Aufzucht

Die Produktion von gesunden Labor aufgezogen Zecken ist wichtig, um Studien über tick Biologie und tick-Pathogen-Interaktionen. Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll für unreife Zecken Fütterung, die kostengünstiger und weniger belastend für Mäuse ist.

Ixodes scapularis, der Vektor der Lyme - Borreliose ist eine der wichtigsten Krankheitsvektoren im Osten und Mittleren Westen der Vereinigten Staaten. Diese Art ist eine drei Host-Zecke, die eine Blutmahlzeit von einem Vertebratenwirts für jede Entwicklungsstufe erfordert, und die erwachsenen Weibchen benötigen eine Blutmahlzeit für die Wiedergabe. Larval Zecken für 3 bis ihre Gastgeber befestigen - 5 Tage für Fütterung und die Host abfallen, wenn sie vollständig gestaut. Diese Abhängigkeit von verschiedenen Hosts und die langen Befestigungs Zeit für engorgement kompliziert in der Laborumgebung tick Aufzucht. Allerdings tick Biologie und tick-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, die Produktion von gesunden, im Labor aufgezogen Zecken ist von wesentlicher Bedeutung. Hier haben wir ein einfaches, kostengünstiges Protokoll für unreife Zecken ernähren sich von Mäusen zeigen. Wir modifizierten die vorhandenen Protokolle für die verringerte Belastung auf Mäuse und erhöhte Zecke Fütterung Erfolg und das Überleben von mit Einweg-Käfigen ohne Mesh Böden Kontakt von Zecken wi zu vermeidenth Wasser mit Mäusen Urin und Kot verunreinigt.

Zecken sind obligat bluts Ektoparasiten von Wirbeltieren und werden weltweit vertrieben. In den Vereinigten Staaten mindestens 11 Arten von Zecken sind Vektoren von Krankheitserregern der öffentlichen Gesundheit wichtig ^1. Hirschzecke ist verantwortlich für die Übertragung von mehreren Krankheitserregern wie den Erreger der Lyme - Krankheit (Borrelia burgdorferi) Rückfallfieber (B. miyamotoi), menschliche granulozytäre Anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum) und der Babesiose (Babesia spp.). Trotz der Bedeutung des I. scapularis als Krankheitsüberträger, diese Spinntiere in Hülle und Fülle aus der Natur für Studien im Labor zu sammeln ist nicht immer möglich. Daher ist die Produktion von gesunden Labor aufgezogen Zecken wesentlich Studien über tick Biologie und tick-Pathogen-Interaktionen.

Der Lebenszyklus aller harten Zecken (Familie Ixodidae), einschließlich I. scapularis, besteht aus dem Ei und drei activE Stufen: Larve, Nymphe und Erwachsene. Jede aktive Stufe füttert auf einem Wirbeltierwirt. Die komplexen Wechselwirkungen, die zwischen Zecken und ihren Wirten über mehrere Tage der Anhaftung und Fütterung stattfinden, sind fast unmöglich, sich mit künstlichen Füttern zu replizieren, und es ist unwahrscheinlich, dass sie genügend Anzahl von gefüllten Zecken für die Massenaufzucht ^{2 , 3 , 4} zur Verfügung stellen. Daher werden lebende Mäuse und Kaninchen am häufigsten als Gastgeber für die Aufzucht unreifen (Larven und Nymphen) und reifen Stadien (Erwachsene) von Zecken verwendet. Die Anforderung von mehreren Wirten für die Blutverfütterung während jeder Entwicklungsstufe kompliziert die Zeckenaufzucht und ist zeit- und kostenintensiv ^{5 , 6 , 7} . Die meisten Tick-Aufzucht-Protokolle verlangen, dass Mäuse in einem hängenden Drahtgitter-Bodenkäfig ^{7 , 8} oder in einem zylindrischen cage so bemessen , dass das Tier sich nicht frei bewegen kann , und selbst pflegen ^{6, 9, 10.}

Diese zylindrischen Käfige werden später zu einem Schuhkarton Käfig mit einem Drahtgitter übertragen. Engorged, freistehende Zecken werden dann aus dem Wasser unterhalb gesammelt. Dieses Verfahren führt jedoch in fed Belichten Zecken zu Wasser verunreinigt mit Urin und Fäkalien , die das Pilzwachstum erhöhen und Zecken Mortalität ^9. Außerdem erhöht es die Möglichkeit der Zecke Flucht aus dem Wassertrog sowie verursacht Stress bei Mäusen. Um diese Probleme zu umgehen, zeigen wir hier Larvenzecken Fütterung auf Mäuse innerhalb Kunststoff Schuhkarton-Wegwerf Käfigen. Diese Methode ermöglicht das normale Verhalten von Mäusen, steigt tick Erholung gestaut und nimmt aufgrund der Kontamination tick Mortalität.

Das unten beschriebene Protokoll (Nummer-00682) wird vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Nevada Reno genehmigt und folgt den Richtlinien der Universität Nevada, dem Tierforschungsethik-Komitee von Reno. Kurz gesagt wurden Mäuse mit Isofluran betäubt und ein Nasenkonus wurde für die Aufrechterhaltung kontinuierlicher Isofluranspiegel für 20 min verwendet. Eine Tierarzt-Salbe wurde verwendet, um das Austrocknen der Augen unter Anästhesie zu verhindern. Zehensperre wurde verwendet, um die Anästhesie-Ebene zu ermitteln und die Atemfrequenz wurde während des gesamten Verfahrens gemessen. Die Mäuse wurden in einzelnen Käfigen gehalten und überwacht, bis das Bewusstsein wiedergewonnen wurde. Die Mäuse wurden nur einmal für die Zeckenfütterung verwendet und wurden nach der Tick-Erholung euthanasiert. Euthanasie wurde von der Laboratorium für Tiermedizin Personal Personal durchgeführt. CO ₂ und Zervixversetzung wurden für die Euthanisierung von Tieren verwendet.

HINWEIS: Die Arbeit an Zecken erfordert die Verwendung von vollständigen persönlichen Schutz-ÄqVersand Zum Zählen von unreifen Zecken tragen Sie weiße Laborkittel, lange Nitrilhandschuhe, um die Hülsenöffnung des mit Gummibändern bedeckten Laborkleides und geschlossenen Zehenschuhen zu bedecken. Für die Befallung von Mäusen mit Zecken, verwenden Sie ein Haar Netz, Einweg-Overalls, Langarm-Handschuhe über die Ärmel und Fuß-Abdeckungen. Verwenden Sie weiße oder helle Overalls, um Wegfahrten zu erkennen. Überprüfen Sie regelmäßig Handschuhe und Ärmel für Zecken.

1. Vorbereitung des Raumes für Tierhaltung

1. Bezeichnen Sie einen separaten Raum zum Haus Mäuse mit Zecken befallen. Legen Sie eine klebrige Matte oder doppelseitigen Teppichband außerhalb und innerhalb der Tür, um versehentliches Zecken zu entkommen.

2. Zählungen für Mausbefall

1. Setzen Sie doppelseitiges Klebeband um die Oberkanten eines 7 "x 5" x 14 "Plastikbehälters und füllen Sie mit Wasser auf ca. 2 cm.
2. Legen Sie eine weitere kleine Schachtel oder Petrischale in die Mitte des Behälters und füllen Sie mit Wasser auf 1 cm Schaffung eines &# 34; Wallgraben“um diesen Behälter
3. Lagern Sie die Fläschchen mit Larven oder Nymphen in der Petrischale.
4. Mit einem feinen Pinsel Larven oder Nymphen aus der Phiole zu entfernen, und unter dem Mikroskop zählen. Graf 50 Larven oder 25 Nymphen in einzelne Szintillationsgefße. Deckt die Fläschchen sofort mit Nylonnetz oder organdy Tuch Bildschirm und Schließen mit Gummibändern.

3. befall Mäuse mit Unreife Ticks

1. Verwenden, um eine weiße oder helle Werkbank und kleben doppelseitiges Klebeband um den Umfang des Arbeitsbereiches.
2. Anesthetize Maus mit Isofluran. Prüfen Sie das Niveau der Anästhesie durch toe Prise. Einmal betäubt, übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen mit Papiertüchern bedeckt und an einen Nasenkegel für die weitere Isofluran Versorgung anschließen.
3. Vaseline-basierte Augensalbe Trockenheit zu vermeiden. Beachten Sie das Atemmuster der Maus Isofluran Stufen einstellen (80 -. 230 Atemzüge pro Minute normal ist, reduzieren Isofluran Ebene, wenn brDie Eatrate beträgt weniger als 80 Atemzüge pro Minute, um das Tier nicht zu töten).
4. Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit 50 Larven oder 25 Nymphen und legen Sie Zecken unter dem Pelz auf den Kopf zwischen den Ohren mit einem Pinsel ( Abbildung 1 ). Halten Sie die Maus unter Anästhesie für 20 Minuten nach der Platzierung, um genügend Zeit für Zecken zu befestigen.
5. Bewegen Sie die Maus zu einem Standard, Kunststoff Schuhkarton-Typ Einweg-Maus Käfig mit statischen Deckel und weiße Bettwäsche. Geben Sie Spielzeug, Wasser und Lebensmittel ad libitum wie pro normale Maus Pflege.
6. Bewahren Sie den Mauskäfig in einem größeren Ratten- oder Gerbil-Käfig auf, der mit doppelseitigem Klebeband um die Oberkanten ausgekleidet ist. Füllen Sie den äußeren Käfig mit 3 cm Wasser ( Abbildung 2 ).

4. Sammeln von Zecken von Mäusen

1. Unreife Zecken lösen zwischen den Tagen 3 und 6 der Fütterung ab. Überprüfen Sie die Käfige und Wasser-Graben für engorged Zecken jeden Tag nach Tag 3.
2. Sammle freistehende Zecken aus dem Käfig zwischen den Tagen 4 und 6. Verwenden Sie einen Schmerzt Bürste oder weiche Zange für angeschwollene Zecken und lagerte in sauberen Szintillationsfläschchen Aufnehmen capped mit Tuch Nylonnetz mit Gummibändern gesichert.
3. Betäuben und überprüfen Maus am Tag 7 für alle verbleibenden angebracht Zecken.
4. Überprüfen Sie die Bettwäsche, Futtertrog, und Wasserflasche für angeschwollene Zecken am Tag 7. Euthanize Mäusen nach dem Verfahren, wie oben beschrieben. Sterilisieren Sie den Einweg-Käfige, Bettwäsche, Wasserflasche, und Futtertrog tretener unfed Zecken zu vermeiden.

5. Lagerung von Fed Ticks

1. Pflegen angeschwollene Zecken bei 90% Luftfeuchtigkeit, 20 ° C und ein 00.12-Licht: Dunkel-Zyklus in einer Luftfeuchtigkeit und Temperatur kontrollierten Inkubator, bis Häutungs auftritt. Dies kann etwa 12 bis 18 Wochen dauern auftreten.
2. Während hohe Luftfeuchtigkeit tick Überleben fördert, macht es auch die Zecken anfällig für Pilzwachstum. Überprüfen Sie die fed das Mikroskop mindestens einmal pro Woche für Schimmel Ticks unter. Wenn erkannt wird, waschen Überlebenden in 70% Ethanol für 5Min., In Wasser abspülen, auf ein Filterpapier zum Trocknen überführen und auf neue, saubere Fläschchen übertragen.

Wir haben die bestehenden Tick-Aufzucht-Protokolle ^{6 , 10} für eine verbesserte Fütterungseffizienz und reduzierte Belastung des Maus-Hosts modifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Standard-Shoebox-Stil Maus Käfige sind gut geeignet für Tick Aufzucht. Die weiße Bettwäsche stellte einen guten Kontrast für eine einfache Sammlung von gefüllten Zecken. Die meisten Zecken kletterten die Wände der Container nach der Fütterung und waren leicht zu sammeln. Darüber hinaus verhinderte der eng anliegende Deckel der Einweg-Plastikkästen (routinemäßig für Mäusegehäuse bei UNR) eine Tick-Flucht aus der Box. Darüber hinaus rasierten wir keine Mäuse für Zeckenbefall (Abbildung 1 ). Diese Änderungen in den veröffentlichten Protokollen führten zu einer signifikanten Tick-Attachment, Engorgement und Überleben.

Dieses Protokoll ist kostengünstig, da es keine speziellen Mauskäfige außerhalb dieser Algorithmen erfordertY in Gebrauch. Es ist auch weniger arbeitsintensiv, da wir jeden Tag keine engagierten Zecken sammeln mussten. Wir sammelten Zecken zwischen Tagen 4 und 6 Nachbefall. Die meisten Zecken freigegeben am Tag 4 und ein paar verbleibende abgetrennt am Tag 5. Am Tag 7 waren alle Mäuse frei von Zecken. Wir konnten einen Durchschnitt von 67% (Strecke 52 - 92%) besiegte Larval-Ticks ( Tabelle 1 ) wiederherstellen. Alle Mäuse waren gesund und zeigten keine Anzeichen von Unbehagen.

Abbildung 1: Fütterung Ixodes scapularis Larven auf Mäusen. Die Mäuse wurden einzeln mit 50 Larven-Zecken befallen. Die engagierten Zecken gingen zwischen den Tagen 4 - 6 aus der Maus. Die Käfige wurden am Tag 7 auf irgendwelche verbleibenden Zecken überprüft und danach entsorgt. A: Mäuse mit unfed Larval Zecken infizieren. B: Eine Larve, die an das Ohr einer Maus anhängt. C: Anangeschwollene Larven Zecke an das Ohr einer Maus befestigt, 3 Tage nach Befall. D: Unfed und voll gestaut Zeckenlarven.

Abbildung 2: Maus Käfig für Tick Infestation einrichten. Zwei Einweg-Maus Käfige wurden in einem gerbil Käfig gehalten. Ca. 3 cm. Wasser wurde zu dem gerbil Käfig hat einen Wassergraben zu machen. Doppelseitig wurde klebrig Teppichklebeband um die oberen Kanten des gerbil Käfig befestigt Zecke Flucht zu vermeiden.

Tabelle 1: Anzahl der verschlungenen Ixodes scapularis Larven nach Laborbefall auf anästhesierten Mauswirten zurückgewonnen. Jede Maus wurde mit 50 Larven befallen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Es ist wichtig, mehrere Ebenen von Sicherheitsmaßnahmen zu haben, wenn Zecken Aufzucht, um ein versehentliches Entweichen zu vermeiden. Die Verwendung von Klebeband und einem Wassergraben ist kritische Sicherheit zu gewährleisten. Es ist wichtig, die narkotisierten Maus auf einem Heizkissen zu halten die Körpertemperatur konstant zu halten. Wir fanden auch, dass die Maus Rasur bietet keinen zusätzlichen Nutzen für Zeckenanheftung. Eine individuelle Maus kann im selben Käfig für eine Woche in einem bestimmten „tick Raum“, die weite Grenzen Kontakt von Zecken mit Personal gehalten werden.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

Die Herstellung von qualitativ hochwertigen, im Labor aufgezogen Zecken ist notwendig für Studien über Zecken Biologie und Zecken-Pathogen-Interaktionen. Bisherige Fütterungsprotokolle suspendieren Drahtboden ⁸ oder zylindrische Käfige verwendeten die Mäuse zu halten unbeweglich ^{6, 1}0, die zusätzliche Kosten sowie Stress für das Tier entstehen. Darüber hinaus ermöglicht der hängende Drahtkäfig, dass die engorgesten Zecken durch den Draht in das mit Urin verunreinigte Wasser und Fäkalien der Maus fallen, wodurch das Risiko des Schimmelwachstums erhöht wird.

Einschränkungen der Technik

Wie in den Daten gezeigt, haben wir erfolgreich durchschnittlich 65% (bis zu 92%) der Zecken erholt. Wir haben gelegentlich Zecken im Wasser Graben außerhalb der Maus Käfig gefunden, aber keiner entkam. Das klebrige Band an den Außenwänden des zweiten Behälters verhinderte, dass die Zecken entkamen.

Bedeutung der Technik im Hinblick auf bestehende / alternative Methoden

Unser Protokoll der Verwendung von Schuhkarton-Stil Einweg-Mäusekäfige erlaubt freie Bewegungsfreiheit und zeigt, dass Mäuse nicht zurückhalten müssen, um Tick Fütterung zu ermöglichen. Die meisten gefüllten Zecken wurden leicht gesehen und von den transparenten Käfigwänden gesammelt und alle restlichen Zecken sind leichtdetektiert unter am Ende des Zuführungszyklus Bettwäsche. Dieses Protokoll erfordert keine kundenspezifische Maus Käfig, so ist es kosteneffektiv.

Literatur schlägt vor, dass weniger als 50% der Zecken auf Maus befestigen und nicht alle angeschlossenen Zecken füttern bis zur Fertigstellung. Im Durchschnitt haben wir für ~ 60% angeschwollene Larven Zecken. Wir fanden keine ungefüttert oder gefüttert Zecken entkommen. Gelegentlich fanden wir eine oder zwei angeschwollene Larven Zecken in Wassergraben, aber keinem auf dem Klebeband. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass nicht alle Zecken an den Host anhängen und sterben können, ohne Fütterung. Unfed, toten Zecken waren hart in Wurf zu finden. Gelegentlich fanden wir auch Blutflecken auf dem weißen Bettzeug, die das haben entweder Maus die gestaut Zecke nach Abwurf oder abgekratzt getötet vermuten lässt. Unsere Daten und tägliche Beobachtung von Käfigen legen nahe, dass angeschwollene Zecken entweder nach oben auf den Käfigwände und die Oberseite des Käfigs oder verstecken sie unter dem Bettzeug weg von der Reichweite des Maus. Daher müssen die eingeschlossenen Käfig nicht einy negative Auswirkungen auf das Überleben Zecke.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering

Unser Protokoll bietet eine vereinfachte Alternative zur Massenzucht von Zecken, ohne zusätzliche Kosten oder Reduzierung Sicherheit des Personals der Tiere Handhabung. Zukünftige Experimente konzentrieren sich auf Methoden der Fütterung erwachsenen I. scapularis zu verbessern.

The authors have nothing to disclose.

The authors acknowledge the help from the staff of Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM received funding from Nevada INBRE.