Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição

Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.

Visualização do DNA para microscopia de fluorescência utiliza uma variedade de corantes como cianina corantes. Estes corantes são utilizados devido a sua alta afinidade e sensibilidade para DNA. A fim de determinar se as moléculas de DNA são comprimento total após a conclusão do experimento, um método é necessário para determinar se as moléculas manchadas são comprimento total por digestão com enzimas de restrição de DNA. No entanto, DNA manchada pode inibir as enzimas, portanto, um método é necessária para determinar que as enzimas se poderia usar para fluorocromo manchado de DNA. Neste método, o DNA está manchada com uma tintura de cianina durante a noite para permitir que o corante e DNA para equilibrar. Próximo, manchada de DNA é digerido com uma enzima de restrição, carregado em um gel e electrophoresed. As bandas de síntese de DNA experimentais são comparadas com um digest em silico para determinar a atividade de enzima de restrição. Se há o mesmo número de bandas como esperado, a reação é completa. Bandas mais do que o esperado indicam digestão parcial e menos bandas indicam digestão incompleta. A vantagem desse método é sua simplicidade e usa equipamento que precisaria de uma cientista para uma enzima de restrição do ensaio e electroforese do gel. Uma limitação deste método é que as enzimas disponíveis para a maioria dos cientistas são enzimas comercialmente disponíveis; no entanto, poderia ser usadas qualquer enzimas de restrição.

A série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO e BOBO-3; A tabela 1) é utilizado em uma ampla variedade de experiências onde a visualização do DNA é necessário^{1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}. a família de dímero de cianina é amplamente utilizada devido a sua alta afinidade por moléculas de DNA a^18,19,20, sensibilidade e rendimento quântico. Cianina dímero corantes tem grande seletividade para ADN encalhado dobro e quando intercaladas têm um aumento de 100 a 1000 vezes de fluorescência²¹. Corantes de piridínio (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO e TOTO-3) tem um emissão comprimento de onda menor do que seus quinolium tingir (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 e POPO-3) homólogos (tabela 1)²². Além disso, o rendimento quântico de dímeros cianina intercalados no DNA é alto (0,2 - 0,6)²². No entanto, usando uma enzima para determinação do perfil de metilação de uma molécula de DNA² ou esticar²³ de uma molécula de DNA já manchada com uma tintura fluorescente requer um método para determinar que enzimas digerirá DNA manchada. Qualquer tipo de corante que se intercala no ADN ou qualquer enzima que dá um padrão discernível do substrato DNA pode ser usada para este método.

Meng et al primeiro determinada a taxa de digestão de DNA prestained através de eletroforese em gel usando uma variedade de diferentes corantes²⁴. Miranda et al analisaram no mais profundo de olhar para a família de totó de corantes. Ambos determinados a taxa de digestão de DNA manchada para ver se DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima de restrição,²⁵. Outros métodos de estudam efeitos vinculativos de corantes intercalados com DNA usando Pinça óptica²⁶ ou NMR²⁷. Qualquer método requer equipamento especializado; Considerando que, esse método permite que o equipamento que a maioria dos laboratórios de biologia molecular têm para determinar se uma tintura interfere com uma enzima de restrição de digestão.

Além disso, em outros métodos para medir o comprimento de uma determinada molécula, mapeamento óptico tem alongado imaculadas moléculas de DNA em uma superfície e digerido DNA para determinar a extensão e tamanho dos fragmentos. Intercalação de corante foi mostrada para aumentar o comprimento de contorno das moléculas de DNA fluorescente manchadas e dependendo do corante usado, os contorno dos comprimentos diferentes²¹. Este método tem sido utilizado em uma variedade de genomas^{1,3,4,6,13,28,29,30, 31}. no entanto, se moléculas foram pre-manchadas, dependendo da tintura e a enzima, a enzima não pode ser capaz de cortar o DNA manchada com um determinado corante. Portanto, este método determina se o DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima. Além disso, dependendo da concentração de corante e o corante utilizado, a mobilidade do DNA bandas em um gel irão migrar mais lentamente do que o DNA nativo devido a desenrolar parcial do backbone DNA para fazer o quarto para a tintura inserir entre pares de bases³² .

No entanto, às vezes estes corantes podem parcialmente ou completamente, inibir a ação de determinadas enzimas de restrição^7,24. Isto é pensado para ser devido a uma mudança estrutural no causada pelo acessório do corante fluorescente, que pode impedir que a enzima reconhecendo sua sequência específica de DNA. Compreender como estes corantes afetam as enzimas de restrição pode ajudar em experiências onde o perfil de metilação ou trecho de DNA manchada é necessário.

Em nosso método, o DNA foi manchada com um fluorocromo de interesse e digerido com uma enzima de restrição. Então o DNA foi electrophoresed em um gel, cuja imagem, e a taxa de digestão de enzima de restrição foi medida. As enzimas de restrição foram escolhidas com base no padrão de corte em um gel. Muitas bandas causaram a sobreposição das bandas de DNA e muito poucas bandas não deu uma imagem completa da molécula de DNA. Há um ponto doce para ser capaz de determinar o perfil da molécula de DNA digerido; Portanto, dependerá do DNA usado e a enzima. Uma vantagem deste método é sua simplicidade; exige somente equipamentos utilizados em uma eletroforese de gel e digestão de restrição.

1. preparação de corantes, Buffers e Gel de Agarose

1. Prepare as seguintes soluções para coloração de DNA ou a digestão do DNA manchada.
   1. Preparar 1 x TE (Tris-HCl e ácido etilenodiaminotetracético ácido; Buffer de EDTA) usando 10 mM Tris-HCl e 1 mM de EDTA em uma proveta ou balão volumétrico. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).
   2. Fazer alíquotas de cada tintura: TOTO-1, 1-YOYO, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tabela 1). Pipete 4 µ l de tintura de 1 mM em um âmbar escuro ou preto tubo de 1,5 mL e adicionar µ l 36 de 1x et, misture com a pipeta; Esta concentração torna uma solução de tintura de 100 µM (40 µ l total). Conclua esta etapa para cada tintura. Loja a 4 ° C.
      Nota: Evite expor a tintura à luz para evitar fotobranqueamento ou degradação do corante.
   3. Prepare o tampão 1 usando 10 mM Tris-HCl-propano-Bis 10 mM MgCl₂e 100 µ g/mL albumina de soro bovino (BSA). Preparar o tampão 2 usando 50mm NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂e 100 µ g/mL BSA. Prepare o tampão 3 usando 50 mM acetato de potássio, 20 mM Tris-Acetato, acetato de magnésio de 10 mM e BSA 100 µ g/mL. Cada enzima exigirá um desses buffers específicos para funcionar.
2. Prepare as seguintes soluções para a electroforese do gel.
   1. Faça um 6 x carregamento tingir combinando 0,25% bromofenol azul, 0,25% de xileno cianol, 15% Ficoll em dH₂O. armazenar em temperatura ambiente.
   2. Para tornar um agarose 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarose de temperatura (HGT) coagulação alta em um Erlenmeyer, adicionar 100 mL de tampão de x TAE 1 e colocar um copo invertido no topo do balão.
      1. Aqueça a solução em uma chapa quente até que as bolhas começam a se formar no fundo do frasco e flutuar para o topo.
      2. Remover a solução da placa quente, deixe arrefecer o solução até que o balão pode ser tocado com uma mão nua e em seguida despeje o gel em um molde de gel de 24,5 x 21,8 cm com um pente de gel para criar poços.
      3. Remover bolhas perto o pente ou na superfície do gel por estourá-los com a ponta da pipeta e permitir que o gel solidificar durante pelo menos 15 minutos. Isso pode ser armazenado em um refrigerador (4 ° C), envolvido em filme plástico por 1 semana impedir a secagem do gel ou contaminação. Para obter mais informações sobre como executar um gel referir Lee et al . ³³ .
         Nota: Use um pente de gel com 30 poços individuais. Cada um bem deve ser de 4,5 mm de largura, com uma profundidade de 2 mm. A altura do poço vai depender da quantidade de gel derramado em caixa.
   3. Prepare 1 buffer de x TAE (Tris - Acetato - EDTA) usando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM e 1 mM de EDTA. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).

2. preparação do ADN manchado

1. Mancha de lambda DNA (300-800 ng) usando diferentes alíquotas de corantes. Cada tintura (tabela 1) terá seis diferentes concentrações testadas, para um total de 48 reações por enzima de restrição. O processo a seguir descreve um conjunto acima para a 1 reação (Figura 1).
   1. Diluir o lambda DNA usando 1 x TE a 100 ng / µ l. loja em 4 ° C. Faça uma solução com um volume total de 300 µ l.
   2. Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda esperada de digest, estime 75-100 ng/banda. Adicionar quantidades apropriadas de corante para produzir concentrações de 1,9 µM µM 3.8, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng de DNA.
   3. Incubar durante uma noite 15 h - 18 h a 4 ° C.
   4. Deixe uma reação inocente para atuar como um controle de²⁵.
      Nota: Use unmethylated DNA para a reação de digestão. Enzimas sensíveis de metilação não podem cortar regiões metiladas no DNA e vão dar uma aparência de uma digestão incompleta.

3. preparação do ensaio enzima de restrição

1. Digest manchadas de DNA com uma enzima de restrição para determinar se essa enzima pode digerir prestained DNA (Figura 1).
   1. No dia seguinte, adicionar 20 U da enzima de restrição, 3 µ l de buffer apropriado (tabela 2) e água destilada, água esterilizada e filtrada para um total de 30 µ l. Para cada reação enzimática, escolha o buffer com a mais alta eficiência de corte, que pode ser encontrada no site do fabricante.
   2. Coloque as reações em um banho de água à temperatura de atividade enzimática ideal, listada na tabela 2 para as 6 enzimas usadas em Miranda et al., por 2-4 h (tabela 2)²⁵.
   3. Pare a reação adicionando 2 µ l de pH de EDTA 0,5 M 8.0.

4. Electroeluting manchado de DNA em um Gel de Agarose

1. Remover os lados do molde gel de 24,5 x 21,8 cm (etapa 1.2.2) e coloque o gel na caixa de electroforese do gel. Despeje a caixa de 2,5 L de 1 x TAE de buffer. Retire cuidadosamente o pente gel de gel, assim que os poços são acessíveis³³.
2. Pipetar as reações de enzima de restrição em um filme plástico e combinar cada reação com 6 x tintura de carregamento. Para cada solução de reação, adicione 1 µ l de 6 x carregamento tintura por 5-6 µ l da solução de DNA (1x). Em seguida Pipetar as reações (contendo o corante de carregamento, < 18 µ l) nos poços.
3. Misture 1 µ l de escada de 1 kb, 9 µ l de TE 1x e 2 µ l de 6 x tintura de carregamento. Carregar a solução para os poços que ladeiam as outras soluções.
4. Cubra a caixa de gel com papel preto ou azul escuro ou tecido. A caixa de gel de conectar uma fonte de alimentação, conjunto de alimentação para 30 V e executá-lo durante a noite (15-20 h). Apague as luzes, enquanto o gel está sendo executado, para evitar a photocleavage do DNA etiquetado.
5. Na manhã seguinte, desligue a fonte de alimentação. Pegue o gel usando a bandeja e transferi-lo para um recipiente com 45 brometo de etídio µ l e L 1 de 1 x TAE de buffer. Armazene o recipiente na temperatura ambiente no escuro ou de cobertura em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Deixe o gel mancha pelo menos 45 min à temperatura ambiente.
   Cuidado: Use brometo de etídio com luvas e óculos de segurança. Quando limpar o recipiente contendo a solução de brometo de etídio e jogando fora o gel, consultar suas diretrizes de eliminação de Estados para determinar como lidar com brometo de etídio usados; Além disso, outras manchas podem ser utilizadas em vez de brometo de etídio.

5. imagem latente do Gel do Agarose

1. Coloque o gel em cima de um transiluminador de luz azul, que emite luz de saída máximo entre 400-500 nm. Tire fotos com a câmera acoplada à estação.
   Atenção: Certifique-se de usar a capa para o iluminador e colocar óculos de proteção antes de ligar a fonte de luz.
   Nota: Este passo pode também ser concluído usando qualquer fonte de luz UV ou padrão do gel de scanner.
2. Visualizar as fotos em ImageJ arrastando o arquivo para a barra de status do ImageJ e a imagem irá aparecer.
3. Determine a taxa de digestão para a experiência, comparando as bandas no gel para o padrão esperado em silico gel. Para determinar a taxa de digestão, o número de bandas experimentais é dividido pelo número esperado de bandas de DNA^24,25. Se o padrão de banda de DNA digerido experimental tem o padrão esperado, a taxa de digestão é 1. Se o padrão tem fragmentos mais do que o esperado, a taxa de digestão é maior que 1. Se o padrão tem menos fragmentos do que o esperado, a taxa de digestão é menor que 1.

A fim de determinar que se um corante intercalante afetará uma enzima de restrição, digerindo o DNA, a ordem correta dos passos deve ser seguidos (Figura 1). Uma vez que o DNA é manchada e digerido com uma determinada enzima, uma foto do gel pode ser tomada para determinar o número de fragmentos e seu tamanho (Figura 2). A fim de determinar a eficiência da enzima, o número total de bandas visíveis esperados, dividido pelo número de bandas visíveis. Eficiência da enzima igualou a unidade, se o número de bandas esperado e viu a partida. Se existem mais bandas no gel então esperado, o valor é maior do que um e indica reações parcialmente digeridas. Se houver menos bandas então esperadas, então o valor é menor que 1, que indica a digestão incompleta. Na Figura 2a, mostrar faixas 3 e 4, a mobilidade das bandas tem diminuído, fazendo com que as bandas a mudança em direção aos poços. Nas pistas 1 e 2, a quantidade de corante não afeta a mobilidade visivelmente, então as bandas coincidir com o controle. Na Figura 2a, faixas 5 e 6 mostram mais bandas do que o controle, então ele indica a digestão parcial. O que significa que as tinturas afetados a clivagem do DNA no local de reconhecimento por essa enzima. Na Figura 2b, esperados bandas são vistas para todas as concentrações do corante, para que a tinta não interfere com a digestão do DNA. Figura 2C faixas a mobilidade desloca com asteriscos coloridos.

Como a tintura concentração aumenta para corantes com -1, a mobilidade diminui. Para determinar o tamanho aproximado das bandas, um controle é necessário para saber onde as moléculas de DNA nativas são esperadas em comparação com o DNA manchado (Figura 2a). Para corantes com -3, a mobilidade não diminuiu à medida que fizeram de corantes-1, então era mais fácil determinar o tamanho do fragmento (Figura 2b). A diferença de mobilidade é devido ao tipo de tinta utilizado, como pode ser visto em Miranda et al . ²⁵. A variância destes corantes é vista devido as estruturas das tinturas. O vinculador entre a fracção aromática para corantes -3 foi maior do que -1. Os corantes podem intercalam ligeiramente diferente devido à diferença no tamanho vinculador, o que pode explicar por que a mudança de mobilidade é menor para corantes-3.

Se não há nenhum DNA ou as bandas de DNA são muito fracos no gel, aumentando a concentração de DNA é necessária. No entanto, se aumenta a concentração de DNA, então a quantidade de corante necessária também aumentará para manter a concentração correta de corante a proporção de DNA.

Figura 1 : Um esquema dos passos necessários quando digerir fluorocromo rotulado de moléculas de DNA. DNA e YOYO-1 ou outro corante da série TOTO, é adicionado a um tubo preto e incubado durante a noite (O/N; 15-20 h). Uma enzima de restrição é adicionada a um tubo; é colocado em uma incubadora, à temperatura preferencial, para 2-4 h (tabela 2). Carregar amostras em um gel de agarose 0.7% imerso feito com 1 x TAE buffer. Capas de papel colorido escuro que caixa de gel e as luzes estão desligadas, enquanto que o gel é fugiu durante a noite para evitar o photocleavage do corante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Digestão de restrição de DNA intercalada com um corante de dímero de cianina. (um) Lambda DNA está manchado com diferentes concentrações de YOYO-1 durante a noite (faixa c: digerido lambda DNA com nenhuma tintura (controle) pista 1: 1,9 ng, pista 2: 3,8 ng, pista 3: 19,4 ng, pista 4: 32,2 ng, pista 5: 48,3 ng, lane 6: 63,5 ng de corante por 100 ng de DNA) e em seguida dige sted com EcoRI a 37 ° C, durante 2-4 h. Todas as reações são electrophoresed (E = 0,85 V/cm) em uma temperatura de coagulação alta de 0,7% do gel do agarose (HGT) feita com 1 buffer de x TAE (1 x TAE; 40 mM Tris-HCl, 20 mM de ácido acético, 1 mM EDTA). Géis são corados com brometo de etídio e fotografadas com um transiluminador de luz azul acoplado a uma câmera. L Lane é uma escada de 1 kb (tamanhos, kb); Lane λ é o comprimento total lambda DNA; Lane E é o padrão esperado de banda (tamanhos, kb). (b) Lambda DNA está manchado com YOYO-3 (pista 1: 1,9 ng, pista 2: 3,8 ng, pista 3: 19,4 ng, pista 4: 32,2 ng, pista 5: 48,3 ng, faixa 6: 63,5 ng de corante por 100 ng de DNA) e digerido com HindIII a 37 ° C. (c) para ver como a mobilidade deslocado como a concentração de YOYO-1 é aumentada, asteriscos coloridos estão localizados ao lado de cada banda para cada concentração de YOYO-1. Por exemplo, a banda em 3,5 kb tem um asterisco vermelho ao lado de cada banda em cada concentração de YOYO-1. As bandas inesperadas na faixa 5 e 6 não tem um asterisco ao lado das bandas. A figura é modificada de Miranda et al . ²⁵. copyright (2017) nucleosídeos, nucleotídeos e ácidos nucleicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Abreviado nomes de família TOTO de corantes com nomes IUPAC com emissão (Em) e de excitação (Ex) maximima²².

Tabela 2: Listados na tabela é um subconjunto de enzimas possíveis que poderiam ser usados nesses experimentos. Três enzimas são sensíveis a metilação e três não são sensíveis a metilação. Os buffers usados para as enzimas e as temperaturas de incubação estão listados para cada enzima.

A fim de digerir fluorescente etiquetadas DNA (Figura 1), uma série de passos são necessários. Primeiro, DNA está manchada com um fluorocromo durante a noite. DNA pode ser incubada com dímeros cianina, por um período mais curto de tempo; no entanto, Carlsson et al encontraram que o DNA criado bandas duplas para cada tamanho de DNA devido à coloração incompleta²⁰. Para remediar esta situação, o DNA pode ser manchado durante a noite para evitar a ocorrência de bandas duplas. Este é um passo crítico no protocolo. Se o corante não é incubado durante bastante tempo, o tintura-DNA pode não ser no estado de equilíbrio e dar-lhe-á um padrão duplo-borda. Se isso ocorrer, permita a mistura de DNA-tintura para equilibrar-se por um longo período de tempo.

Em seguida, uma enzima de restrição é adicionada à mistura de DNA-tintura e digerida para 2-4 h a uma temperatura específica para cada enzima. O DNA deve ser unmethylated para enzimas sensíveis de metilação. Se não for, DNA metilado inibem a enzima de restrição de corte de DNA em regiões metiladas. Além disso, a reação deve ser incubada no buffer correto e temperatura para a enzima. Cada enzima tem uma lista de buffers de e a atividade da enzima em cada buffer. Escolha o buffer com atividade enzimática em 100%, se possível. Quanto à temperatura, certifique-se que é incubada em temperatura correta. Se não for, pode causar a enzima a desnaturar-se a temperatura está alta demais ou perder a atividade. EDTA é utilizada para parar a reação. A empresa onde as enzimas foram compradas terá um gráfico com as temperaturas ideais e as condições de reserva para essa enzima. Se o controle não dá o número correto de bandas com os pesos moleculares certo, verificar para ver se a enzima é expirada, aumentar o tempo de incubação, ou verifique para certificar-se a temperatura está correta para essa enzima.

Uma vez que a reação é concluída, as amostras podem ser carregadas em um gel. Primeiro, um gel é carregado no recipiente de gel e imerso em 1 x TAE buffer. Em seguida, o DNA digerido é misturado com corante de carregamento e a solução é carregada em poços do gel. A tampa é deslizada sobre e os fios estão ligados à caixa de gel. Um papel escuro, que é gravado juntos, é colocado em cima da tampa para cobrir a tampa e passe sobre os lados. Outro passo crítico é que as amostras sejam protegidas da luz em todos os momentos, especialmente quando o gel está sendo executado. Fonte de alimentação deve ser ligado e desligado as luzes para a sala. Para evitar photocleavage de DNA, as amostras são protegidas da luz, o tempo todo. Se não há papel escuro, um tecido escuro pode ser usado também. Se o DNA não se move, verifique se os fios estão ligados à caixa e premir o botão Executar.

De manhã, tira da caixa de gel o gel e carregar o gel em um recipiente que contém o brometo de etídio. Brometo de etídio nos permite ver as bandas de DNA sob o transiluminador de luz azul (Figura 2). Outros corantes podem ser usados no lugar de brometo de etídio. Uma câmera pode ser montada acima o transiluminador de luz azul para capturar fotos do gel. Dependendo da configuração, uma estação de imagem também pode ser utilizada.

Esse método pode ser utilizado para qualquer tintura que intercala ou manchas de DNA, não só a série TOTO. Miranda et al. modificado uma técnica desenvolvida por Meng et al. para determinar se coradas fluorescentemente DNA poderia ser digerido com enzimas de restrição^24,25. Esta é a técnica utilizada para determinar se pre-manchado DNA afeta as enzimas de restrição. Este método é limitado para as enzimas de restrição comercialmente disponíveis, a menos que um cientista tem acesso a outras enzimas de restrição que não estão listados comercialmente. Dependendo do DNA, a enzima escolhida deve ter um padrão de banda de DNA destacável e bastante bandas (> 3) para determinar se a molécula de DNA é o comprimento total. Além disso, o DNA deve ser unmethylated se enzimas sensíveis de metilação são usadas. Se o DNA é misturado, então não use enzimas sensíveis de metilação.

Este método é uma maneira fácil de usar para determinar se as enzimas de restrição pode cortar moléculas de DNA no reconhecimento local manchado com um corante intercalante sem a necessidade de projetar primers para um determinado site de corte de³⁴. As aplicações futuras deste método seria determinar se fluorescente etiquetado moléculas de um experimento foram comprimento total usando uma enzima de restrição e determinar o tamanho das bandas de DNA de digest ou para determinar os perfis de metilação do DNA moléculas. Experiências futuras também poderiam determinar se puxar enzimas são afetadas por cyanine tinturas ou outros corantes fluorescentes.

Os autores não têm nada para divulgar.

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5605100122001), um componente do National Institutes of Health (NIH), bem como a Universidade de Nebraska em Kearney (UNK) programa de pesquisa de estudante verão (SSRP) e UNK Bolsa de iniciação científica (Al-URF).