Ensayos de Retardo de Gel de ARNt de Proteína-ARNt para el Análisis del

Se presenta un protocolo para la producción de tRNA (UUU) y el análisis de tRNA (UUU) en complejo con la enzima TcdA mediante ensayos de retardo de gel de agarosa.

Demostramos métodos para la expresión y purificación de tRNA (UUU) en Escherichia coli y el análisis por ensayos de retardo de gel de la unión de tRNA (UUU) a TcdA, una N6-treonilcarbamoilandenosina (t6A) deshidratasa, que cicla el treonilcarbamoil Cadena lateral unida a A37 en el lazo del vástago anticodon (ASL) de tRNAs a t ⁶ A cíclico (ct ⁶ A). La transcripción del gen sintético que codifica el ARNt (UUU) se induce en E. coli con 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y las células que contienen ARNt se recogen 24 h después de la inducción. La fracción de ARN se purifica utilizando el método de extracción con fenol ácido. El ARNt puro se obtiene mediante una cromatografía de filtración en gel que separa eficientemente las moléculas de tRNA de tamaño pequeño de ácidos nucleicos más grandes o intactos o fragmentados. Para analizar TcdA vinculante a tRNA (UUU), TcdA se mezcla con tRNA (UUU) y se separó en un nativo gel de agarosa a 4 ° C.El tRNA libre (UUU) migra más rápidamente, mientras que los complejos TcdA-tRNA (UUU) experimentan un retraso de la movilidad que se puede observar al teñir el gel. Se demuestra que TcdA es un tRNA (UUU) de unión a la enzima. Este ensayo de retardo de gel puede usarse para estudiar los mutantes de TcdA y los efectos de los aditivos y otras proteínas en la unión.

El ensayo de retraso del gel ¹ (también conocido como ensayo de cambio de movilidad electroforética, EMSA) es un método electroforético diseñado para estudiar y caracterizar las interacciones proteína-ácido nucleico. Permite el análisis de las interacciones proteína-ADN, así como proteína-ARN y en particular, las interacciones entre las proteínas de unión a tRNA y ARNt, utilizando componentes purificados o mezclas complejas de proteínas ( por ejemplo , lisados ​​celulares) o ácidos nucleicos ( por ejemplo , ARNt quinielas). Hemos aplicado ensayos de retardo de gel al estudio de la interacción entre tRNA purificado (UUU) y TcdA, una N6-treonilcarbamoyladenosina (t ⁶ A) deshidratasa, que cicla la cadena lateral de treonilcarbamoilo unida a A37 en el bucle anticodon del tallo (ASL) De tRNAs a t ⁶ cíclico (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA es también conocido como CsdL ^{3 ,}El gen tcdA / csdL forma un grupo con los genes csdA y csdE ⁵ , que codifican la cisteína desulfurasa y el aceptor de azufre del sistema de cysteine ​​sulfinase desulfinate (CSD) y se requiere para sostener la función TcdA in vivo [ ^3] .

La razón detrás de los ensayos de retardación de gel es que, mientras que las moléculas de ácidos nucleicos libres migran rápidamente al frente de geles de acrilamida o agarosa en virtud de su gran carga negativa, la movilidad electroforética de complejos de proteínas de los mismos ácidos nucleicos se reduce drásticamente. La reducción de la movilidad se visualiza como un "cambio" en los complejos ácido nucleico-proteína, que se resuelven como bandas discretas. El complejo de ácido nucleico-proteína con carga positiva y mayor muestra un mayor cambio o reducción en la movilidad en un gel.

Dado que la neutralización de carga del complejo es un fenómeno universalPara complejos proteína-ácido nucleico, el ensayo de retardo de gel se puede aplicar a una amplia gama de complejos y tipos de ácidos nucleicos. El método es simple, económico y se puede realizar en laboratorios con un equipo mínimo. Requiere sólo pequeñas cantidades de proteínas y tRNA. Esta es una ventaja sobre las técnicas biofísicas alternativas, que usualmente consumen mayores cantidades de muestra.

El ensayo de retardo de gel ha sido ampliamente utilizado para el estudio de factores de transcripción. El ensayo se ha utilizado para analizar la cinética de unión, la resistencia y la especificidad de los factores de transcripción para muchas secuencias de ADN diferentes. Fue precisamente en este campo que se desarrolló por primera vez la EMSA ^{6 , 7} . También se han utilizado ensayos de retardo de gel con moléculas de ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} y tRNA en la investigación de ribosomasY analizar, como aquí, las enzimas que modifican nucleósidos de tRNA post-transcripcional.

Muchos parámetros diferentes afectan el resultado de un ensayo de retardo de gel, tal como la temperatura, la calidad de la proteína y la muestra de ARNt, y la resistencia de la unión. La planificación cuidadosa y la ejecución del experimento son cruciales para la interpretación de los resultados del ácido nucleico libre y de las especies ligadas a proteínas. Aquí, se utilizó el gen sintético que codifica tRNA (UUU) clonado en un vector de expresión cuyo promotor carece de la Shine-Dalgarno ribosoma sitio de unión, lo que conduce a la síntesis de grandes cantidades de tRNA ² . Este protocolo detallado pretende proporcionar una guía clara para realizar experimentos de retardo de gel tRNA mientras se evitan errores comunes.

Precaución: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) pertinentes. Varios de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y corrosivos. Utilice las prácticas apropiadas al realizar la extracción de ARNt usando fenol, incluyendo el uso de una campana extractora de humos y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados, etc. ). Este protocolo utiliza una tinción de ácido nucleico no tóxica. El uso de manchas alternativas puede requerir precauciones adicionales y eliminación especial del agente de tinción si es tóxico y / o carcinógeno ( por ejemplo , bromuro de etidio).

1. Preparación del gel de agarosa

1. Se pesan 2 g de agarosa y se añade a una botella de vidrio para preparar un gel de agarosa al 2% p / v.
2. Añadir 100 ml de solución tampón de tris-borato-etilendiaminotetraacético (EDTA) (TBE) 1x a la botella que contiene agarosa. Derretir por el calentamiento en un microondas. A intervalos de 30 s, agitar el contenido para mezclarY repita este paso hasta que la agarosa se disuelva completamente. Deje que la solución de agarosa se enfríe a aproximadamente 50-60ºC.
3. Cinta los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde, coloque un peine adecuado para crear los pozos y echar la agarosa fundida en ella. Evitar la formación de burbujas y dejar que se solidifique a temperatura ambiente.
4. Una vez solidificado, coloque la bandeja de gel en una unidad de electroforesis y llénela con tampón TBE hasta que el gel esté completamente cubierto.

2. Preparación del ARNt

1. Express tRNA (UUU) en E. coli
   1. Por la mañana, use un vial de E. coli BL21 congelado (DE3) transformado con el vector de expresión pET23d-EcUUU ² (contiene el gen que codifica el ARNt de E. coli (UUU)), para cortar un caldo de Luria de baja sal (LB) Placa suplementada con 100 μg / ml de ampicilina. Invertir la placa y colocarla en un incubador a 37 ° C hasta que aparezcan colonias (finales de la tardeOon).
   2. Inocular una sola colonia, bien cultivada, en 5 mL LB más 100 μg / mL de ampicilina y crecer durante la noche a 220 rpm a 37 ° C.
   3. A la mañana siguiente, sedimentar las células (6.500 xg durante 10 min a 4 ° C), reemplazar el medio con 5 ml de LB fresco más 100 μg / ml de ampicilina y resuspender. Utilice esta suspensión para inocular 200 ml de LB más 100 μg / ml de ampicilina. Crecer durante 5 h a 220 rpm a 37 ° C.
   4. Cuando la densidad óptica del cultivo a 590 nm (DO ₅₉₀ ) ha alcanzado 0,6 - 0,8, añadir IPTG 1 mM al cultivo para activar la expresión del gen tRNA (UUU). Incubar a 37 ° C durante 3 h.
   5. La cosecha de las células por centrifugación del cultivo a 6.500 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Lisis y extracción
   1. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis (acetato sódico 0,3 M, EDTA 10 mM). A partir de este momento, se usaron tampones autoclavados y se conservaron todas las muestras que contenían ARNt a 4ºC para evitar queDegradación del ARN.
   2. Añadir 1 volumen de fenol ácido (pH 4,3) al sedimento celular resuspendido en la campana extractora. Mezclar durante 1 min por inversión para lisar las células y centrifugar a 10.000 xg (10 min, 4 ° C).
   3. Recoger la fase acuosa superior que contiene el tRNA soluble (UUU) (y concentraciones más pequeñas de los otros grupos de tRNA) usando una pipeta teniendo cuidado de no aspirar la fase orgánica (inferior). Deseche la capa inferior y el sedimento, que consiste en la fase orgánica y los residuos celulares, en un recipiente adecuado.
   4. Precipitar el ARNt mezclando a fondo la fase soluble (acuosa) con 2,5 volúmenes de etanol al 100% v / v por inversión durante 1 h a 4ºC. Centrifugar la mezcla a 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
   5. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento rico en ARNt en 4 ml de tampón de filtración en gel (fosfato de sodio 20 mM o fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Ejecutar 5 μ l del grupo de tRNA resuspendido en un gel de agarosa al 2% p / v.
      NOTA:El tRNA de buena calidad aparece como una sola banda (tamaño molecular entre 50-100 pb).
3. La purificación de tRNA (UUU)
   1. Siguiendo la práctica cromatográfica estándar ¹² , cargar el ARNt resuspendido (UUU) sobre una columna de gel de preparación preparativa de alta resolución (dimensiones: 16 x 600 mm, volumen de lecho: 120 ml, rango de resolución: 1.000-70.000 Da) previamente equilibrada en tampón de filtración en gel (fase móvil). Ajuste el caudal a 1 mL / min para eluir las muestras.
      NOTA: El pico de ARNt (UUU) se eluye aproximadamente a 75,5 ml. Típicamente, se puede obtener un rendimiento de 0,5 - 1,0 mg / L de ARNt de cultivo.
   2. Analizar las muestras a volúmenes de elución representativos mediante electroforesis de 5 - 10 μl de cada muestra en un gel de agarosa al 2% p / v.

3. Preparación de la muestra

1. Expresar y purificar TcdA según López-Estepa et al . ² .
   NOTA: Hasta 250 μMTcdA se puede utilizar para el estudio.
2. Pipetear la cantidad correspondiente de TcdA según la Tabla 1 en tubos de centrífuga de 1,5 mL debidamente etiquetados. Añadir 1,6 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (concentración final) y mezclar suavemente con una pipeta. Cerrar la tapa e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Añadir 10 μM de adenosina trifosfato (ATP) y 50 mM MgCl ₂ (concentraciones finales). Mezclar con una pipeta e incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Añadir tRNA purificado (UUU) (sección 2.3) según la tabla 1 , mezclar con una pipeta e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 100 μl de volumen final. Mezclar adecuadamente y añadir glicerol hasta una concentración final de 10% v / v.
6. Vórtice la muestra y centrifugue brevemente el contenido del tubo (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Carga de gel y desarrollo de electroforesis

1. Colocar la unidad de electroforesis en una bandeja llena de hielo triturado para mantener la cámara a 4 ° C durante la ejecución de la electroforesis.
2. Cuidadosamente, pipetee 5 μL de cada muestra en el pocillo correspondiente. Añadir un marcador de tamaño de ADN adecuado.
3. Enchufe los electrodos en las ranuras correspondientes de la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 100 V y haga funcionar el gel durante 90 min.

5. Tinción con gel para observar la interacción ARNt-Proteína

1. Preparar la solución de tinción mezclando 50 ml de TBE con 1x de una tinción de ADN adecuada. Evite exponer la solución de tinción a la luz solar cubriendo el contenedor de tinción con papel de aluminio.
   NOTA: Las manchas de ADN se almacenan normalmente en 10.000 o 20.000x de existencias concentradas.
2. Después de 90 minutos de electroforesis, retire cuidadosamente el gel de la bandeja y colóquelo en un recipiente con solución de tinción. Colóquelo sobre un balancín a baja velocidad de oscilación a temperatura ambienteUre durante 30 min.
3. Retire el gel de agarosa del recipiente de tinción, tóquelo cuidadosamente en un trozo de papel de celulosa o papel de filtro para eliminar el exceso de líquido y colóquelo directamente sobre un transiluminador. Encienda la luz UV para visualizar las bandas que contienen tRNA. Tome una fotografía del gel.
4. Tinción de proteínas (opcional).
   1. Deseche la solución de tinción de ADN de forma segura (de acuerdo con los procedimientos de seguridad) y sustitúyala con 50 ml de solución de Coomassie Brilliant Blue (CBB). Colocar la bandeja sobre un balancín a temperatura ambiente y teñir durante la noche (> 12 h). Deseche la solución de tinción CBB y reemplácela con 50 ml de PBS para eliminar el exceso de colorante. Destainar por 1 h en un balancín.
5. Visualizar los complejos de ARNt que contienen proteínas en un transiluminador ligero y tomar fotografías del gel para comparar con la imagen de gel UV de tRNA.

Se pueden obtener grandes cantidades de ARNt (UUU) expresando el gen tRNA en E. coli bajo el control de un fuerte promotor T7 inducible. El tRNA expresado (UUU) se acumula en el citoplasma y se enriquece sobre el conjunto de tRNAs naturalmente abundantes. Se utilizó un proceso de purificación en dos etapas que consistía en una etapa de captura / extracción y un paso de filtración / pulido en gel para obtener tRNA de calidad EMSA. El paso de captura / extracción utiliza pH 4,3 fenol para lograr la precipitación simultánea de proteínas, residuos celulares, ADN, y la extracción de tRNA (y otras moléculas de ARN). En este paso, la cantidad de pool de tRNA total se puede evaluar por electroforesis en un gel de agarosa al 2% p / v. La segunda etapa incorpora cromatografía de filtración en gel que separa las especies de ARN de acuerdo con su tamaño molecular. La traza UV a 254 nm se utiliza para monitorizar la separación e identificar los principales picos de elución ( Figura 1Arriba). Alícuotas representativas de las fracciones pico se ejecutaron en un gel de agarosa al 2% p / v para el análisis ( Figura 1 de fondo ). La mayoría de las moléculas de ARNt co-eluye en un único pico (el medio) de la cromatografía (aquí, 75,5 ml en una columna de tamaño de lecho de 120 ml). Cuando se separan grupos que contienen una sola especie sobreexpresada, como tRNA (UUU), más del 90% de las moléculas de tRNA pertenecen a ese ARNt específico, mientras que las moléculas restantes corresponden a los tRNAs naturalmente abundantes. Los picos secundarios se observan tanto antes como después del pico central que contiene tRNA. Los picos anteriores contienen moléculas de ARN mayores parcialmente degradadas (fracciones 26 y 32, barras de la Figura 1 ) y el (los) pico (s) al final del ciclo de purificación contienen ARN y contaminantes muy pequeños (fracciones 45 y 51; Barras en la Figura 1 ). Después de reunir las fracciones bajo el pico central (fracciones 39-43; Barras en la Figura 1 ), la cantidad de ARNt purificado puede cuantificarse por espectroscopia de UV y / o por comparación con patrones de tamaño molecular en un gel de agarosa al 2% p / v.

Las muestras de TcdA y tRNA (UUU) se pueden mezclar a diferentes relaciones molares de 1,0 a 10,0 usando un esquema de muestreo semi-logarítmico ( Tabla 1 ) y se separan en geles de agarosa al 2% p / v ( Figura 2 ). Dependiendo de la estabilidad de los complejos proteína-ARNt y de la estequiometría de unión, se puede visualizar una o varias bandas en el gel. Para TcdA-tRNA (UUU), se forma un complejo estequiométrico que funciona como una banda aislada que contiene tanto proteína como ARNt. Típicamente, el ARNt libre migra más rápido y se puede observar en la parte inferior del gel, mientras que los complejos proteína-ARNt, que son menos cargados negativamente y son de mayor tamaño, tienden a migrar más lentamente. La figura 2 muestra una representación Ativo al 2% p / v de los complejos TcdA-tRNA (UUU). En la Figura 2 , las bandas sólo de TcdA y tRNA solo sirven como controles negativos. A medida que aumenta la relación molar TcdA: tRNA (UUU), aumenta la cantidad de complejos TcdA-tRNA (UUU) formados a expensas de la banda libre de tRNA. Obsérvese que la intensidad del ARNt libre disminuye a medida que aumenta la cantidad de TcdA. El primer complejo a formar es un complejo estequiométrico 2: 1 que contiene una molécula de ARNt por dímero de TcdA (visible en los carriles con TcdA 10, 20 ó 30 μM). A la saturación de TcdA, se desarrolla un complejo TcdA-tRNA (UUU) de mayor peso molecular que contiene un complejo estequiométrico 2: 2, donde ambas subunidades TcdA están unidas a una molécula de tRNA (UUU) cada una (visible en carriles con 30, 50 o 75 mu M). Los dos últimos carriles con TcdA (50 o 75 μ M) han consolidado todos los tRNA en la reacción y carecen de una banda de tRNA libre.

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Figura 1: Purificación de tRNA (UUU) por filtración en gel. Cromatograma (arriba) de la filtración en gel de tRNA (UUU) sobre una columna de gel de preparación preparativa de alta resolución registrada a 254 nm. El pico más alto, que contiene el grupo de tRNA enriquecido en tRNA (UUU) se eluye a ~ 75,5 ml. Se llevó a cabo un gel de agarosa al 2% p / v (fondo) con alícuotas de las diversas fracciones de elución de ARNt. M, escala de tamaño molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ensayo de Retardo de Gel con TcdA y tRNA (UUU). EMSA proporciona pruebas de la unión física de tRNA a TcdA. Las muestras se pusieron en un gel de agarosa al 2% p / v a 4ºC durante 90 minutos. Una cantidad fija de tRNA (UUU), 7,5 μM, con cantidades variables de TcdA (véase la Tabla 1 ), y los complejos proteína-ARNt se separaron durante la ejecución de la electroforesis. El gel se tiñó y se visualizó en un transiluminador de UV. Cada carril contiene 5 μl de muestra. M, escala de tamaño molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ensayo de retardo de gel de proteína-ARNt-agarosa descrito en el presente documento puede modificarse de varias maneras. En primer lugar, el porcentaje de agarosa en el gel puede reducirse para permitir la separación y visualización de complejos proteína-ARNt significativamente mayores que el analizado aquí (120 kDa). En segundo lugar, si la proteína diana es termolábil, se deben tomar precauciones adicionales para asegurar que la temperatura se mantiene por debajo de la temperatura máxima aceptable moviendo el aparato de electroforesis a una cámara frigorífica o utilizando bolsas de hielo dentro de la cámara de electroforesis para disipar inmediatamente el calor producido Durante la carrera. Se pueden modificar otras composiciones de tampón ( por ejemplo , 0,5X TB, tris-borato) y parámetros de funcionamiento (> 20 V / cm) para acortar el tiempo de ejecución si es necesario o aceptable para las muestras ¹¹ . La concentración de MgCl2 sugerida puede reducirse si se observa la degradación del ARN durante la etapa de preparación de la muestra, ya que la cati divalenteOns potencialmente pueden catalizar la escisión de ácidos nucleicos.

La principal limitación de la técnica es que las bandas de proteína-ARNt son típicamente ligeramente más difusas que las observadas en los métodos de retardo de gel a base de acrilamida, que tienden a ser más nítidas y claras. Otra limitación es que los geles más largos y largos pueden ser necesarios para el análisis simultáneo de muestras múltiples y si se deben resolver complejos proteína-ARNt de diversos tamaños y carga.

En comparación con los métodos existentes, el ensayo de retardo del gel de proteína-ARNt-agarosa proporciona una reducción significativa en el tiempo de trabajo y tiempo desde la preparación de la muestra hasta el análisis. Los geles de acrilamida, que contienen productos químicos dañinos, son laboriosos para preparar y tardan más en polimerizarse. Por el contrario, los geles de agarosa son simples, rápidos de moldear y fijar, y no implican productos químicos tóxicos. El experimento se puede completar en 2 h. Esto incluye 30 min para que el gel se endurezca, 15 min para la preparación de la muestra (que puede serHecho mientras se enfría la agarosa), 90 minutos para la electroforesis y visualización.

Aplicaciones futuras del método pueden perfeccionar los métodos de detección utilizados en este protocolo y aplicarlo a la detección de especies de ARN menos abundantes, más inestables, oa complejos de proteínas que pueden expresarse sólo en cantidades muy pequeñas. Etiquetar el ARN o el componente de la proteína con fluoróforos altamente sensibles permitiría la detección de cantidades más pequeñas de proteína-ARN complejos. Además, el uso de fluoróforos con picos de emisión / excitación que no se superponen podría permitir experimentos de multiplexación donde diferentes especies de proteína y / o ARN podrían visualizarse simultáneamente en un solo experimento.

Hay tres pasos críticos en este protocolo. El primer y más evidente paso crítico es la expresión y purificación de tRNA (UUU). Si la cantidad de ARNt purificado (UUU) está por debajo de un cierto límite mínimo de detección (entre 25-200 ng de tRNA por banda), O las bandas de degradación se hacen evidentes como contaminantes de menor peso molecular, el ARNt debe ser desechado y purificado nuevamente. El uso de fenol ácido (pH 4,3) durante la extracción de ARNt es esencial, ya que selectivamente precipita el ADN mientras se mantiene soluble el ARN. El segundo paso crítico se refiere a la preparación de las muestras de proteína-ARNt para su análisis. Deben utilizarse cantidades suficientes de proteína y ARNt para permitir la detección robusta de todos los complejos formados. Las relaciones molares proteína-ARNt deben ajustarse para desplazar el equilibrio hacia la formación de complejos. El tercer paso crítico es la electroforesis. El tampón TBE debe utilizarse fresco (no reutilizado) y es necesario mantener los geles de agarosa a temperaturas en las que los complejos proteína-ARNt son estables y no desnaturalizan (típicamente 4-10 ° C). Se debe tener cuidado para mantener frío el gel de agarosa durante toda la electroforesis, por ejemplo, rodeando la cámara de electroforesis con hielo y, siempre que sea posible, ejecutando el experimentoT en una habitación fría a 4 ° C.

Hemos demostrado un método sencillo para el análisis, la caracterización de proteínas-ARNt complejos utilizando TcdA-tRNA (UUU) como un sistema modelo, y utilizando electroforesis en gel de agarosa en lugar de electroforesis de acrilamida. Este último tarda más en completarse y es considerablemente más laborioso. Utilizando este método, la separación electroforética en geles de agarosa al 2% p / v (formatos de gel de 8 cm) se puede conseguir en menos de 90 minutos. Esta es una herramienta conveniente para el análisis de las interacciones proteína-ARNt y permite el análisis simultáneo de muestras múltiples. Las variantes de tRNA y / o mutantes de proteínas pueden ser rastreadas para la unión y estabilidad usando este método.

Los autores no tienen nada que revelar.

MCV es miembro del Programa Intramural CIB "Máquinas Moleculares para una Vida Mejor" (MACBET). La investigación que condujo a estos resultados ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), el Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R y SAF2015-72961-EXP a MCV) ), El Gobierno Regional de Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) y el proyecto ComplexINC (Contrato nº 279039 a MCV) de la Comisión Europea (Programa Marco 7 (FP7)). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.