Custom diseñado moldes de cultivo de tejidos de maestros grabado a láser

Aquí presentamos un método rápido, fácil y de bajo costo para la fabricación de moldes de polidimetilsiloxano personalizadas que pueden utilizarse para la producción de tejidos de ingeniería base de hidrogel con geometrías complejas. Asimismo, se describen los resultados de evaluaciones mecánicas e histológicos realizadas en ingeniería tejidos cardiacos producidos mediante esta técnica.

Como el campo de la ingeniería de tejidos ha seguido madurando, ha habido mayor interés en una amplia gama de parámetros de tejido, incluyendo forma de tejido. Manipulando la forma del tejido en el micrómetro a escala de centímetros puede dirigir alineación de celda, modificar propiedades mecánicas eficaces y abordar limitaciones relacionadas con la difusión de nutrientes. Además, el recipiente en el que se prepara un tejido puede impartir las limitaciones mecánicas sobre el tejido, resultando en áreas de estrés que más pueden influir en la célula y la matriz de estructura. Los tejidos en forma de dimensiones altamente reproducibles también tienen utilidad en vitro ensayos en que muestra las dimensiones son críticas, como el análisis mecánico de todo tejido.

Este manuscrito describe un método de fabricación alternativos utilizando moldes maestro negativo de acrílico grabada con láser: estos moldes realizar bien con polidimetilsiloxano (PDMS), permiten diseños con dimensiones en la escala de centímetros y la función tamaños menores a 25 μm y puede rápidamente diseñado y fabricado a un bajo costo y con mínimos conocimientos. Los requisitos de costo y tiempo mínimo permiten grabada con láser moldes rápidamente se itera sobre hasta determina un diseño óptimo y se adaptan fácilmente a cualquier ensayo de interés, los más allá del campo de la ingeniería de tejidos incluidos.

En las últimas dos décadas, litografía blanda se ha utilizado ampliamente como una técnica de fabricación para apoyar la investigación científica, particularmente en los campos de la microfluídica, investigación de materiales y tejidos ingeniería^{1,2, 3}. Moldeado de la réplica, en el que se crea un objeto con la forma deseada de un molde negativo principal, ofrece un método conveniente y bajo costo de producir positivo que PDMS Replica puede ser usado para el bastidor en forma de hidrogeles. Sin embargo, los moldes maestro negativo requiere por lo general se producen usando técnicas de microfabricación que son costosos, desperdiciadores de tiempo, limitado en tamaño, y requieren espacio limpio y equipo sofisticado. Mientras que impresión 3D ofrece una alternativa potencial, su utilidad es limitada debido a los límites de resolución de las impresoras de bajo costo y las interacciones químicas entre polímeros comunes de impresora 3D y PDMS que puede inhibir la polimerización.

Sistemas de corte láser capaz tanto de corte y grabado de materiales como plástico, madera, vidrio y metal han vuelto considerablemente menos costoso y por lo tanto más accesible para la fabricación de herramientas de investigación. Cortadoras Láser de grado comercial son capaces de la fabricación de objetos en la escala del centímetro con características mínimas menores de 25 μm y además requieren un mínimo de entrenamiento, experiencia y tiempo a utilizar. Mientras que la ablación del laser de PDMS ha sido previamente utilizada en la fabricación de dispositivos de microfluidos, a nuestro conocimiento ningún manuscrito ha descrito un proceso de milímetro y centímetro escala moldes pueden fabricarse de láser cortar moldes negativos de maestro⁴ .

Hemos utilizado esta técnica sobre todo para manipular la forma de los tejidos diseñados para mejorar la difusión de nutrientes, la alineación celular y propiedades mecánicas^5,6,7. Sin embargo, la versatilidad de esta técnica permite la utilización en cualquier campo donde hidrogel moldeadas es de interés, como la droga entrega material ciencia investigación⁸. Con acceso a un cortador láser, repeticiones de molde PDMS se pueden hacer para casi cualquier geometría sin voladizos (que inhibiría la eliminación sin un molde de varias parte, que está fuera del alcance de este manuscrito) y que se ajuste a las dimensiones de la cama láser.

1. crear los diseños de molde de Vector formato maestro

1. Montar la geometría del molde deseado en formato vectorial con un programa de gráficos vectoriales (ver materiales, equipos y Software de tabla). Seleccione archivo | Nuevo y crear un lienzo de dimensiones adecuadas con formato de color RGB. Crear la geometría deseada utilizando las herramientas de forma en el panel izquierdo: entrar en las dimensiones deseadas en la parte superior de la ventana (clic en el botón transform en la parte superior si no inicialmente visible) para definir tamaños de forma.
   Nota: Geometrías de molde deben permitir al menos un borde de 6 mm entre el borde de las características más externas y la línea de corte para permitir el ajuste del menisco PDMS tras bastidor del molde. Esto permitirá que el molde acabado a ras con la parte inferior de una placa de cultivo. Además, geometrías de molde tenga en limitaciones de cuenta asociados con el modelo de corte láser que se utilizará, incluyendo ancho de corte y tamaño de la mínima función. El láser utilizado para el trabajo descrito en este documento (ver materiales, equipos y Software tabla) aparece un ancho de corte de 0,2 mm y un tamaño mínimo característica grabada de 25 μm (DPI máxima de 1.000). Dimensiones de molde pueden ser elegidos para un buque de la cultura deseada, como un plato de 10 cm, o 6 o 24 pocillos placas.
2. Abra el selector de color en la esquina superior izquierda de la ventana y definir nuevas muestras de color compatibles con el software de corte de láser.
   Nota: Utilizamos rojo (RGB 255, 0, 0) para el corte y azul (RGB 0, 0, 255) para grabado. Muestras adicionales pueden definirse dependiendo de los requerimientos para el diseño (por ejemplo, si desea profundidad de grabado más de una).
   1. Asignar estos colores swatch en trazados de corte seleccionando la ruta y luego la corte muestra el color de la ruta y [ninguno] para el color de relleno desde el selector de color.
3. Asimismo, asignar colores de swatch a aguafuerte caminos seleccionando el objeto y luego la ruta grabado para el color de relleno y [ninguno] para el color de la ruta desde el selector de color.
4. Guardar diseños como either.ai o.pdf formatos, dependiendo de lo vectores gráficos programa láser cortador compatibilidad y (figura 1A y Archivo adicional).

2. Corte los moldes de acrílico Master

1. Seleccione un material de molde maestro negativo.
   Nota: Cuarto de pulgada de espesor acrílico es idóneo para esta aplicación debido a su compatibilidad con el corte del laser, costo relativamente bajo y el grosor que permite características hasta ~ 5,5 mm de altura. Sin embargo, pueden utilizarse también otros materiales que satisfagan los requisitos siguientes: (i) Non-reactive con PDMS curado; (ii) no-poroso/fuertemente adhesivo curado PDMS; (iii) corta y graba limpiamente con un cortador del laser; (iv) mantiene un vidrioso estado hasta 60 ° C; (v) de un espesor compatible con la altura característica máxima deseada.
2. Preparar el cortador del laser para el corte de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Asegúrese de que utiliza una ventilación suficiente y que la altura de la cama es calibrada correctamente al grosor del material de molde maestro negativo solicitadas.
3. Abra el archivo de diseño en un programa de gráficos de vectores en el ordenador conectado a la cortadora láser y haga clic en archivo | Impresión. Asegúrese de que el cortador del laser se establece como la impresora y que "Hacer escala" en la escala desplegable menú para evitar la distorsión del diseño antes de hacer clic en el botón imprimir en la parte inferior del cuadro de diálogo impresión.
4. En la utilidad de impresión de corte de láser, haga clic en el botón configuración en la esquina derecha inferior. Asignar la potencia, velocidad y pulsos por pulgada (PPI) configuración a cada uno de los colores previamente elegidos para definir los parámetros de corte/grabado para todas las características de diseño.
   Nota: Aquí, el cortador del laser equipado con un 75 W láser (ver materiales, equipos y Software de tabla), ajustes de los siguientes: 100% de potencia, velocidad de 1% y 1.000 PPI corta limpiamente a través de ¼" acrílico; 100% de potencia, 8% de velocidad y 500 PPI graba a una profundidad de 2,75 mm de acrílico; y 5% de 100% de potencia, velocidad, 500 PPI graba a una profundidad de 3,50 mm de acrílico. Si desconocido para una configuración de cortador láser o material, estos parámetros pueden determinarse empíricamente a través de ensayo y error con una probeta.
5. Haga clic en el botón verde grande en el software de corte de láser láser grabar y cortar los moldes negativos de maestro.
6. Preparar los moldes negativos de maestro para el casting de PDMS quitando cualquier residuo de corte residual con pequeños cepillos o aire comprimido (figura 1B).

3. prepare los moldes PDMS para celular o cultivo de tejidos

1. Preparar una mezcla de fundición de PDMS según especificaciones del fabricante. Preparación de 0,35 mL/cm² de molde maestro; esto variará según las características del molde y la altura.
2. Degas el PDMS preparado en una cámara de vacío conectada a una línea de vacío de laboratorio estándar (< 500 mmHg) durante 1 hora o hasta que se han eliminado todas las burbujas.
3. Cinta el borde exterior del molde con vinilo o cinta de enmascarar (cinta de etiqueta color funciona bien) que se extiende la cinta > 3 mm sobre la cara grabada del molde maestro negativo. Presione la cinta firmemente contra el lado del molde para evitar pérdidas más adelante.
   Nota: Si el molde maestro acrílico cuenta con agujeros, puede ser necesario aplicar la cinta en la parte inferior del molde así (figura 1).
4. Vierta el PDMS desgasificada sobre la cara grabada del molde maestro negativo.
   Nota: El blanco grueso PDMS dependerá de la aplicación, aunque PDMS espesor molde fondos puede hacer difícil la proyección de imagen. Un espesor mínimo de ~ 1,5 mm un buen equilibrio entre consideraciones y facilidad de extracción de molde.
5. Coloque el molde maestro negativo recubrimiento PDMS en una cámara de vacío y desgasificar nuevamente durante 1 hora o hasta que se han eliminado todas las burbujas.
6. Coloque el molde maestro negativo recubrimiento PDMS desgasificado en un horno de 60 ° C para la curación de al menos 6 h. Asegúrese de que el estante del horno esté nivelado. Por otra parte, permite el PDMS curar a 37 ° C durante la noche, o a temperatura ambiente para ~ 72 h.
7. Si múltiples moldes fueron emitidos en el mismo molde principal negativo, use un razorblade para cortar estos moldes aparte mientras se encuentren todavía en el molde maestro negativo. Luego, pelar cada molde PDMS de molde maestro negativo. Asegúrese de que los moldes PDMS se recogen lentamente y con cuidado para evitar que la función de molde rasgado durante la recogida.
8. Usando una cuchilla, recorte de regiones con el menisco de la fundición, que impediría el molde de material plano, así como cualquier exceso de mentira o de escombros (figura 1).
9. Si es necesario, preparar moldes para la fundición de tejido de la célula en autoclave.

4. lanzar el colágeno y la fibrina hidrogel tejidos

Nota: Utilice un procedimiento aséptico adecuado para mantener la esterilidad.

1. Se adhieren los moldes en la parte inferior de la vasija deseada. Se adhieren nuevos moldes a la base de una cultura del tejido tratada placa presionando firmemente el molde contra el plástico sin tratamiento (debido a la hidrofobicidad de PDMS).
   Nota: Sin embargo, si trata de cultivo de tejidos policarbonato debe ser utilizado, o en el caso de volver a utilizar moldes, que tienden a cumplir menos firmemente, un pegamento natural o sintético (como el sellador de fibrina o de silicona curado durante la noche) puede utilizarse para asegurar la fijación.
2. Preparación de fibrinógeno, trombina y colágeno neutralizado casting soluciones tales que la concentración deseada de cada uno se logrará en el tejido fundido. No colágeno en hielo hasta su fundición.
   Nota: Fibrinógeno y trombina no se debe mezclar hasta inmediatamente antes de la fundición. Si es necesario, las soluciones de fibrinógeno y trombina también pueden ser enfriadas para aumentar el tiempo de polimerización. Hemos utilizado una concentración de fibrinógeno final entre 0-8 mg/mL, una concentración de trombina final entre 10-100 U/mL y una concentración de colágeno final entre 0.8 - 2.0 mg/mL (figura 2). Para los tejidos cardiacos ingeniería, utilizamos a menudo cardiomiocitos 12 x 10⁶ células/ml con 1,6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinógeno y trombina U/mL 20 (trombina se agrega inmediatamente antes de la fundición). Concentraciones óptimas (incluso fuera de estos rangos sugeridos) deben determinarse empíricamente.
3. Cosecha de células siguiendo protocolos estándar y resuspender en una concentración apropiada para lograr la densidad celular inicial deseada en el tejido fundido.
   Nota: Cardiomiocitos derivados de células madre humanas pluripotentes inducidas fueron cosechadas como se describe en Lian et al. ⁹ mantener las células cosechadas en el hielo. Volumen de la célula debe ser tratado durante la preparación de la suspensión de células. Hemos utilizado las concentraciones celular que oscilan entre 9-18 x 10⁶ células/mL, aunque se espera que gamas óptimas varían con la población de la célula (figura 2).
4. El fibrinógeno, colágeno neutralizado y suspensión celular (ver paso 4.2 por ejemplo) se combinan para crear una mezcla de fundición. Mantener la mezcla de fundición en el hielo.
   Nota: Las concentraciones y temperaturas de fibrinógeno y trombina va a determinar la cinética de polimerización; para evitar la polimerización durante el vaciado, puede ser necesario preparar lotes separados de la mezcla de fundición en función del número y volumen de las construcciones que serán echados.
5. Tratar las superficies del molde que se expondrá a la mezcla colada para mitigar la hidrofobicidad PDMS (hidrofobicidad PDMS aumentar la adsorción de proteínas y dificultan la fundición).
   1. Lograr modificación superficial hidrofílica por tratamiento con plasma de oxígeno, como por ejemplo con un generador portátil alta frecuencia (por ejemplo, BD-20 de Litton Engineering). Exponer todas las superficies del molde en contacto con la mezcla de gel o células para el tratamiento de plasma para 3-5 s, unos 5 min antes de fundición.
   2. También puede tratar con un agente tensioactivo, como Pluronic F-127 (1% w/v)¹⁰. Realizar el tratamiento de la superficie como cerca de la hora del casting como sea posible, como el cambio de polaridad se deteriorará con el tiempo.
6. Inmediatamente antes del colado, añadir la trombina a la mezcla colada y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo sin la introducción de burbujas.
7. Trabajando rápidamente, pipeta a la mezcla colada en los moldes, usando cuidado de depositar la mezcla en todos los rincones y las hendiduras del molde. Evitar la expulsión de la pipeta más allá de la primera parada para evitar formación de burbujas dentro de las construcciones.
8. Repita los pasos del 4.6 y 4.7 como sea necesario para cualquier hornadas adicionales de mezcla de fundición.
9. Coloque el recipiente de cultivo de tejidos en una incubadora de 37 ° C por 45 min. Si la incubadora no es bien humidificada, depósito media celular alrededor de los moldes antes de incubación para evitar la deshidratación de la construcción.
   Nota: El tipo de célula medios dependerá de tipo de la célula, pero de tejido cardiaco ingeniería construcciones utilizamos RPMI 1640 + suplemento B27.
10. Después de 45 min, retomar las construcciones de la campana y la cubierta con los medios de comunicación de la célula antes de regresar a la incubadora.
11. Cambiar los medios de comunicación de la célula cada 48-72 h según sea necesario para la célula y tipo de construcción.
    Nota: Cambio de medios de comunicación debe planificarse según las instrucciones recomendadas suministradas por el proveedor para asegurar la salud máxima de la célula. Tenga cuidado al cambiar los medios de comunicación para evitar molestar a las construcciones. No hemos experimentado problemas con construcciones flotantes, pero si esto ocurre, puede prevenirse mediante la adición de altos puestos en el diseño de molde que se extienden más allá del nivel de los medios de comunicación.
12. Después de su uso, lave los moldes secuencialmente con lejía del 10%, etanol al 70% y agua destilada. Después del aire seco y autoclave para su reutilización hasta ~ 10 veces.

5. Análisis de técnicas: Tejido compactación

Nota: Compactación resultante de la remodelación de la matriz es un indicador de la viabilidad del tejido y desarrollo que puede ser fácilmente medido mediante análisis de imagen y microscopia óptico.

1. Recoger imágenes de microscopía óptica de las construcciones en los moldes en incrementos de tiempo desde 2 h a 96 h después del vaciado.
   Nota: Debido al bajo grado de ampliación requerida un microscopio de disección con un montaje de cámara es idóneo para esta aplicación.
2. Trazar el área de construcción visible en una suite de análisis de imagen como el ImageJ (de código abierto, imagej.nih.gov/ij/).
3. Analizar la tasa y el grado final de compactación (figura 2).

6. Análisis técnicas: Ensayos de tracción

Nota: Ambos activos mecánicos (fuerzas o tensiones generadas por una ingeniería de tejido debido a la actividad de las células) y pasiva mecánica (fuerzas o tensiones generadas en respuesta a fuerzas o tensiones aplicadas) es características funcionales críticas de muchos ingeniería los tejidos y esto es particularmente cierto para los tejidos cardiacos ingeniería. El analizador de micromechanical utilizado para el análisis se describe en la Tabla de materiales. Otros aparatos mecánicos de prueba podrían aplicarse igualmente suponiendo que permiten pruebas hidratada y son capaces de control longitud y fuerza medidas sobre rangos y resoluciones pertinentes para el tejido. Para los tejidos con áreas transversales del orden de solo milímetros cuadrados y rigideces del orden de decenas de kPa, una célula de carga de 5 minutos es un buen ajuste. Más grandes y más rígidos de materiales requeriría una célula de carga más grande. Antes de la prueba, asegúrese de que el transductor de fuerza y el regulador de longitud están correctamente calibrados.

1. Encender el regulador de longitud, fuerza transductor, generador de pulsos y controlador de temperatura.
2. Llene el mecánico a través de pruebas con solución de Tyrode (1,8 mM cloruro de calcio, 1,0 mM cloruro de magnesio, cloruro de potasio 5,4 mM, 140 mM cloruro sódico, fosfato de sodio de 0,33 mM, 10 mM HEPES y glucosa de 5 mM en ddH₂O, pH ajustado a 7,4) para Ingeniería de los tejidos cardiacos. Ajustar la termocupla que se consigue una temperatura del baño de 37 ° C.
3. Un protocolo de pruebas mecánico para la recogida de datos de la contracción activa de la carga.
   Nota: Hemos evaluado la mecánica contráctil activa usando un protocolo de paso de longitud en cuya longitud pasos en 5% la tensión aumenta hasta un 30% se llevan a cabo para 120 s para evaluar el impacto de tensión en la fuerza de contracción (Figura 3A). Además, se han evaluado características mecánicas pasivas a través de un protocolo de rotura de tracción a una velocidad de deformación constante de 10% tensión/min (figura 3B). Ambos de estos protocolos pueden servir como buenos puntos de partida para el análisis mecánico activo y pasivo.
4. En un ámbito de disección, separar cuidadosamente la construcción de la ingeniería de tejidos del molde de PDMS, que flota libremente.
   Nota: Cellularized construcciones que han sido sometidos a compactación del tejido serán probablemente ya separarse las superficies interiores, y en esos casos se requiere mínima manipulación.
   1. Si la compactación no ha causado la construcción a estrenar, usar pinzas para separar suavemente la construcción desde los lados y fondo del molde para evitar dañar el tejido.
5. Suavemente con unas pinzas, recoger la construcción y traslado al baño prueba mecánico.
6. Visualización de la construcción a través de un microscopio de disección, montar cualquiera de los extremos de la construcción en los ganchos de conexión al transductor de fuerza y brazo de palanca.
7. Ajuste la posición del brazo de palanca con el instrumental quirúrgico hasta que la construcción se coloca sin tensión aplicada. El regulador de longitud de cero y regulador de la fuerza.
8. Imagen de la construcción a través del visor de la disección para que las dimensiones del constructo pueden medirse mediante análisis de imagen.
9. Iniciar el protocolo de fuerza activa y guardar la recogida datos una vez que el protocolo ha sido completado (figura 3).
10. Si así son necesarios datos mecánicos pasivos, ajustar el brazo de palanca otra vez hasta que haya cero tensión aplicada. La longitud cero y controladores de la fuerza y la imagen de la construcción de una segunda vez antes de cargar e iniciar el protocolo de mecánica pasiva (figura 3). Guardar los datos recopilados.

7. Análisis técnica: Parafina histología e inmunohistoquímica

Nota: Hemos tenido el mayor éxito en secciones del tejido diseñado usando bloques de parafina para que mejor se conserva la morfología del tejido de la proyección de imagen. Todos los pasos del proceso deben considerar cuidadosamente y adaptados al tejido diseñado, incluyendo el procesamiento de las muestras sin vacío ni presión, empíricamente determinar los métodos de recuperación de antígeno apropiado y valorar el anticuerpo primario concentración. Otras técnicas, como el uso de bloques congelados para la preparación de diapositivas, pueden requerir menos tiempo y los gastos mientras dando suficientes resultados dependiendo de la aplicación prevista.

1. En un ámbito de disección, separar cuidadosamente la construcción de la ingeniería de tejidos del molde de PDMS con unas pinzas se deslizó entre el constructo y PDMS para separarla suavemente el PDMS, que flota libremente. Transferencia de estas construcciones a un tubo de microcentrífuga para fijación.
   Nota: Construcciones frágiles o a fijarse bajo la condición de tensión estática proporcionada por el molde mismo pueden fijarse en el molde bien soluciones en la cultura y eliminar la construcción del molde después de la fijación.
2. Inmediatamente fijar los tejidos diseñados por sumergirse en paraformaldehído al 4% (PF) durante 10 min a temperatura ambiente. Estimar en no más de 1 h por 1 mm de espesor de tejido; No fije demasiado.
3. Lavar los tejidos con tampón fosfato salino (PBS).
4. Mantener el tejido mojado, coloque una gota de eosina que mancha rosa para 10-30 s y luego enjuagar con etanol al 70%.
   Nota: El color rosa ayuda a identificar en el bloque de parafina para seccionamiento más adelante y será arrastrado en parafina.
5. Abrigo tejido en papel de lente y el lugar en un cassette de histología. Use almohadillas de espuma en el cassette como sea necesario para mantener el tejido plano.
6. Sumerja el cartucho en el 70% EtOH y conservar a 4 ° C hasta que esté listo para el proceso de parafina.
7. Proceso de los tejidos por deshidratación en el aumento de las concentraciones de etanol (2 x 30 min cada de 70, 95 y 100%). Luego bañar las muestras en tres baños de xileno secuencial durante 30 minutos.
8. Sumergir las muestras en tres baños de parafina secuencial durante 30 minutos.
9. Calentar los cassettes cuidadosamente despliegan y extirpar el tejido eosina-manchadas del papel de lente e incrustar el tejido infiltrado en parafina en un bloque de parafina. Tenga cuidado de colocar la muestra en la parte inferior del molde para permitir más fácil seccionamiento.
10. Sección de los tejidos mediante un micrótomo que deseado (5-8 μm de espesor) y mancha empleando los procedimientos estándar, optimizados para el ingeniería del tejido (figura 4).
    Nota: Una alternativa a las secciones de la parafina es utilizar bloques congelados, aunque la morfología de la muestra puede verse comprometida. Coloque las construcciones fijas en sacarosa al 30% en PBS durante 3 horas o hasta que el espécimen esté equilibrado (por ejemplo, durante la noche). Intercambio de la solución con sacarosa al 30% 50/50 v/v y la temperatura de corte óptimo (OCT) de medio de congelación de 1 h. Coloque las construcciones en bloques congelados con OCT congelación medio con un 70% EtOH con mezcla de hielo seco para el bloque de rápida congelación en bandejas de plástico. Sección de los bloques con un criostato para secciones gruesas de 10-50 μm.

8. Análisis técnica: Celda alineación

Nota: Manipular los campos de tensión interna y forma tejido puede modular de alineación de celdas, una característica definitoria de muchos tejidos nativos.

1. Preparar las construcciones de la ingeniería de tejidos en moldes PDMS con geometrías de interés.
2. Al final del período de cultivo, lavar las construcciones en PBS, fijar en el 4% PF (vea el paso 7.2) y construcciones para prepararse para la proyección de imagen por seccionamiento y la histología (ver sección 7) de la cosecha o montar toda la coloración.
   Nota: Monte toda la coloración sigue pasos similares a histología/immunohistochemistry pero requiere períodos de incubación más largo, y la profundidad de penetración de colorantes, anticuerpos y cualquier técnicas de imagen (como la profundidad de penetración de la luz en las construcciones) necesario determinar empíricamente para la composición de la construcción.
3. Orientar a las secciones de tejido en el plano horizontal (paralelo al plano de la parte inferior del molde) y la mancha por un marcador de la célula de interés. Utilice una etiqueta de f-actina, como phalloidin, para marcar las fibras de actina estrés la mayoría de tipos de células. Como alternativa, utilice un marcador específico de células.
   Nota: En el caso de los tejidos cardiacos ingeniería, orientación se determinó por sarcómeros con α-actinina.
4. Evaluar el eje principal de todas las células o núcleos en la región de interés manualmente o utilizando un análisis de la herramienta (por ejemplo, ImageJ, MATLAB).
   Nota: Puede ser útil clasificar las diferentes regiones del mismo constructo, dependiendo de la geometría tales como ("nodo" y "paquete" en una geometría de malla-como, o "core") y "borde" de una geometría circular.

La óptica de la cortadora del laser puede causar áreas grabadas han disminuido muy ligeramente dimensiones como grabado de profundidad aumenta, y resultados en molde de paredes con un bisel muy sutil, debido al estrechamiento del haz láser. Esto ayudará a facilitar la remoción de la fundición de moldes de PDMS, pero debe considerar cuidadosamente si muy profundamente grabado moldes maestro negativo (> 6 mm) son necesaria (figura 1).

Con el tiempo en la cultura, construcciones cellularized se compacta debido a la matriz de remodelación, aunque la velocidad y extensión a la que esto ocurre depende de la composición del andamio, carga de celulares y las condiciones de cultivo.

Remodelación de la matriz puede ocurrir a través de la reorganización y la degradación de los alrededores matriz (como depósito de nueva matriz), pero es normalmente asociado con un aumento en la rigidez mecánica debido a la disminución del área transversal. Con sólo colágeno construcciones compuestas de colágeno de 1,6 mg/mL y 12 x 10⁶ cardiomiocitos/mL, vemos construcciones compactas a 19,7 ± 2,8% de su anchura inicial durante los cuatro días después de fundir (figura 2) mediante el ensayo de compactación. Mientras que este ensayo da una aproximación 2D representativa de un proceso de 3D, la facilidad de recolección de datos y de la naturaleza no destructiva hacen una poderosa herramienta para estudiar el proceso de desarrollo de la construcción. Nota que bajo condiciones de cultivo de células, incluso en la ausencia de células, mecánica de colágeno puede cambiar con el tiempo debido tanto a uno mismo-Asamblea y cross-linking¹¹. Fibrina puede ser degradada rápidamente por la fibrinólisis en vivo y en vitro si no en presencia de un antifibrinolítico como aprotinina o aminocaproico ácido¹². Por lo tanto, el impacto de los componentes del andamio en el desarrollo de tejidos a largo plazo y no sólo la formación del tejido, se debe considerar cuando se selecciona una formulación de la construcción. Si el tamaño final del tejido es importante para una aplicación específica, compactación también debe considerarse en el diseño de molde y empíricamente determinada basada en la composición de tipo y de la matriz celular. Tenga en cuenta que la compactación del tejido también puede inducir estrés campos dentro del tejido, que puede ser manipulado en construcciones cellularized a alineación de la célula (figura 4).

Una amplia gama de concentraciones de polímero de andamio y densidades de siembra de la célula inicial se han utilizado para crear tejidos de ingeniería en la literatura, y esto se puede atribuir principalmente a diferentes requisitos para diferentes tipos de células, líneas celulares y aplicaciones. Basado en nuestro propio trabajo con cardiomiocitos derivados de hiPSC, creemos que una concentración de colágeno de 1,25 mg/mL y una densidad de siembra de ~ 15 millones de células/mL es un buen punto partida¹³. Por otra parte, fibrina es ampliamente utilizada como un material de andamio de tejido cardiaco, típicamente en el rango de 3-4 mg/mL¹⁴. Celular, densidad de siembra puede ser seleccionado basado en una serie de factores dependiendo de la aplicación, pero las densidades de células de los tejidos nativos proporcionan un punto de referencia. También considerar que soluciones altamente concentrada de células pueden ser difíciles de trabajar, especialmente para pequeños volúmenes. Para una población celular determinada, puede ajustarse la formulación del andamio; generalmente por aumento de la concentración de polímero cuando los tejidos son demasiado frágiles o rompen la compactación y aumento de la concentración de polímero cuando los tejidos son demasiado rígidos o no compacto¹⁵.

Antes de realizar el análisis mecánico pasivo en cualquier momento el punto durante el cultivo, puede ser apropiado mecánicamente Prepare la muestra de construcción. Preacondicionamiento de los hidrogeles poliméricos naturales y tejidos ingeniería aumentará la reproducibilidad del resultado de la prueba debido a la viscoelasticidad del material y proporcionar una mejor indicación de las propiedades que el constructo se exhibirá en una clínica aplicación. Utilizamos 8 ciclos de tensión del 10% en una forma de onda triangular a una tasa de 10% tensión/min antes de iniciar la evaluación mecánica (figura 3).

Morfología específica del tejido y tipo celular puede ser evaluada a través de la histología e inmunohistoquímica con los métodos tradicionales. Sin embargo, hemos encontrado que optimización de casi todos los pasos de la parafina procesamiento, inclusión, seccionamiento, recuperación de antígeno y la coloración han sido necesarias para el ingeniería tejido cardíaco comparado con plateado las células o secciona nativo tejido (figura 4).

Figura 1 : Esquema del proceso de diseño y preparación de moldes PDMS de láser corta acrílico maestros. (A) molde diseño preparado en formato de gráficos vectoriales. (B) limpió laser master negativa acrílico grabado al agua fuerte. PDMS (C) fundido en la superficie del molde maestro acrílico grabado. PDMS resultante (D) molde listo para la esterilización antes de cultivo de tejidos. Detalle: vista superior, misma escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Construcción de compactación en el tiempo en la cultura. (A) imágenes de construcciones rectangulares en compactación por triplicado con el tiempo en la cultura. Superposiciones de verde representan máscaras utilizados para calcular el área de construcción visible para análisis de imagen. (B) parcela de área de construcción (una medida bidimensional de compactación de la construcción) con el tiempo. Las líneas horizontales representan los valores promedio y las barras de error indican la desviación estándar. Para todos los grupos, números = 3 y * indica p < 0.05 según lo evaluado por ANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Huellas raws para la caracterización mecánica de los tejidos cardiacos ingeniería. Apliques de mostrar una traza de contracción de contracción representante único (mismos ejes como trama principal). (A) activa respuesta mecánica resultante de pasos rápidos seguidos de asimientos en incrementos de tensión del 5%. (B) pasivos respuesta mecánica resultante de una prueba de tracción a rotura a una tasa de 10% tensión/min. Todas las muestras se analizaron en un baño de 37 ° C solución de Tyrode. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Parafina bloque de imágenes de histología para construcciones de la ingeniería de tejido cardiaco de varios diseños. Parafina bloque histología imágenes de construcciones de la ingeniería de tejido cardiaco de varios diseños teñidos con hematoxilina (A) y (B) contratinción nuclear diaminobenzidina (anti-cardiaco troponina T, marrón) y hematoxilina, eosina, (C ) Mancha de rojo Picrosirio para colágeno con verde rápido contraste citoplásmico y (D) anticuerpo de ratón anti-α-actinina (verde) y 4', contratinción nuclear de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). Alineación de celda difiere como consecuencia de la compactación de diseño y tejido de construcción. Barra de escala en el A se aplica también a B y C. Recuadro d muestra cardiomiocitos estriado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Modificado para requisitos particulares geometrías de molde PDMS que son compatibles con el cultivo de tejidos tienen gran utilidad en propiedades de tejido de ingeniería importantes, como alineación celular, tasa de difusión y la rigidez efectiva de afinación. Además, estos moldes son muy útiles para preparar los tejidos para aplicaciones de análisis en el que geometría es importante, como el mecánico prueba^16,17. Preparación de estos dispositivos de láser corte negativo moldes maestro ofrece un método rápido, fácil y de bajo costo de utilización de estas herramientas, especialmente en comparación con el tiempo y costo asociados con microfabricación tradicional. Corte por láser también permite un tamaño más grande del molde máximo, limitado sólo por el tamaño de la cama de la fresa. Hemos utilizado con éxito estos moldes versátiles para ejecutar una amplia variedad de estudios con ingeniería tejidos cardiacos, incluyendo el mapeo óptico de la propagación del potencial de acción, evaluación de la fuerza de propiedades mecánicas de producción y pasiva y la implantación en un modelo de rata de infarto de miocardio^13,18. Reconocemos que más allá del nicho de investigación de ingeniería regenerativa cardiovascular, las aplicaciones de la ingeniería de tejidos de campos, administración de fármacos e investigación de materiales son enormes.

Mientras que hay pocos pasos un desafío técnico en la fabricación de los moldes propios, hay una serie de pasos críticos involucrados en la creación de tejidos funcionales. Si las construcciones no compacto la matriz circundante después de 24 h, primero confirme la viabilidad celular mediante tinción de viabilidad de los tejidos de ingeniería. Si viabilidad celular es alto, considere la posibilidad de alterar la composición del constructo para el siguiente conjunto de tejidos. Mientras que los resultados variarán enormemente dependiendo de la población de células, hemos observado mayor compactación asociada a mayores densidades de siembra y concentraciones más bajas de colágeno. Por último, también puede ser útil complementar la población de células sembradas con un tipo de células muy adecuado para la remodelación de la matriz, como fibroblastos, a la compactación.

Una limitación de estos moldes es el potencial de PDMS adsorber moléculas hidrofóbicas pequeñas. Mientras que para nuestras aplicaciones no ha sido problemática, puede ser motivo de preocupación en ensayos muy sensibles a la pérdida de estas moléculas. En estos casos, adsorción de proteína PDMS puede mitigarse mediante el tratamiento con un agente anti-incrustante como polyhydrophilic o polyzwitterionic materiales¹⁹. Alternativamente, podría prepararse un molde PDMS esterilizado como amo negativo (a partir de un molde positivo de grabado a láser) para un molde de la cultura para ser otro, no adsorbente material, como la agarosa.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores reconocen que la financiación de los NIH R00 HL115123 y Brown University escuela de ingeniería. También agradecemos al taller de diseño de Brown y Chris Bull para capacitación y apoyo con el cortador del laser.