose de 5 mM em ddH₂O, pH ajustado para 7,4) para Engenharia de tecidos cardíacos. Ajuste o termopar, tal que um banho temperatura de 37 ° C foi alcançada.
3. Carrega um protocolo de teste mecânico para coletar dados de contração ativa.
   Nota: Nós avaliamos mecânica contrátil ativa usando um protocolo de passo de comprimento no qual comprimento passos em 5% tensão incrementa até 30% são detidos por 120 s para avaliar o impacto da pressão sobre a força de contração (Figura 3A). Além disso, nós avaliamos passivas propriedades mecânicas através de um protocolo de tração-para-pausa a uma taxa de tensão constante de 10% tensão/min (Figura 3B). Ambos estes protocolos podem servir como bons pontos de partida para análise mecânica ativa e passiva.
4. Sob um escopo de dissecação, cuidadosamente desanexe a construção de tecido engenharia do molde PDMS, tal que está flutuando livremente.
   Nota: Construções compartimentadas que sofreram compactação de tecido serão provavelmente já desanexadas da superfície interior do molde, e nesses casos a manipulação mínima é necessária.
   1. Se a compactação não tenha causado a construção liberar, usar fórceps para separar suavemente a construção dos lados e fundo do molde para não danificar o tecido.
5. Delicadamente usando fórceps, buscar a construção e transferi-lo para o banho de teste mecânico.
6. Vendo a construção através de um microscópio de dissecação, monte ou final de construção para os ganchos anexado para o transdutor de força e braço de alavanca.
7. Ajuste a posição do braço de alavanca usando o micromanipulador, até que a construção é posicionada sem tensão aplicada. Zero do controlador de comprimento e forçar o controlador.
8. A construção através do escopo de dissecação da imagem para que as dimensões da construção podem ser medidas através de análise de imagem.
9. Iniciar o protocolo de força activa e salvar o coletados dados uma vez que o protocolo foi concluída (Figura 3).
10. Se passiva dados mecânicos também são necessários, ajuste o braço de alavanca novamente até que haja zero deformação aplicado. Zero o comprimento e forçar os controladores e a construção de um segundo de imagem antes de carregar e iniciar o protocolo de mecânica passiva (Figura 3). Salve os dados coletados.

7. análise técnica: Parafina histologia e imunohistoquímica

Nota: Tivemos o maior sucesso em secções de tecido projetado usando blocos de parafina, para que a morfologia do tecido é melhor preservada por imagens. Todas as etapas do processo devem ser cuidadosamente consideradas e costuradas no tecido projetado, incluindo o processamento de amostras sem pressão ou de vácuo, empiricamente determinar os métodos de recuperação de antígeno apropriado e titulação do anticorpo primário concentração. Outras técnicas, como o uso de blocos congelados para a preparação de slides, podem exigir menos tempo e despesa enquanto produzindo resultados suficientes, dependendo da aplicação pretendida.

1. Sob um escopo de dissecação, cuidadosamente desanexe a construção de tecido engenharia do molde PDMS usando fórceps deslizado entre a construção e PDMS para suavemente separa o PDMS, tal que está flutuando livremente. Transferi essas construções para um tubo de microcentrifugadora para fixação.
   Nota: Construções frágeis ou aqueles fixado sob a condição de stress estático fornecida pelo molde em si podem ser fixados no molde alterando soluções na cultura bem e removendo a construção do molde após a fixação.
2. Corrigi imediatamente os tecidos projetados submergindo em paraformaldeído 4% (PF) por 10 min à temperatura ambiente. Estimar a não mais de 1 h por 1 mm de espessura de tecido; excesso não corrigi.
3. Lave os tecidos com solução salina tamponada fosfato (PBS).
4. Mantendo o tecido úmido, coloque uma gota de eosina nele para manchá-la Rosa de 10-30 s e em seguida enxaguar com etanol a 70%.
   Nota: A cor rosa ajuda a identificá-lo no bloco de parafina para secionar mais tarde e vai ser lavada afastado durante deparaffinization.
5. Enrole o tecido no papel de lente e coloque em uma gaveta de histologia. Use almofadas de espuma na gaveta conforme necessário para manter o tecido liso.
6. Mergulhe a fita em 70% EtOH e loja a 4 ° C até que esteja pronto para processamento de parafina.
7. Processe o tecido pela desidratação, em concentrações crescentes de etanol (2 x 30 min cada de 70, 95 e 100%). Em seguida Banhe as amostras em três banhos de xilol sequencial para 30 min cada.
8. Mergulhe as amostras em três banhos de parafina sequencial para 30 min cada.
9. Aquecer as fitas, cuidadosamente se desdobrar e retire o papel de lente o tecido manchado de eosina e incorporar o tecido parafina-infiltrou-se em um bloco de parafina. Tenha cuidado para colocar a amostra plana na parte inferior do molde para permitir o corte mais fácil.
10. A secção dos tecidos usando um micrótomo como desejado (5-8 µm de espessura) e mancha usando procedimentos padrão otimizados para o tecido projetado (Figura 4).
    Nota: Uma alternativa para cortes de parafina é usar blocos congelados, embora a morfologia da amostra pode ser comprometida. Coloque as construções fixas em 30% de sacarose em PBS por 3h ou até que a amostra é equilibrado (por exemplo, durante a noite). Trocar a solução com 50/50 v/v 30% de sacarose e da temperatura de corte ideal (OCT) congelamento médio para 1 h. Coloque as construções em blocos congelados com OCT congelamento médio usando um 70% EtOH com chorume de gelo seco para bloco rápido congelamento em bandejas plásticas. Seção dos blocos com um criostato para seções espessas de 10-50 µm.

8. análise técnica: Alinhamento da célula

Nota: Manipulando a forma de tecido e campos de stress interno pode modular o alinhamento da célula, uma característica de muitos tecidos nativos.

1. Prepare as construções de engenharia de tecidos em moldes PDMS com geometrias de interesse.
2. No final do período de cultura, lave as construções em PBS, corrigir em 4% PF (ver passo 7.2) e colheita de construções para se preparar para a imagem latente por seccionamento e histologia (veja seção 7) ou montar todo manchando.
   Nota: Montagem toda coloração segue etapas semelhantes para histologia/imuno-histoquímica mas requer longos períodos de incubação e a profundidade de penetração de corantes, os anticorpos e quaisquer técnicas de imagem (tais como a profundidade de penetração de luz nas construções) será necessita de ser determinado empiricamente para a composição de construção.
3. Orientar as seções de tecido no plano horizontal (paralela ao plano da parte inferior do molde) e mancha para um marcador para a célula de interesse. Use um rótulo de f-actina, tais como a faloidina, para marcar as fibras de estresse de actina da maioria dos tipos de célula. Como alternativa, use um marcador específico da célula.
   Nota: No caso de engenharia tecidos cardíacos, orientação foi determinada pela sarcômeros manchados com α-actinin.
4. Avaliar o eixo principal de todas as células ou núcleos na região de interesse manualmente ou usando uma análise ferramenta (por exemplo, ImageJ, MATLAB).
   Nota: Pode ser útil categorizar diferentes regiões da mesma construção, dependendo da geometria como ("nó" e "bundle" regiões em uma malha, como geometria, ou "core") e "borda" em uma geometria circular.

A ótica do cortador do laser irá causar áreas gravadas para diminuíram ligeiramente dimensões como gravura a profundidade aumenta, e resultados em moldam as paredes com um chanfro muito sutil, devido a afilamento do raio laser. Isto ajudará a facilitar a remoção dos moldes molde PDMS, mas devem ser cuidadosamente ponderado se gravado profundamente negativos moldes mestre (> 6mm) são necessários (Figura 1).

Ao longo do tempo em cultura, construções compartimentadas irão compactar devido à matriz remodelar, embora a taxa e a extensão a que isto ocorre dependerá da composição do andaime, carga de célula e as condições de cultivo.

Remodelação da matriz pode ocorrer através de reorganização e degradação do circundante matriz (bem como deposição de nova matriz), mas é tipicamente associada com um aumento na rigidez mecânica devido à diminuição de área transversal. Com construções de colágeno somente compostas de colágeno de 1,6 mg/mL e 12 x 10⁶ cardiomyocytes/mL, vemos construções compacto para 19,7 ± 2,8% da sua largura inicial durante os quatro dias após a fundição (Figura 2) através do ensaio de compactação. Enquanto este ensaio rende uma aproximação 2D representativa de um processo 3D, a facilidade de coleta de dados e de natureza não-destrutivos torná-lo uma poderosa ferramenta para estudar o processo de desenvolvimento de construção. Nota que, em condições de cultura celular, mesmo na ausência de células, mecânica de colágeno pode mudar ao longo do tempo devido a ambos auto-montagem e do cross-linking¹¹. Fibrina pode ser rapidamente degradada pela fibrinólise tanto in vivo e em vitro se não na presença de um antifibrinolítico, tais como a aprotinina ou aminocaproico ácido¹². Portanto, o impacto dos componentes do andaime no desenvolvimento de tecido de longo prazo e não apenas a formação de tecido, deve ser considerado ao selecionar uma formulação de construção. Se o tamanho final do tecido é importante para uma aplicação específica, a compactação também deve ser considerada no projeto de molde e empiricamente determinada com base na composição de matriz e tipo (s) a célula. Observe que essa compactação de tecido também pode induzir stress campos dentro do tecido, que pode ser manipulada em construções compartimentadas para incentivar o alinhamento da célula (Figura 4).

Uma ampla gama de concentrações de polímero de andaime e densidades de semeadura de pilha inicial ter sido usado para criar tecidos projetados na literatura, e isso pode ser atribuído principalmente aos requisitos diferentes para vários tipos de células, linhas celulares e aplicativos. Baseado no nosso próprio trabalho com derivados de hiPSC cardiomyocytes, acreditamos que uma concentração de colágeno de 1,25 mg/mL e uma densidade de semeadura de ~ 15 milhões de células/mL é uma boa partida ponto¹³. Alternativamente, fibrina é amplamente utilizada como um material de andaime do tecido cardíaco, bem como, tipicamente na faixa de 3-4 mg/mL¹⁴. Célula semeadura densidade pode ser selecionada com base em uma série de fatores, dependendo da aplicação, mas as densidades de células de tecidos nativos fornecem um ponto de referência boa. Também considere que soluções altamente concentrada de células podem tornar-se um desafio de trabalhar com, especialmente para pequenos volumes. Para uma população de determinada célula, pode ser ajustada a formulação do andaime; geralmente por aumentar a concentração de polímero quando os tecidos são muito frágeis ou quebrar sobre compactação e aumentando a concentração do polímero, quando os tecidos são muito duros ou falharem compactar¹⁵.

Antes de realizar a análise de mecânica passiva a qualquer momento ponto durante a cultura, pode ser apropriado para condição mecanicamente a amostra de construção. Pré-condicionamento de hidrogel de polímeros naturais e engenharia de tecidos aumentará a reprodutibilidade do teste resultado devido a viscoelasticidade material e fornecer uma melhor indicação das propriedades que a construção vai expor em uma clínica aplicação. Nós usamos 8 ciclos de tensão de 10% em uma forma de onda triangular a uma taxa de 10% tensão/min antes de iniciar a avaliação mecânica (Figura 3).

Tecido e célula-tipo morfologia específica pode ser avaliada através de histologia e imuno-histoquímica com métodos tradicionais. No entanto, encontramos que a otimização de quase todas as etapas da parafina processamento, incorporação, seccionamento, recuperação do antígeno e coloração foram necessárias para o tecido cardíaco projetado em relação ao chapeado células ou seccionado nativo tecido (Figura 4).

Figura 1 : Contorno do processo de concepção e preparação de moldes PDMS de laser corte acrílicos mestres. (A) projeto elaborado em formato gráfico de vetor do molde. (B) limpo mestre negativo acrílico gravado a laser. PDMS (C) lançar-se sobre a superfície do molde mestre acrílico gravada. (D) PDMS resultante do molde pronto para esterilização antes da cultura de tecidos. Baixo-relevo: vista superior, mesma escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Construir compactação ao longo do tempo na cultura. Imagens do (A) de construções retangulares, elaboradas em triplicado compactação ao longo do tempo na cultura. Sobreposições de verde representam máscaras usadas para calcular a área de construção visível para análise de imagem. (B) a parcela da área de construção (métrica bidimensional de construção compactação) ao longo do tempo. Linhas horizontais representam os valores médios e erro barras indicam o desvio padrão. Para todos os grupos, n = 3 e * indica p < 0.05 avaliado pela ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Raw traços de caracterização mecânica dos tecidos cardíacos engenharia. Inserções de exibem um rastreamento de contração contração representante único (mesmos eixos como trama principal). (A) ativo resposta mecânica resultante da rápida passos seguidos pelos porões em incrementos de tensão de 5%. (B) resposta mecânica passiva resultante de um teste de tração-para-pausa a uma taxa de 10% tensão/min. Todas as amostras foram analisadas em banho de solução de Tyrode de 37 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : A parafina bloquear imagens de histologia para construções de engenharia de tecido cardíaco de vários projetos. Imagens de histologia de bloco de parafina para construções de engenharia de tecido cardíaco de vários projetos manchado com (A) hematoxilina e eosina, (B) diaminobenzidina (anticardíaca troponina T, marrom) e hematoxilina nuclear corante de contraste, (C ) picrosirius vermelhos mancha de colágeno com corante de contraste citoplasmática rápido verde e (D) Anticorpo de anti-α-actinin rato (verde) e 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nuclear corante de contraste (azul). Alinhamento de célula diferente como resultado a construção design e tecido de compactação. Barra de escala na aplica-se a B e C também. Baixo-relevo em D mostra cardiomyocytes estriado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Geometrias de molde PDMS personalizadas que são compatíveis com a cultura de tecidos tem grande utilidade na afinação Propriedades importante tecido de engenharia, tais como o alinhamento da célula, taxa de difusão e rigidez eficaz. Além disso, estes moldes são muito úteis para a preparação de tecidos para aplicações de análise em que a geometria é importante, como mecânico teste^16,17. Preparar estes dispositivos de laser corta moldes mestre negativo oferece um método rápido, fácil e baixo custo de utilizar essas ferramentas, especialmente quando comparado com o tempo e o custo associado com microfabrication tradicional. Corte a laser também permite que um tamanho maior do molde máximo, limitado apenas pelo tamanho do cortador de cama. Com sucesso usamos estes moldes versáteis para executar uma grande variedade de estudos com engenharia tecidos cardíacos, incluindo mapeamento óptico de propagação do potencial de ação, avaliação da força de produção e passivo de propriedades mecânicas e implantação em um modelo do rato do miocárdio^13,18. Reconhecemos que, para além do nicho de investigação de engenharia regenerativa cardiovascular, as aplicações para a engenharia de tecidos de campos, administração de medicamentos e materiais de pesquisa são vastas.

Embora existam poucos passos tecnicamente desafiadoras na fabricação dos moldes próprios, há uma série de passos críticos envolvidos na criação de tecidos funcionais. Se construções não compacta a matriz circundante após 24 h, primeiro confirme a viabilidade celular através de coloração de viabilidade dos tecidos projetados. Se a viabilidade celular é alta, considere alterar a composição de construção para o próximo conjunto de tecidos. Enquanto os resultados vão variar muito, dependendo da população celular, temos observado aumentada compactação associada com maiores densidades de semeadura e concentrações de colágeno. Finalmente, pode também ser útil complementar a população celular semeado com um tipo de célula adequado para a remodelação da matriz, tais como fibroblasto, para incentivar a compactação.

Uma limitação de nestes moldes é o potencial de PDMS adsorver pequenas moléculas hidrofóbicas. Enquanto para nossas aplicações isto não tem sido problemático, pode ser motivo de preocupação em ensaios muito sensíveis à perda destas moléculas. Nestes casos, adsorção de proteínas PDMS pode ser atenuada através de tratamento com um agente antifouling tais como polyhydrophilic ou polyzwitterionic de materiais¹⁹. Alternativamente, um molde PDMS esterilizado pode ser preparado como um mestre negativo (a partir de um molde positivo gravadas a laser) para um molde de cultura para ser convertido em outro, não adsorvente material, tais como agarose.

Os autores não têm nada para divulgar.

Os autores reconhecem que o financiamento do NIH R00 HL115123 e Brown University School of Engineering. Eles também são gratos ao Brown Design Workshop e Chris Bull para treinamento e suportam com o cortador do laser.