Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

La funzione principale dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, mantenendo quindi una barriera meccanica al mondo esterno. Inoltre, cheratinociti svolgono un ruolo essenziale nell'iniziazione, la manutenzione e la regolazione delle risposte immunitarie epidermiche facendo parte del sistema immunitario innato risponde agli stimoli antigenici in modo veloce, non specifico. Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento dei keratinocytes umani primari da pelle adulta e dimostrare che queste cellule rispondono a differenziazione terminale calcio-indotta, come misurato da un'aumentata espressione del involucrin indicatore di differenziazione. Inoltre, ci mostra che i keratinocytes isolati sono reattivi al-1 β-induced attivazione delle vie di segnalazione intracellulare come misurato tramite l'attivazione del pathway MAPK p38. Presi insieme, descriviamo un metodo per l'isolamento e coltura dei keratinocytes umani primari da pelle adulta. Poiché i cheratinociti sono il tipo predominante delle cellule nell'epidermide, questo metodo è utile per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

La pelle è l'organo più grande del corpo umano e serve come una barriera protettiva contro l'ambiente esterno. La pelle è composta di due strati principali: il derma e l'epidermide, dove l'epidermide costituisce lo strato più esterno della pelle. Il tipo più abbondante di cellule nell'epidermide è i keratinocytes che comprende oltre il 95% delle cellule massa^1,2. I cheratinociti sono tenuti nelle varie fasi di differenziazione nell'epidermide e sono organizzati in livelli basali, spinosi, granulari e cornified che corrispondono a specifiche fasi di differenziazione³. La funzione primaria dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, producendo così una barriera intatta al mondo esterno.

I cheratinociti rappresentano anche la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni della pelle e quindi giocano un ruolo importante nella risposta immunitaria innata^4,5. L'esposizione dei keratinocytes agli stimoli esterni conduce all'attivazione di vie di segnalazione intracellulare e, successivamente, produzione di un numero di vari mediatori infiammatori, tra cui citochine, chemochine e peptidi antimicrobici. Queste proteine derivate da cheratinociti partecipano nella risposta infiammatoria di reclutamento e l'attivazione di cellule immunitarie come specifico T cellule^6,7, neutrofili e cellule dendritiche. Così, perché keratinocytes gioca una parte cruciale in numerosi processi biologici, la spiegazione razionale dietro la tecnica presentata qui era per generare un modello in vitro per studiare la biologia della pelle. Primario del keratinocyte colture ottenute da prepuzio neonatale sono spesso utilizzati per studiare biologia pelle^8,9. Tuttavia, con la tecnica qui descritta, cheratinociti da entrambi i sessi sono ottenuti con conseguente una maggiore diversità biologica delle cellule.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la generazione di keratinocytes umani primari da pelle adulta, compresa la manutenzione e il congelamento dei keratinocytes. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare keratinocytes umani primari che può essere utilizzato come modello per studiare biologia cutanea in vitro.

La raccolta di campioni di pelle da volontari sani adulti sottoposti a chirurgia plastica richiede l'approvazione del comitato etico nelle istituzioni dell'host. Questo protocollo è stato approvato dal regionale Comitato etico della regione Midtjylland, Danimarca (M-20110027). Il metodo qui descritto è derivato dagli studi simili da Maciaq et al. ¹⁰ e Liu e Karasek¹¹.

1. isolamento dei cheratinociti da pelle umana

1. Iniziare facendo le seguenti soluzioni: 50 mL di soluzione di glucosio di tripsina e 0,1% 0,25% in DPBS. Mix e filtro sterilizzare (0,2 µm) la soluzione. Preparare 10 mL di RPMI-1640 + soluzione di 2% FBS, 50 mL di medium senza siero DPBS e cheratinociti (KSFM). Aggiungere 500 mL di KSFM KSFM integratori e 250 µ l di gentamicina. Pre-riscaldare le soluzioni a 37 ° C prima dell'uso.
2. Raccogliere pelle da volontari sani adulti sottoposti a chirurgia plastica. I campioni di pelle utilizzati sono circa 10 cm x 15 cm, ma possono variare in dimensione. Mantenere la pelle fresca sotto trasporto trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, il campione di pelle possa essere conservato a 4 ° C durante la notte.
3. Rimuovere il grasso da sotto la sezione di pelle utilizzando pinze, bisturi e forbici sterilizzate.
4. Fibbia la sezione della pelle (circa 10 cm x 15 cm) su un telo sterile sopra una piastra usando gli aghi. In primo luogo, pulire la cute con un tampone di garza sterile asciutta. Quindi pulire la pelle usando un tampone di garza sterile con etanolo al 70%.
5. Utilizzando una pialla di piede, taglio di livello superiore della sezione della pelle (epidermide) e metterlo in una capsula di Petri di 9 cm. Quindi, immediatamente aggiungere 25 mL della soluzione di glucosio/DPBS/tripsina (preparata al punto 1.1) per la capsula di Petri. Incubare per 30 min a 37 ° C.
6. Utilizzando una pipetta rimuovere la soluzione DPBS/tripsina/glucosio da di Petri e aggiungere 10 mL di RPMI-1640 + 2% FBS per inattivare la tripsina.
7. Utilizzando due pinze, ora rilasciare cellule epidermiche nel medium delicatamente raschiando e agitazione sia epidermico e dermico vano delle sezioni della pelle.
8. Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico (dimensione del foro di 1 mm) e raccogliere in un tubo da 50 mL. Aggiungere le restanti sezioni di pelle per un tubo da 50 mL contenente 10 mL di RPMI-1640 senza FBS e vortexare per 10 s. filtro filtrare la sospensione attraverso il metallo in una provetta da 50 mL contenente la sospensione delle cellule epidermiche. Aggiungere DPBS per un volume totale di 50 mL.
9. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 450 x g e a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare epidermico in circa 10 mL di 37 ° C KSFM a seconda della dimensione del pellet cellulare. Contare le celle utilizzando il blu di Trypan che macchia il metodo sotto il microscopio. Il numero di cellule ottenute da una sezione di pelle 10 cm x 15 cm è di circa 50-100 x 10⁶ celle. A ciascun matraccio di cultura² 75cm, trasferimento 8 x 10⁶ cellule insieme a 12 mL di 37 ° C KSFM. Agitare delicatamente i matracci di cultura per assicurare una uniforme distribuzione delle cellule.
11. Incubare i cheratinociti in un incubatore a 37 ° C con 100% umidità e 5% CO₂. Modificare il mezzo dopo 2 giorni e tre volte alla settimana. Cellule di passaggio quando la cultura è 70-80% confluenti, che prende circa 2 settimane a seconda del tasso di proliferazione dei keratinocytes.

2. passaggio dei cheratinociti

1. Riscaldare la giusta quantità di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C in un incubatore. Utilizzare 4,5 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per un matraccio di cultura² 75 cm.
2. Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere matraccio di cultura di 4,5 mL/75 cm² pre-riscaldati soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per le celle. Posizionare il matraccio di cultura nell'incubatore (37 ° C) e dopo circa 5 minuti, controllare al microscopio se le cellule hanno iniziato allentamento.
3. Quando circa il 50% delle cellule hanno allentato, delicatamente colpire il matraccio di cultura contro la mano per allentare le cellule rimanenti. Poi, per inattivare la tripsina, aggiungere 6 mL di RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) nel matraccio di cultura di 75 cm² e trasferire la sospensione cellulare per provette da 50 mL.
4. Sciacquare i matracci di cultura con 3 mL di RPMI 1640 + 2% FBS e aggiungere le provette da 50 mL. Centrifugare le cellule per 10 min a 450 x g e a temperatura ambiente.
   1. Risospendere le cellule pellettate in 10 mL di KSFM (37 ° C). Contare le celle e trasferire 3 x 10⁶ cellule in un pallone di cultura di² cm 150 con 20 mL di KSFM (37 ° C). Agitare delicatamente il matraccio di cultura per assicurare una uniforme distribuzione delle cellule. Congelare le cellule quando la cultura è 80-90% confluenti, che prende circa 4-6 giorni a seconda del tasso di proliferazione dei keratinocytes (Vedi sezione 3, protocollo sottostante di congelamento). Espandere i cheratinociti per generare gli stock congelati appropriati.

3. congelamento dei cheratinociti

1. Riscaldare la giusta quantità di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C in un incubatore. Utilizzare 9 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per un matraccio di cultura² 150 cm.
2. Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere matraccio di cultura di 9 mL/150 cm² pre-riscaldati soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per le celle. Posizionare il matraccio di cultura nell'incubatore (37 ° C) e dopo circa 5 minuti, controllare al microscopio se le cellule hanno iniziato allentamento.
3. Quando circa il 50% delle cellule hanno allentato, colpire delicatamente il matraccio di cultura contro la mano al fine di allentare le cellule rimanenti. Quindi, per inattivare la tripsina, aggiungere 12 mL di RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) nel matraccio di cultura² cm 150 e aspirare la sospensione cellulare per provette da 50 mL.
4. Sciacquare i matracci di cultura con 6 mL di RPMI 1640 + 2% FBS e aggiungere le provette da 50 mL. Centrifugare le provette per 10 min a 450 x g a 4 ° C. Preparare il medium (KSFM + 10% DMSO) di congelamento delle cellule ghiacciata.
5. Risospendere il pellet cellulare in KSFM + 10% DMSO, contare le celle e congelare le cellule ad una densità di 6 x 10⁶ cellule/mL utilizzando metodi standard crioconservazione di congelamento lento¹².
6. Memorizzare i cheratinociti in azoto liquido (fase vapore) fino all'uso.

4. lo scongelamento e coltura di cheratinociti congelati

1. Scongelare rapidamente i flaconcini congelati appropriati in bagnomaria a 37 ° C. Utilizzare etanolo al 70% per pulire l'esterno del cryovial. Trasferire il numero appropriato di cellule (circa 15.000 cellule/cm²) in un pallone di cultura e immediatamente aggiungere mezzo di crescita pre-riscaldato (KSFM) nel matraccio di cultura.
   Qualsiasi dimensione di matracci di cultura può essere utilizzato a seconda della configurazione dell'esperimento.
2. Utilizzare 5 mL terreno di coltura per un matraccio di cultura 25 cm² .

Calcio-indotto differenziazione terminale
Cheratinociti umani subiscono differenziazione terminale previo trattamento con calcio^14,15,16. Keratinocytes umani primari è stato isolato e coltivato come descritto nel protocollo di cui sopra. Quando circa 50-60% confluenti, le cellule sono state stimolate con calcio (1,2 mM) o veicolo e immagini delle cellule sono state scattate il giorno 0, 1 e 2. La figura 1 Mostra i cambiamenti morfologici dei keratinocytes osservato su stimolo del calcio.

L'espressione di Involucrin è aumentato su stimolo del calcio
Cheratinociti umani coltivati sono state coltivate fino a circa 50-60% confluenti dopo che le cellule sono state stimolate con calcio (1,2 mM) o un veicolo per 24 e 48 h. Abbiamo dimostrato che in parallelo con la maggiore differenziazione delle cellule come osservato dai cambiamenti morfologici dei keratinocytes, l'espressione del mRNA del differenziazione marcatore involucrin aumentato significativamente dopo stimolazione del calcio. Dopo 24 e 48 h di stimolazione, l'espressione del mRNA di involucrin era aumentato a circa 5.5-fold e 3.5-fold, rispettivamente, rispetto al veicolo (Figura 2).

IL-1 β-induced fosforilazione di p38 MAPK
Per determinare se i cheratinociti umani isolati erano sensibli a reagire all'attivazione indotta da citochina delle vie di segnalazione intracellulare, keratinocytes coltivati sono state stimolate con IL-1 β (10 ng/mL) per vari intervalli di tempo. Entro 5 min, stimolazione di IL-1 β ha condotto ad una rapida attivazione/fosforilazione di p38 MAPK, come determinato mediante Western blotting. Dopo 1 h, la fosforilazione di IL-1 β-induced p38 MAPK ritornò a livello basale (Figura 3). Solo la forma fosforilata di p38 MAPK è stata aumentata, come IL-1 β stimolazione non ha avuto effetto sul livello di proteina totale di p38 MAPK (Figura 3).

Figura 1 : Immagini rappresentative di calcio-indotto differenziazione dei cheratinociti. Colta di keratinocytes umani primari sono stati stimolati con veicolo (dH₂O) o calcio (1,2 mM) per i punti di tempo indicato. (A - E) Immagini di contrasto di fase dei cheratinociti il giorno 0 (A), 1 ° giorno (B e C) e 2 ° giorno (D ed E) dopo stimolo del calcio. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Ha aumentato l'espressione di mRNA di involucrin su stimolo del calcio. Calcio (1,2 mM) o veicolo (dH₂O) è stato aggiunto ai keratinocytes umani primari coltivate per i punti di tempo indicato (n = 3). RNA è stato isolato e l'espressione del differenziazione marcatore involucrin analizzati da qPCR. RPLP0 l'espressione del mRNA (Ribosomal Protein grande P0) è stato utilizzato per la normalizzazione. Risultati rappresentano la media ± S.D. da tre diversi esperimenti. p < 0,05 rispetto al veicolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : IL-1 β-induced fosforilazione di p38 MAPK. Colta di keratinocytes umani primari sono stati stimolati con il veicolo (PBS + 0,15% BSA) o IL-1 β (10 ng/mL) per i punti di tempo indicato. Gli estratti proteici sono stati analisi macchiante occidentale e isolato utilizzato per misurare il livello fosforilato di p38 MAPK e totale p38 MAPK. Caricamento pari è stata verificata tramite incubazione con un anticorpo anti-β-actina. Dati da un esperimento rappresentanza su tre sono mostrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui, descriviamo come facilmente isolare keratinocytes umani primari da pelle adulta e come loro coltura in vitro. Questo modello può avere una vasta applicazione per indagini di biologia delle cellule epidermiche e può essere utile per i ricercatori interessati a studiare le malattie cutanee.

Alcuni dei vantaggi del protocollo descritto qui è che, contrariamente ai cheratinociti isolati da prepuzio neonatale ottenuto da neonati maschi sottoposti a circoncisione, keratinocytes umani primari da pazienti adulti sono isolati da uomini e donne e può includere qualsiasi età ≥ 18 anni. Così, la diversità biologica è molto più grande in queste cellule rispetto ai cheratinociti da prepuzio neonatale. Inoltre, relativamente grandi pezzi di campioni di pelle possono essere ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia plastica, ad esempio riduzione del seno chirurgia o chirurgia di perdita di peso.

Come accennato in precedenza l'epidermide è organizzato in diversi livelli corrispondono alla fase di differenziazione specifica dei keratinocytes. Al fine di studiare biologia della pelle, il modello descritto qui è limitato dalla mancanza di un microambiente tridimensionale. I diversi strati dell'epidermide, come pure i diversi tipi cellulari presenti nella pelle non sono ha imitati in questo modello. Per ovviare a questo, possono essere utilizzati modelli equivalenti di pelle umana, che consistono di un epitelio multistrato dove keratinocytes differenziare sopra l'esposizione ad un'interfaccia aria-liquido e così, più che imita molto attentamente il nativo epidermide^{17, 18,19}. Un altro modello che può essere ottenuto per studiare biologia della pelle è l'ex vivo pelle modello, in cui le biopsie della pelle sono conservate nelle culture presso un'interfase di aria-liquido come descritto in precedenza²⁰.

. L'autore non ha alcun conflitto di interessi.

L'autore desidera ringraziare Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller per il loro supporto tecnico