Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, mantendo assim uma barreira mecânica ao mundo exterior. Além disso, os queratinócitos desempenham um papel essencial na iniciação, manutenção e regulamento de epidérmicos respostas imunes por ser parte do sistema imunológico inato, respondendo a estímulos antigênicos de forma rápida e não específica. Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de queratinócitos humanos primários da pele de adulto e demonstrar que estas células respondem à diferenciação terminal induzida por cálcio, como medido por um aumento da expressão da involucrin de marcador de diferenciação. Além disso, mostramos que os queratinócitos isolados são responsivos à IL-1 β-induzida por ativação de vias de sinalização intracelulares, medida pela ativação da via MAPK p38. Tomados em conjunto, descrevemos um método para isolamento e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele adulta. Porque os queratinócitos são o tipo de célula predominante na epiderme, este método é útil para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea in vitro.

A pele é o maior órgão do corpo humano e serve como uma barreira protetora contra o ambiente externo. A pele é composta de duas camadas principais: a derme e epiderme, onde a epiderme constitui a camada mais externa da pele. O tipo mais abundante de células na epiderme é os queratinócitos que compreende mais de 95% da célula em massa^1,2. Os queratinócitos são mantidos em vários estágios de diferenciação na epiderme e são organizados em camadas basais, espinhosos, granulares e cornificadas que correspondem às fases específicas de diferenciação³. A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, produzindo assim uma barreira intacta ao mundo exterior.

Os queratinócitos também representam a primeira linha de defesa contra patógenos na pele e, portanto, desempenham um papel importante na resposta imune inata^4,5. Exposição dos queratinócitos a estímulos externos leva à ativação das vias de sinalização intracelulares e, posteriormente, a produção de um número de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Estas proteínas derivadas de queratinócitos participarem na resposta inflamatória, recrutamento e ativação de células imunes como específico T células^6,7, neutrófilos e células dendríticas. Assim, porque os queratinócitos desempenham um papel crucial em inúmeros processos biológicos, a lógica por trás da técnica apresentada aqui foi gerar um modelo in vitro para estudar a biologia da pele. Culturas de queratinócitos primários obtidas de prepúcio neonatal são frequentemente utilizadas para estudar pele biologia^8,9. No entanto, com a técnica descrita aqui, queratinócitos de ambos os sexos são obtidos resultando em uma maior diversidade biológica das células.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e a geração de queratinócitos humanos primários da pele de adulto, incluindo manutenção e congelamento de queratinócitos. O objetivo geral deste método é gerar queratinócitos humanos primários que podem ser usados como um modelo para estudar Biologia cutânea in vitro.

A coleta de amostras de pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica requer aprovação do Comitê de ética das instituições de acolhimento. Este protocolo foi aprovado pelo Regional éticas Comitê da região Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). O método descrito aqui é derivado de estudos semelhantes por Maciaq et al . ¹⁰ e Liu e Karasek¹¹.

1. isolamento de queratinócitos da pele humana

1. Começar por fazer as seguintes soluções: 50 mL de solução de glicose de tripsina e 0,1% de 0,25% em DPBS. Mix e filtro esterilizem (0,2 µm) a solução. Prepare-se 10 mL de RPMI-1640 + 2% solução FBS, 50 mL de DPBS e queratinócito meio livre de soro (KSFM). Adicione 250 µ l de gentamicina e KSFM suplementos para 500 mL de KSFM. Pré-aquecer as soluções a 37 ° C antes do uso.
2. Colete a pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica. As amostras de pele usadas são aproximadamente 10 cm x 15 cm, mas podem variar de tamanho. Manter a calma de pele sob transporte transportando amostras de pele em uma caixa de isopor contendo um elemento de refrigeração. Se necessário, a amostra de pele pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite.
3. Remova a gordura da abaixo da seção de pele usando pinças, bisturis e tesoura esterilizada.
4. Fivela para fora a seção de pele (aproximadamente 10 x 15 cm) em uma cobertura estéril em cima de uma placa usando agulhas. Primeiro, limpe a pele com uma gaze esterilizada seca. Em seguida, limpe a pele usando uma gaze esterilizada com etanol a 70%.
5. Utilizando uma plaina de pé, corte da camada superior (epiderme) da seção de pele e colocá-lo em uma placa de Petri de 9 cm. Então, imediatamente Adicione 25 mL da solução de DPBS/tripsina/glicose (preparada na etapa 1.1) para a placa de Petri. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
6. Usando uma pipeta retire a placa de Petri a solução de tripsina/DPBS/glicose e adicionar 10 mL de RPMI-1640 + 2% FBS para inactivar a tripsina.
7. Usando duas pinças, agora solte as células epidérmicas no meio de delicadamente raspando e agitação epidérmico e dérmico compartimento das secções de pele.
8. Filtrar a suspensão de células epidérmicas por um filtro de metal (tamanho do furo de 1 mm) e recolher em um tubo de 50 mL. Adicione as restantes secções de pele para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de RPMI-1640 sem FBS e vórtice para 10 filtro s. a suspensão através do metal do filtro em um tubo de 50 mL contendo a suspensão de células epidérmicas. Adicione DPBS para um volume total de 50 mL.
9. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 450 x g, à temperatura ambiente.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender o celular epidérmica em cerca de 10 mL de 37 ° C KSFM dependendo do tamanho do centrifugado. Conte as células usando o azul Trypan método sob microscópio de coloração. O número de células obtidas a partir de uma seção de pele de 10 x 15 cm é aproximadamente 50-100 x 10⁶ células. Cada frasco de cultura² 75cm, transferência de 8 x 10⁶ células juntamente com 12 mL de 37 ° C KSFM. Agite os frascos de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células.
11. Incube os queratinócitos em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO₂. Mude o meio após 2 dias e três vezes por semana. Células de passagem quando a cultura é 70-80% de confluencia, que leva cerca de 2 semanas, dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos.

2. passagem de queratinócitos

1. Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso de 4,5 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura 75 cm² .
2. Remova as células médio e adicione frasco de cultura 4,5 mL/75 cm² pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.
3. Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 6 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura 75 cm² e transferir a suspensão de eritrócitos para tubos de 50 mL.
4. Lave os frascos de cultura com 3 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar as células por 10 min a 450 x g, à temperatura ambiente.
   1. Ressuspender as células peletizadas em 10 mL de KSFM (37 ° C). Contar as células e transferir 3 x 10⁶ células para um frasco de cultura 150 cm² junto com 20 mL de KSFM (37 ° C). Agite suavemente o frasco de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células. Congele as células, quando a cultura é confluente de 80-90%, o que leva cerca de 4 a 6 dias dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos (ver secção 3, congelando o protocolo abaixo). Expanda os queratinócitos para gerar estoques congelados apropriados.

3. congelamento dos queratinócitos

1. Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso 9 mL da solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura de² a 150 cm.
2. Remova as células médio e adicione frasco de cultura 9ml/150 cm² pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.
3. Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 12 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura de² a 150 cm e aspire a suspensão de células para tubos de 50 mL.
4. Lave os frascos de cultura com 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar os tubos por 10 min a 450 x g a 4 ° C. Prepare o celular gelada congelamento médio (KSFM + 10% de DMSO).
5. Ressuspender as células em KSFM + 10% de DMSO, contar as células e congelar as células em uma densidade de 6 x 10⁶ células/mL, usando de métodos de criopreservação de congelamento lento padrão¹².
6. Armazene os queratinócitos em nitrogênio líquido (fase vapor) até que esteja pronto para usar.

4. descongelar e cultivo queratinócitos congelados

1. Descongele rapidamente os frascos apropriados congelados em banho maria a 37 ° C. Use etanol a 70% para limpar o exterior do cryovial. Transferir o número adequado de células (aproximadamente 15.000 células/cm²) para um balão de cultura e adicione imediatamente meio de cultura previamente aquecido (KSFM) para o frasco de cultura.
   Qualquer tamanho de frascos de cultura pode ser usado dependendo da instalação do experimento.
2. Use 5 mL de meio de cultura para um frasco de cultura 25 cm² .

Diferenciação Terminal induzida por cálcio
Queratinócitos humanos passam por diferenciação terminal após tratamento com cálcio^14,15,16. Queratinócitos humanos primários foram isolados e cultivados conforme descrito no protocolo acima. Quando aproximadamente 50-60% de confluencia, as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou veículo e fotos das células foram tiradas no dia 0, 1 e 2. A Figura 1 mostra as alterações morfológicas dos queratinócitos observadas após estimulação de cálcio.

A expressão de Involucrin é aumentada após estimulação de cálcio
Culto de queratinócitos humanos foram cultivados até aproximadamente 50-60% de confluencia depois que as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou um veículo para 24 e 48 h. Demonstrámos que, em paralelo com a maior diferenciação das células como observado pelas mudanças morfológicas dos queratinócitos, a expressão de RNAm da involucrin de marcador de diferenciação aumentou significativamente após a estimulação de cálcio. Após 24 e 48 h de estimulação, a expressão de RNAm de involucrin foi aumentado em aproximadamente 5.5-fold e 3.5-fold, respectivamente, em comparação com o veículo (Figura 2).

Fosforilação de IL-1 β-induzida de p38 MAPK
Para determinar se os queratinócitos humanos isolados foram responsivos à induzida por citocinas ativação das vias de sinalização intracelulares, queratinócitos cultivados foram estimulados com IL-1 β (10 ng/mL) para vários pontos de tempo. Dentro de 5 min, IL-1 β estimulação levou a uma rápida ativação/fosforilação de p38 MAPK, conforme determinado pela mancha ocidental. Após 1 h, fosforilação de IL-1 β-induzido p38 MAPK tinha retornado ao nível basal (Figura 3). Apenas a forma fosforilada da p38 MAPK foi aumentada, como IL-1 β estimulação não teve efeito sobre o nível de proteína total de p38 MAPK (Figura 3).

Figura 1 : Imagens representativas de induzida por cálcio diferenciação dos queratinócitos. Queratinócitos humanos primários cultivados foram estimulados com veículo (dH₂O) ou cálcio (1.2 mM) para os pontos de tempo indicado. (- E) Imagens de contraste de fase de queratinócitos no dia 0 (A), dia 2 e dia 1 (B e C) (D e E) após a estimulação de cálcio. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Aumento da expressão de RNAm de involucrin após estimulação cálcio. Cálcio (1.2 mM) ou veículo (dH₂O) foi adicionado ao culturas queratinócitos humanos primários para os pontos de tempo indicado (n = 3). RNA foi isolado e a expressão da diferenciação marcador involucrin analisado por qPCR. RPLP0 a expressão de RNAm (P0 grande da proteína Ribosomal) foi usada para normalização. Os resultados representam média ± D.P. de três experimentos diferentes. p < 0.05 em comparação com o veículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : IL-1 β-induzido a fosforilação de p38 MAPK. Queratinócitos humanos primários cultivados foram estimulados com veículo (PBS + 0,15% BSA) ou IL-1 β (10 ng/mL) para os pontos de tempo indicado. Extratos de proteínas foram isolada e ocidental análise mancha, usado para medir o nível fosforilado de p38 MAPK e total p38 MAPK. Carga igual foi verificada pela incubação com um anticorpo anti-β-actina. Dados de um experimento representativo de três são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, descrevemos como isolar facilmente queratinócitos humanos primários da pele adulta e como a cultura deles em vitro. Este modelo pode ter uma aplicação ampla para a investigação da biologia das células epidérmicas e pode ser útil para pesquisadores interessados no estudo de doenças cutâneas.

Algumas das vantagens do protocolo descrito aqui é que, em contraste com os queratinócitos isolados do prepúcio neonatal obtido de recém-nascido machos submetidos à circuncisão, queratinócitos humanos primários de pacientes adultos estão isolados de homens e mulheres e pode incluir qualquer idade ≥18 anos. Assim, a diversidade biológica é muito maior nestas células comparado com queratinócitos do prepúcio neonatal. Além disso, pedaços relativamente grandes de amostras de pele podem ser obtidos de pacientes submetidos à cirurgia plástica, tais como cirurgia de redução de mama ou cirurgia para perda de peso.

Como mencionado acima a epiderme é organizada em diferentes camadas, correspondente à fase específica de diferenciação dos queratinócitos. A fim de estudar a biologia da pele, o modelo descrito aqui é limitado pela falta de um microambiente tridimensional. As diferentes camadas da epiderme, bem como os diferentes tipos de células presentes na pele não são imitadas neste modelo. Para superar isso, podem ser usados modelos equivalentes de pele humana, que consistem de um epitélio de múltiplas camado, onde os queratinócitos diferenciam após exposição a uma interface ar-líquido e assim, mais intimamente, imitando a epiderme nativo^{17, 18,19}. Outro modelo que pode ser obtido a fim de estudar a biologia da pele é o modelo da pele ex vivo , que biópsias de pele são mantidas em culturas em uma interfase ar-líquido, como descrito anteriormente,²⁰.

. O autor não tem nenhum conflito de interesses.

O autor deseja agradecer a Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller para seu suporte técnico