Criação

A produção de carrapatos criadas em laboratório saudáveis ​​é essencial para estudos sobre a biologia carrapato, e carrapato-patógeno interações. Aqui demonstramos um protocolo simples para a alimentação carrapato imaturo que é rentável e menos stressante para ratinhos.

Ixodes scapularis , o vetor da doença de Lyme, é um dos vetores de doenças mais importantes no Leste e no Centro-Oeste dos Estados Unidos. Esta espécie é um carrapato de três hospedeiros que requer uma refeição de sangue de um hospedeiro vertebrado para cada estágio de desenvolvimento, e as fêmeas adultas requerem uma refeição de sangue para reprodução. Os carrapatos larvalos ligam-se ao seu hospedeiro durante 3-5 dias para alimentação e deixam o hospedeiro quando totalmente engorgado. Esta dependência de vários hospedeiros diferentes e o tempo de ligação prolongado para ingurgitamento complica a criação de carraças no ambiente laboratorial. No entanto, para entender a biologia das carraças e as interações do carrapato-patógeno, a produção de carrapatos saudáveis ​​criados em laboratório é essencial. Aqui, demonstramos um protocolo simples e econômico para a alimentação de carrapatos imaturos em camundongos. Modificamos os protocolos existentes para diminuição do estresse em camundongos e aumento do sucesso e sobrevivência da alimentação de carrapatos usando gaiolas descartáveis ​​sem fundo de malha para evitar o contato de carrapatos.Água contaminada com urina e fezes de ratos.

Os carrapatos são ectoparasitas hematófagos obrigatórios de vertebrados e são distribuídos em todo o mundo. Nos Estados Unidos, pelo menos 11 espécies de carrapatos são vetores de patógenos de importância para a saúde pública ¹ . Ixodes scapularis é responsável pela transmissão de vários patógenos, tais como os agentes causadores da doença de Lyme ( Borrelia burgdorferi ), febre recidivante ( B. miyamotoi), anaplasmose granulocítica humana ( Anaplasma phagocytophilum ) e babesiose (Babesia spp.). Apesar da importância de I. scapularis como vetor de doença, a coleta desses aracnídeos em abundância da natureza para estudos no laboratório nem sempre é viável. Portanto, a produção de carrapatos saudáveis ​​criados em laboratório é essencial para estudos de biologia de carrapatos e interações de carrapatos-patógenos.

O ciclo de vida de todos os carrapatos duros (família Ixodidae), incluindo I. scapularis, consiste no ovo e em três activE estádios: larva, ninfa e adulto. Cada estágio ativo se alimenta de um hospedeiro vertebrado. As interações complexas que ocorrem entre os carrapatos e seus hospedeiros ao longo de vários dias de apego e alimentação são quase impossíveis de replicar usando alimentadores artificiais, e é improvável que fornecem números suficientes de carrapatos alimentados para a criação em massa ^{2 , 3 , 4} . Portanto, ratos vivos e coelhos são usados ​​mais freqüentemente como hospedeiros para a criação de imaturos (larvas e ninfas) e estádios maduros (adultos) de carrapatos, respectivamente. A necessidade de múltiplos hospedeiros para alimentação de sangue durante cada estágio de desenvolvimento complica a criação de carrapatos e é tempo e custo intensivo ^{5 , 6 , 7} . A maioria dos protocolos de criação de carrapatos requerem manter os ratos em uma gaiola ^{7 , 8} ou em umge de tais dimensões que o animal não pode mover-se livremente e se lamber ^{6, 9, 10.}

Estas gaiolas cilíndricas são depois transferidos para uma gaiola de caixa de sapatos com uma grelha de arame. Ingurgitadas, carrapatos destacadas são depois recolhidos a partir da água por baixo. No entanto, este método resulta em expor alimentado carrapatos à água contaminada com fezes e urina que pode aumentar o crescimento de fungos e carrapatos mortalidade ^9. Além disso, aumenta a possibilidade de fuga carrapato a partir da calha de água, bem como fazendo com que o stress a ratinhos. Para contornar estes problemas, que aqui demonstrar alimentação carrapato larval em ratinhos dentro de plástico do tipo caixa de sapatos gaiolas descartáveis. Este método permite que o comportamento normal dos ratos, os aumentos ingurgitadas recuperação carraça, e reduz a mortalidade carrapato devido a contaminação.

O protocolo (Número-00682) descrito a seguir é aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nevada Reno e segue as diretrizes da Universidade de Nevada, animal comitê de ética em pesquisa do Reno. Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e um cone de ponta foi utilizada para manter os níveis de isoflurano contínua durante 20 min. Uma pomada veterinário foi usado para evitar a secagem dos olhos sob anestesia. pitada dedo do pé foi usada para determinar o nível de anestesia e a taxa de respiração foi medido ao longo do procedimento. Ratos foram mantidos em gaiolas individuais e monitorados até que a consciência foi recuperado. Os ratinhos foram usados ​​apenas uma vez para a alimentação carrapato e foram sacrificados recuperação da carraça. A eutanásia foi realizada pelo Laboratório de pessoal da equipe Medicina Animal. CO ₂ e deslocamento cervical foram utilizados para a eutanásia de animais.

NOTA: Trabalhando em carrapatos requer o uso de eq de protecção individual completouipment. Para a contagem carrapatos imaturos, usar revestimentos brancos de laboratório, luvas de borracha nitrílica longos para cobrir a abertura da manga do revestimento do laboratório tapado com elásticos, e sapatos fechados. Para infestando ratos com carrapatos, use uma rede de cabelo, macacões descartáveis, luvas de manga comprida sobre as mangas, e tampas do pé. Utilizar combinações de cor branca ou luz para detectar carrapatos rebeldes. Verifique periodicamente luvas e mangas para carrapatos.

1. Quarto Preparação para o alojamento dos animais

1. Designar uma sala separada a ratinhos de casas infestadas com carraças. Coloque uma esteira ou fita adesiva de dupla face tapete pegajoso fora e dentro da porta para evitar a fuga acidental carrapato.

2. Contagem Carrapatos para Mouse Infestação

1. Colocar fita de face dupla em todo as bordas superiores de um x 5" x 14" recipiente de plástico 7" e encher com água a cerca de 2 cm.
2. Colocar uma outra pequena caixa ou uma placa de Petri, no centro do recipiente e encher com água a 1 cm a criação de um &# 34; fosso" em torno deste recipiente
3. Armazenar o frasco contendo larvas ou ninfas dentro da placa de Petri.
4. Use um pincel fino para remover as larvas ou ninfas do frasco e contar sob o microscópio. Contagem de 50 larvas ou ninfas 25 em frascos de cintilação separados. Cobrir os frascos imediatamente com malha de nylon ou de tela de tecido organdy e fechar com bandas de borracha.

3. Infestando ratos com Imaturo Os carrapatos

1. Use uma bancada de trabalho de cor branca ou luz e cole fita dupla face em torno do perímetro da área de trabalho.
2. Anestesiar rato com isoflurano. Verifique o nível de anestesia por pitada dedo do pé. Uma vez anestesiados, transferir o mouse para uma almofada de aquecimento coberta com toalhas de papel e anexar a um cone de nariz para o abastecimento de isoflurano continuou.
3. Aplique de petróleo à base de gelatina pomada para evitar a secura. Nota o padrão de respiração do rato para ajustar os níveis de isoflurano (80 -. 230 respirações por minuto é normal, reduz-se o nível de isoflurano brÉ inferior a 80 respirações por minuto para evitar a morte do animal).
4. Tome um frasco de 50 larvas ou 25 ninfas e coloque carrapatos sob a pele na cabeça entre as orelhas com um pincel ( Figura 1 ). Mantenha o rato sob anestesia durante 20 minutos após a colocação para dar tempo suficiente para as carraças se fixarem.
5. Mova o mouse para um padrão, caixa de plástico sapato-tipo gaiola descartável do mouse com tampas estáticas e cama branca. Fornecer brinquedos, água e alimentos ad libitum como por cuidado normal do mouse.
6. Armazene a gaiola do mouse dentro de uma gaiola de rato ou gerbil maior alinhada com fita adesiva dupla face em torno das bordas superiores. Encha a gaiola exterior com 3 cm de água ( Figura 2 ).

4. Coleta de carrapatos de ratos

1. Os carrapatos imaturos destacam-se entre os dias 3 e 6 da alimentação. Verifique as gaiolas e fossos de água para carrapatos engorged todos os dias após o dia 3.
2. Colete tiques isolados da gaiola entre os dias 4 e 6. Use uma dort escova ou fórceps suaves para pegar carrapatos ingurgitadas e armazenar em frascos de cintilação limpas cobertas com pano de malha de nylon protegido com bandas de borracha.
3. Anestesiar e vá rato no dia 7 para qualquer restantes carrapatos anexas.
4. Verifique a roupa de cama, calha de alimentação, e uma garrafa de água por carrapatos ingurgitadas em ratinhos dia 7. eutanásia seguindo o processo como descrito acima. Autoclave o descartável gaiolas, cama, garrafa de água, e comida calha para evitar carrapatos em jejum escapando.

5. Armazenamento de Fed Carrapatos

1. Manter carrapatos ingurgitadas a 90% de humidade, 20 ° C, e uma luz 0:12: escuro ciclo, num incubador de humidade e temperatura controladas até que muda ocorre. Isto pode demorar cerca de 12 a 18 semanas para ocorrer.
2. Enquanto humidade elevada promove a sobrevivência carrapato, que também faz com que os carrapatos propensas ao crescimento de fungos. Verificar alimentado carrapatos sob o microscópio, pelo menos, uma vez por semana para o molde. Se for detectada, lavar sobreviventes em 70% de etanol durante 5Min., Enxaguar em água, transferir para um papel de filtro para secar e transferir para novos frascos limpos.

Modificamos os protocolos existentes de criação de carrapatos ^{6 , 10} para melhorar a eficiência alimentar e reduzir o estresse no hospedeiro do mouse. Os resultados demonstram que as gaiolas padrão de mouse estilo estilo sapato são bem adequados para a criação de carrapatos. A roupa branca forneceu um bom contraste para fácil coleta de carrapatos alimentados. A maioria dos carrapatos subiu as paredes dos recipientes após a alimentação e foram fáceis de coletar. Além disso, a tampa bem ajustada das caixas plásticas descartáveis ​​(rotineiramente utilizadas para alojar camundongos na UNR) impediu a saída de carraças da caixa. Além disso, não rasparam os ratos para infestação de carraças ( Figura 1 ). Essas mudanças nos protocolos publicados resultaram em apego, ingurgitamento e sobrevida de tiquetaque significativo.

Este protocolo é eficaz em termos de custos, uma vez que não requer quaisquer gaiolas de rato especiais fora daquelas already em utilização. É também menos trabalho intensivo como nós não tem que coletar carrapatos ingurgitadas cada dia. Foram coletadas carrapatos entre os dias 4 e 6 infestações pós. A maioria das carraças isoladas por dia 4 e uns poucos restantes separadas por dia 5. Ao dia 7 todos os murganhos estavam livres de carrapatos. Fomos capazes de recuperar uma média de 67% (intervalo de 52-92%) ingurgitadas carrapatos larvares (Tabela 1). Todos os ratos eram saudáveis ​​e não mostram quaisquer sinais de desconforto.

Figura 1: Alimentação Ixodes scapularis Larvas em Ratos. Os ratinhos foram individualmente infestada com 50 carrapatos larvares. Os carrapatos ingurgitadas deixado o mouse entre os dias 4 - 6. As gaiolas foram verificados por qualquer carrapatos restantes no dia 7 e descartados em seguida. A: Infestando ratinhos com carrapatos larvares em jejum. B: Um tique larval fixação à orelha de um rato. C: UmEngorged larval tick anexado ao ouvido de um rato, 3 dias pós infestação. D: Larvas de carraça não alimentadas e totalmente engorgadas.

Figura 2: Gaiola de rato configurada para infestação de carrapatos. Duas gaiolas de rato descartáveis ​​foram mantidas dentro de uma gaiola de gerbil. Aproximadamente 3 cm. Água foi adicionada à gaiola gerbil para fazer um fosso. A fita adesiva do tapete pegajosa dos dois lados foi afixada em torno das bordas superiores da gaiola do gerbil para evitar a fuga do tiquetaque.

Tabela 1: Número de larvas de Ixodes scapularis engorged recuperadas após infestação laboratorial em hospedeiros de ratos anestesiados. Cada rato foi infestado com 50 larvas.

Passos críticos dentro do Protocolo

É importante ter vários níveis de medidas de segurança quando a criação carrapatos para evitar fuga acidental. Uso de fita adesiva e um fosso de água são fundamentais para garantir a segurança. É importante para manter o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura constante do corpo. Nós também descobrimos que raspar o mouse não fornece qualquer benefício extra para fixação do carrapato. Um ratinho individual pode ser mantida na mesma jaula, durante uma semana num designado "quarto tick", que limita ainda mais o contacto de tiques com o pessoal.

Modificações e resolução de problemas

A produção de alta qualidade, carrapatos criadas em laboratório é necessário para os estudos sobre a biologia carrapato e interacções assinale de organismos patogénicos. Protocolos de alimentação anteriores utilizaram chão de arame suspensas ⁸ ou gaiolas cilíndricas para manter os ratos imóvel ^{6, 1}0 que incorrem em custo extra, bem como stress para o animal. Além disso, a gaiola de fio suspenso permite que os carrapatos ingurgitados caírem através do fio na água contaminada com urina e fezes do rato, aumentando assim o risco de crescimento do molde.

Limitações da Técnica

Conforme mostrado nos dados, recuperamos com sucesso em média 65% (até 92%) de carrapatos. Nós encontramos ocasionalmente carrapatos no fosso da água fora da gaiola do rato mas nenhum escapou. A fita adesiva nas paredes externas do segundo recipiente impediu os carrapatos de escapar.

Significado da técnica em relação aos métodos existentes / alternativos

Nosso protocolo de uso de caixa de sapato estilo descartáveis ​​gaiolas de ratos permite uma gama livre de movimento e demonstra que os ratos não precisam ser contido para permitir a alimentação de carrapatos. A maioria dos carrapatos alimentados foram facilmente vistos e coletados das paredes transparentes da gaiola e todos os carrapatos restantes são prontamenteDetectado entre as camas no final do ciclo de alimentação. Este protocolo não requer qualquer gaiola de mouse personalizado, portanto, é rentável.

A literatura sugere que menos de 50% dos carrapatos se ligam ao mouse e nem todos os carrapatos anexados se alimentam até a conclusão. Em média, coletámos carrapatos larvados com ~ 60% de ingestão. Nós não encontrar qualquer escapou unfed ou fed ticks. Ocasionalmente encontramos um ou dois carrapatos larvados ingurgitados em fosso de água, mas nenhum na fita adesiva. Nossos resultados sugerem que nem todos os carrapatos se ligam ao hospedeiro e podem morrer sem alimentação. Unfed, carrapatos mortos eram difíceis de encontrar na serapilheira. Ocasionalmente, também encontramos manchas de sangue na cama branca, o que sugere que qualquer um dos ratos matou o carrapato ingurgitado após deixar cair ou arranhado. Nossos dados e observação diária de gaiolas sugerem que carrapatos ingurgitados ou mover-se para cima nas paredes da gaiola e no topo da gaiola ou esconder sob a cama fora do alcance do mouse. Portanto, a gaiola fechada não temImpacto negativo na sobrevida dos carrapatos.

Aplicações futuras ou direções após dominar esta técnica

O nosso protocolo proporciona uma alternativa simplificada para a criação em massa de carraças sem acrescentar custos adicionais ou reduzir a segurança do pessoal que manipula os animais. A experimentação futura focalizará na melhoria dos métodos de alimentação de I. scapularis adulto.

The authors have nothing to disclose.

The authors acknowledge the help from the staff of Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM received funding from Nevada INBRE.