Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do

Um protocolo é apresentado para a produção de tRNA (UUU) e a análise de tRNA (UUU) em complexo com a enzima TcdA por ensaios de retardamento de gel de agarose.

Demonstramos métodos para a expressão e purificação de tRNA (UUU) em Escherichia coli e a análise por ensaios de retardamento de gel da ligação de tRNA (UUU) a TcdA, uma N6-teronilcarbamoil-videina (t ⁶ A) desidratase, que cicliza o treonilcarbamoílo Cadeia lateral anexada a A37 no circuito anticodon (ASL) de tRNAs para t ⁶ A cíclico (ct ⁶ A). A transcrição do gene sintético que codifica tRNA (UUU) é induzida em E. coli com β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico 1 mM (IPTG) e as células contendo tRNA são colhidas 24 h após a indução. A fração de ARN é purificada usando o método de extração de fenol ácido. O ARNt puro é obtido por cromatografia de filtração em gel que separa eficientemente as moléculas de tRNA de tamanho pequeno de ácidos nucleicos intactos ou fragmentados maiores. Para analisar a ligação TcdA ao tRNA (UUU), TcdA é misturado com tRNA (UUU) e separado em um gel de agarose nativo a 4 ° C.O tRNA livre (UUU) migra mais rápido, enquanto os complexos TcdA-tRNA (UUU) sofrem um retardo de mobilidade que pode ser observado após a coloração do gel. Demonstramos que TcdA é uma enzima de ligação de tRNA (UUU). Este ensaio de retardamento de gel pode ser usado para estudar mutantes de TcdA e os efeitos de aditivos e outras proteínas na ligação.

O teste de retardamento de gel ¹ (também conhecido como ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, EMSA) é um método eletroforético projetado para estudar e caracterizar interações proteína-ácido nucleico. Ele permite a análise do DNA da proteína e das interações proteína-ARN e, em particular, as interações entre as proteínas de ligação de ARNt e ARNt, utilizando componentes purificados ou misturas complexas de proteínas ( por exemplo , lisados ​​celulares) ou ácidos nucleicos ( por exemplo , tRNA Piscinas). Nós aplicamos ensaios de retardamento de gel ao estudo da interação entre ARNt purificado (UUU) e TcdA, uma N6-teronilcarbamoiladenosina (t ⁶ A) desidratase, que cicliza a cadeia lateral de treonilcarbamoílo anexada a A37 no anel de tronco anticodon (ASL) De tRNAs para t ⁶ cíclico (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA também é conhecido como CsdL ^{3 ,}F "> 4. O gene tcdA / csdL forma um cluster com os genes csdA e csdE ⁵ , que codificam a dessulfurase de cisteína e o aceitador de enxofre do sistema de desulfinato de cisteína sulfinase (CSD) e é necessário para manter a função TcdA in vivo ³ .

O raciocínio por trás dos ensaios de retardamento de gel é que, enquanto as moléculas de ácido nucleico livres migram rapidamente para a frente da acrilamida ou géis de agarose em virtude da sua grande carga negativa, a mobilidade eletroforética de complexos de proteína dos mesmos ácidos nucleicos é dramaticamente reduzida. A redução da mobilidade é visualizada como uma "mudança" nos complexos de ácido nucleico-proteína, que se resolvem como bandas discretas. O complexo de ácido nucleico e proteína positivamente carregado e maior apresenta uma maior mudança ou redução na mobilidade em um gel.

Uma vez que a neutralização da carga do complexo é um fenômeno universalPara os complexos proteína-ácido nucleico, o teste de retardamento do gel pode ser aplicado a uma ampla gama de complexos e tipos de ácidos nucleicos. O método é simples, barato e pode ser realizado em laboratórios com equipamentos mínimos. Requer apenas pequenas quantidades de proteínas e ARNt. Esta é uma vantagem em relação às técnicas biofísicas alternativas, que geralmente consomem maiores quantidades de amostra.

O teste de retardamento de gel tem sido amplamente utilizado para o estudo de fatores de transcrição. O ensaio tem sido utilizado para analisar a cinética de ligação, a força e a especificidade dos fatores de transcrição para muitas seqüências de DNA diferentes. Foi nesse campo que a EMSA foi desenvolvida pela primeira vez ^{6 , 7} . Os ensaios de retardamento de gel com moléculas de ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} e tRNA também foram utilizados na pesquisa de ribossomosE analisar, como fazemos aqui, as enzimas que modificam os nucleósidos de tRNA pós-transcrição.

Muitos parâmetros diferentes afetam o resultado de um teste de retardamento de gel, como temperatura, qualidade da proteína e amostra de tRNA, e a força da ligação. O planejamento cuidadoso ea execução do experimento são cruciais para a interpretação dos resultados do ácido nucleico livre e das espécies ligadas a proteínas. Aqui, usamos o gene sintético que codifica tRNA (UUU) clonado em um vetor de expressão cujo promotor não possui o local de ligação do ribossoma Shine-Dalgarno, levando à síntese de grandes quantidades do tRNA ² . Este protocolo detalhado destina-se a fornecer um guia claro para realizar experiências de retardamento de gel de ARNt, evitando erros comuns.

Cuidado: consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Vários dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos e corrosivos. Use práticas adequadas ao realizar a extração de ARNt usando fenol, incluindo o uso de uma chaminé e equipamento de proteção pessoal (óculos de segurança, luvas, bata de laboratório, calças completas, sapatos fechados, etc. ). Este protocolo usa uma mancha de ácido nucleico não tóxico. O uso de manchas alternativas pode exigir precauções adicionais e disposição especializada do agente de coloração se for tóxico e / ou cancerígeno ( por exemplo , brometo de etidio).

1. Preparação do Gel de Agarose

1. Pesar 2 g de agarose e adicioná-lo a uma garrafa de vidro para preparar um gel de agarose a 2% p / v.
2. Adicione 100 mL de tampão de transição de ácido tris-borato-etilenodiaminotetraacético (EDTA) (TBE) ao frasco contendo agarose. Derreta-se por aquecimento em um microondas. Com intervalos de 30 s, arraste o conteúdo para misturarBem e repita este passo até que a agarose esteja completamente dissolvida. Deixe a solução de agarose arrefecer até aproximadamente 50-60 ° C.
3. Tape as bordas abertas de uma bandeja de gel para criar um molde, coloque um pente apropriado para criar os poços e coloque a agarose fundida nele. Evite a formação de bolhas e deixe-o solidificar à temperatura ambiente.
4. Uma vez solidificado, coloque a bandeja de gel em uma unidade de eletroforese e preenchê-lo com tampão TBE até o gel estar completamente coberto.

2. Preparação do ARNt

1. Expresso tRNA (UUU) em E. coli
   1. Na parte da manhã, use um frasco de E. coli BL21 (DE3) congelado transformado com o vetor de expressão pET23d-EcUUU ² (abriga o gene que codifica o tRNA de E. coli (UUU)), para criar um Luria Broth (LB) de baixo teor de sal, Placa suplementada com 100 μg / mL de ampicilina. Inverta a placa e coloque-a em uma incubadora de 37 ° até que as colônias apareçam (tarde da tardeOon).
   2. Inocular uma colônia única bem cultivada em 5 mL de LB mais 100 μg / mL de ampicilina e crescer durante a noite a 220 rpm a 37 ° C.
   3. Na manhã seguinte, elimine as células (6.500 xg por 10 minutos a 4 ° C), substitua o meio com 5 mL de LB fresco mais 100 μg / mL de ampicilina e ressuspenda. Use esta suspensão para inocular 200 ml de LB mais 100 μg / mL de ampicilina. Cresça durante 5 h a 220 rpm a 37 ° C.
   4. Quando a densidade óptica da cultura a 590 nm (OD ₅₉₀ ) atingiu 0,6 - 0,8, adicione 1 mM de IPTG à cultura para desencadear a expressão do gene tRNA (UUU). Incubar a 37 ° C durante 3 h.
   5. Colher as células por centrifugação da cultura a 6.500 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Lise e extração
   1. Ressuspender o sedimento celular em 5 mL de tampão de lise (acetato de sódio 0,3 M, EDTA 10 mM). A partir deste ponto, usam buffers autoclavados e mantenham todas as amostras contendo tRNA a 4 ° C para evitar que tDegradação de ARN.
   2. Adicione 1 volume de fenol ácido (pH 4,3) ao sedimento de células ressuspensas na exaustão. Misture durante 1 min por inversão para lisar as células e centrifugar a 10 000 xg (10 min, 4 ° C).
   3. Recolher a fase aquosa superior que contém o tRNA solúvel (UUU) (e menores concentrações dos outros grupos de ARNt) usando uma pipeta com o cuidado de não aspirar a fase orgânica (inferior). Descarte a camada inferior e o grânulo, que consiste na fase orgânica e nos detritos celulares, num recipiente adequado.
   4. Precipite o tRNA misturando completamente a fase solúvel (aquosa) com 2,5 volumes de etanol a 100% v / v por inversão durante 1 h a 4 ° C. Centrifugar a mistura a 15 000 xg (30 min, 4 ° C).
   5. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento rico em ARNt em 4 mL de tampão de filtração em gel (fosfato de sódio 20 mM ou fosfato de potássio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Execute 5 μL do conjunto de ARNt ressuspenso em um gel de agarose a 2% p / v.
      NOTA:O ARNt de boa qualidade aparece como uma banda única (tamanho molecular entre 50-100 pb).
3. Purificação do tRNA (UUU)
   1. Seguindo a prática cromatográfica padrão ¹² , carregue o tRNA ressuspenso (UUU) em uma coluna de filtração de gel preparativa de alta resolução (dimensões: 16 x 600 mm, volume do leito: 120 mL, intervalo de resolução: 1.000-70.000 Da) previamente equilibrado em tampão de filtração em gel (na fase móvel). Defina o caudal para 1 mL / min para eluir as amostras.
      NOTA: O pico de ARNt (UUU) elui aproximadamente a 75,5 mL. Tipicamente, pode ser obtido um rendimento de 0,5-1,0 mg / L de tRNA de cultura.
   2. Analisar as amostras em volumes de eluição representativos por eletroforese de 5 a 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 2% p / v.

3. Preparação da amostra

1. Expresse e purifique TcdA de acordo com López-Estepa et al . ² .
   NOTA: Até 250 μMTcdA pode ser usado para o estudo.
2. Pipetar a quantidade correspondente de TcdA conforme a Tabela 1 em tubos de centrífuga de 1,5 mL devidamente rotulados. Adicionar 1,6 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (concentração final) e misture suavemente com uma pipeta. Feche a tampa e incube a mistura à temperatura ambiente durante 5 min.
3. Adicionar 10 μM de adenosina trifosfato (ATP) e 50 mM de MgCl2 (concentrações finais). Misturar com uma pipeta e incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Adicione tRNA purificado (UUU) (seção 2.3) de acordo com a Tabela 1 , misture com uma pipeta e incube à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS) até 100 μL de volume final. Misturar adequadamente e adicionar glicerol até uma concentração final de 10% v / v.
6. Vortex a amostra e centrifugue brevemente o conteúdo do tubo (10 000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Desenvolvimento de carregamento de gel e eletroforese

1. Coloque a unidade de eletroforese em uma bandeja cheia de gelo triturado para manter a câmara a 4 ° C durante a corrida de eletroforese.
2. Com cuidado, pipetar 5 μL de cada amostra no poço correspondente. Adicione um marcador de tamanho de DNA adequado.
3. Conecte os eletrodos nas ranhuras correspondentes da fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 100 V e execute o gel por 90 min.

5. Coloração de gel para observar a interação de proteína de ARNt

1. Prepare a solução de coloração misturando 50 mL de TBE com 1x de uma mancha de DNA adequada. Evite expor a solução de coloração à luz solar cobrindo o recipiente de coloração com papel alumínio.
   NOTA: As manchas de DNA geralmente são armazenadas como ações concentradas de 10.000 ou 20.000x.
2. Após 90 min de eletroforese, retire cuidadosamente o gel da bandeja e coloque-o em um recipiente com solução de coloração. Coloque-o em um balancim a baixa velocidade de balanço na temperatura ambienteUre por 30 min.
3. Retire o gel de agarose do recipiente de coloração, aperte-o cuidadosamente em um pedaço de tecido de celulose ou papel de filtro para remover o excesso de líquido e coloque-o diretamente em um transiluminador. Ligue a luz UV para visualizar bandas contendo tRNA. Pegue uma fotografia do gel.
4. Coloração de proteínas (opcional).
   1. Descarte a solução de coloração de DNA de forma segura (de acordo com os procedimentos de segurança) e substitua-a por solução de 50 ml de Blue Brilliant Blue (CBB). Coloque a bandeja em um balancim à temperatura ambiente e coloque durante a noite (> 12 h). Descarte a solução de coloração CBB e substitua-a por 50 mL de PBS para remover o excesso de corante. Destain durante 1 h em um rocker.
5. Visualize os complexos de ARNt que contêm proteínas sob um transiluminador leve e tirar fotografias do gel para comparar com a imagem de ARN tRNA UV.

Grandes quantidades de ARNt (UUU) podem ser obtidas expressando o gene de ARNt em E. coli sob o controle de um forte promotor de T7 indutível. O tRNA expresso (UUU) se acumula no citoplasma e é enriquecido sobre o conjunto de tRNAs naturalmente abundantes. Um processo de purificação em duas etapas consistindo em um passo de captura / extração e um passo de filtração / polimento de gel foi utilizado para obter o ARNt da classe EMSA. O passo de captura / extração usa pH 4.3 fenol para obter a precipitação simultânea de proteína, detritos celulares, DNA e extração de ARNt (e outras moléculas de ARN). Nesta etapa, a quantidade de pool total de tRNA pode ser avaliada por eletroforese em um gel de agarose a 2% p / v. O segundo passo incorpora cromatografia de filtração em gel que separa as espécies de RNA de acordo com seu tamanho molecular. O traço UV a 254 nm é usado para monitorar a separação e identificar os principais picos de eluição ( Figura 1Topo). As alíquotas representativas das fracções de pico foram executadas num gel de agarose a 2% p / v para análise ( Figura 1 inferior ). A maioria das moléculas de ARNt co-eluídas em um único pico (o meio) da cromatografia correu (aqui, 75,5 mL em uma coluna de tamanho de cama de 120 mL). Ao separar pools que contêm uma única espécie sobreexpressa, como o tRNA (UUU), mais de 90% das moléculas de ARNt do grupo pertencem ao tRNA específico, enquanto as moléculas restantes correspondem aos tRNAs naturalmente abundantes. Os picos secundários são observados antes e depois do pico central contendo tRNA. O (s) pico (s) antes contém moléculas de ARN maiores parcialmente degradadas (fracções 26 e 32; barras na Figura 1 ), e o (s) pico (s) no final do processo de purificação contém ARNs muito pequenos e contaminantes (fracções 45 e 51; Barras na Figura 1 ). Depois de juntar as frações sob o pico central (frações 39-43; Barras na Figura 1 ), a quantidade de ARNt purificado pode ser quantificada por espectroscopia de UV e / ou por comparação com padrões de tamanho molecular em um gel de agarose a 2% p / v.

As amostras TcdA e tRNA (UUU) podem ser misturadas em diferentes proporções molares de 1,0 a 10,0 usando um esquema de amostragem semi-logarítmica ( Tabela 1 ) e separadas em géis de agarose a 2% p / v ( Figura 2 ). Dependendo da estabilidade dos complexos proteína-tRNA e da estequiometria de ligação, uma ou várias faixas podem ser visualizadas no gel. Para TcdA-tRNA (UUU), é formado um complexo estequiométrico que funciona como uma banda isolada contendo proteína e tRNA. Normalmente, o tRNA gratuito migra mais rapidamente e pode ser observado na parte inferior do gel, enquanto que os complexos proteína-tRNA, que são menos carregados negativamente e são maiores em tamanho, tendem a migrar mais devagar. A Figura 2 mostra uma representação 2% p / v de gel de agarose de TcdA-tRNA (UUU). Na Figura 2 , as bandas TcdA-only e tRNA-only servem como controles negativos. À medida que a relação molar TcdA: tRNA (UUU) aumenta, a quantidade de complexos TcdA-tRNA (UUU) formados à custa da banda de tRNA livre aumenta. Observe que a intensidade do tRNA livre diminui à medida que a quantidade de TcdA aumenta. O primeiro complexo a formar é um complexo estequiométrico 2: 1 contendo uma molécula de tRNA por dímero de TcdA (visível nas pistas com 10, 20 ou 30 μM de TcdA). Na saturação de TcdA, desenvolve-se um complexo de TcdA-tRNA (UUU) de peso molecular maior que contém um complexo estequiométrico 2: 2, em que ambas as subunidades de TcdA estão ligadas a uma molécula de tRNA (UUU) cada uma (visível em pistas com 30, 50 ou 75 μM). As duas últimas pistas com TcdA (50 ou 75 μM) ligaram todo o tRNA na reação e não possuem uma banda de tRNA livre.

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Figura 1: Purificação de tRNA (UUU) por Gel Filtration. Cromatograma (topo) da filtração em gel de ARNt (UUU) sobre uma coluna de filtração de gel preparativa de alta resolução registrada a 254 nm. O pico mais alto, contendo o pool de ARNt enriquecido em tRNA (UUU), é eluído a ~ 75,5 mL. Um gel de agarose a 2% p / v (inferior) foi executado com alíquotas das várias frações de eluição de ARNt. M, escada de tamanho molecular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ensaio de Retardamento de Gel com TcdA e tRNA (UUU). EMSA fornece evidências para a ligação física de tRNA para TcdA. As amostras foram executadas em um gel de agarose a 2% p / v a 4 ° C durante 90 min. Uma quantidade fixa de tRNA (UUU), 7,5 μM, foi misturado com quantidades variáveis ​​de TcdA (ver Tabela 1 ) e os complexos proteína-tRNA foram separados durante a execução da eletroforese. O gel foi corado e visualizado em um transiluminador UV. Cada pista contém 5 μL de amostra. M, escada de tamanho molecular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O teste de retardamento de gel de proteína-ARNt de agarose aqui descrito pode ser modificado de várias maneiras. Primeiro, a porcentagem de agarose no gel pode ser reduzida para permitir a separação e visualização de complexos proteína-ARNt significativamente maiores que os analisados ​​aqui (120 kDa). Em segundo lugar, se a proteína alvo for termolábil, devem ser tomadas precauções adicionais para garantir que a temperatura seja mantida abaixo da temperatura máxima aceitável, movendo o aparelho de eletroforese para uma sala fria ou usando pacotes de gelo dentro da câmara de eletroforese para dissipar imediatamente o calor produzido Durante a corrida. Outras composições de tampão ( por exemplo , TB 0,5X, tris-borato) e parâmetros de funcionamento (> 20 V / cm) podem ser modificados para diminuir o tempo de execução, se necessário ou aceitável para as amostras ¹¹ . A concentração sugerida de MgCl2 pode ser reduzida se a degradação de ARN for observada durante o passo de preparação da amostra, uma vez que a cati divalenteOns potencialmente podem catalisar a clivagem de ácidos nucleicos.

A principal limitação da técnica é que as bandas de proteína-ARNt são normalmente ligeiramente mais difusas do que as observadas em métodos de retardamento de gel à base de acrilamida, que tendem a ser mais nítidas e claras. Outra limitação é que os géis mais amplos e longos podem ser necessários para a análise simultânea de múltiplas amostras e se os complexos proteína-tRNA de vários tamanhos e carga devem ser resolvidos.

Em comparação com os métodos existentes, o teste de retardamento de gel de proteína-tRNA-agarose proporciona uma redução significativa no trabalho e no tempo, desde a preparação da amostra até a análise. Os géis de acrilamida, contêm produtos químicos nocivos, são trabalhosos para preparar e levar mais tempo para polimerizar. Em contraste, os géis de agarose são simples, rápidos para moldar e ajustar, e não envolvem produtos químicos tóxicos. O experimento pode ser completado em 2 h. Isso inclui 30 minutos para o gel, 15 min para preparação da amostra (que pode serFeito durante o arrefecimento da agarose), 90 min para eletroforese e visualização.

As futuras aplicações do método podem refinar os métodos de detecção utilizados neste protocolo e aplicá-lo à detecção de espécies de ARN menos abundantes e mais instáveis ​​ou a complexos de proteína que podem ser expressos somente em quantidades muito pequenas. A rotulagem do ARN ou do componente de proteína com fluoróforos altamente sensíveis permitiria a detecção de menores quantidades de complexos proteína-ARN. Além disso, o uso de fluoróforos com picos de emissão / excitação não sobrepostos poderia permitir experiências de multiplexação em que diferentes espécies de proteínas e / ou RNA poderiam ser visualizadas simultaneamente em uma única experiência.

Existem três etapas críticas neste protocolo. O primeiro e mais óbvio passo crítico é a expressão e purificação do tRNA (UUU). Se a quantidade de tRNA purificado (UUU) estiver abaixo de um limite de detecção mínimo certo (entre 25-200 ng de tRNA por banda), Ou bandas de degradação tornam-se aparentes como contaminantes de tamanho molecular mais baixo, o ARNt deve ser descartado e re-purificado. O uso de fenol ácido (pH 4,3) durante a extração de ARNt é essencial, uma vez que eleva seletivamente o DNA enquanto mantém o ARN solúvel. O segundo passo crítico diz respeito à preparação das amostras de proteína-ARNt para análise. Devem ser utilizadas quantidades suficientes de proteína e ARNt para permitir a detecção robusta de todos os complexos formados. As proporções molares proteína-tRNA devem ser ajustadas para deslocar o equilíbrio para a formação do complexo. O terceiro passo crítico é a eletroforese. O tampão TBE deve ser usado fresco (não reutilizado) e é necessário manter os géis de agarose a temperaturas onde os complexos proteína-ARNt são estáveis ​​e não desnaturalizam (tipicamente 4-10 ° C). Deve-se ter cuidado para manter o gel de agarose gelado durante toda a eletroforese, por exemplo, envolvendo a câmara de eletroforese com gelo e, sempre que possível, executando o experimentoT em uma sala fria a 4 ° C.

Nós demonstramos um método direto para análise, caracterizando os complexos proteína-ARNt usando TcdA-tRNA (UUU) como sistema modelo e usando eletroforese em gel de agarose em vez de eletroforese de acrilamida. O último leva mais tempo para completar e é consideravelmente mais laborioso. Usando este método, a separação eletroforética em géis de agarose a 2% p / v (formatos de gel de 8 cm) pode ser realizada em menos de 90 min. Esta é uma ferramenta conveniente para a análise das interações proteína-ARNt e permite a análise simultânea de múltiplas amostras. Variantes de tRNA e / ou proteína mutantes podem ser rastreados para ligação e estabilidade usando este método.

Os autores não têm nada a revelar.

MCV é membro do programa Intramural CIB "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). A pesquisa que conduziu a esses resultados recebeu financiamento do Instituto Espanhol de Saúde Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), o Ministério da Economia e Competitividade (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP para MCV) ), O Governo Regional de Madri (S2010 / BD-2316 a MCV) e o Projeto ComplexINC (Contrato n.º 279039 a MCV) da Comissão Européia (Programa-Quadro 7 (FP7)). Os financiadores não tiveram papel no design do estudo, na coleta e análise de dados, na decisão de publicação ou na elaboração do manuscrito.