O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

DNA Ambiental (Edna) em ambientes aquáticos refere-se a material genético encontrado na coluna de água. Estudos recentes demonstraram a utilidade de Edna para a detecção de peixes de vários ambientes aquáticos, incluindo lagoas ^{1-3, 4-8} rios, córregos ^9, e água do mar ^10-14. A maioria destes estudos focados em detecção de um único ou poucos invasiva ^1,4-6,8,14 e raras ou ameaçadas espécies de ^3,9, enquanto alguns estudos recentes tentativa de detecção simultânea de múltiplas espécies em comunidades de peixes locais ^{7,9, 12,13,15} e mesocosmos ^11,12.

A última abordagem é chamada de "metabarcoding" e Edna metabarcoding utiliza um ou vários conjuntos de primers de PCR para coamplify uma região do gene através de amostras taxonomicamente diversas. Isto é seguido por uma preparação da biblioteca com indexação e adição do adaptador, e as bibliotecas indexados são analisados ​​por uma sequenciação de alto rendimento paraleloplataforma. Recentemente Miya et al. ¹² desenvolveram iniciadores de PCR universais para metabarcoding Edna de peixes (chamados "MiFish"). Os primers MiFish alvo uma região hipervariável do gene 12S rRNA mitocondrial (163-185 pb), que contém informações suficientes para identificar os peixes a família taxonômica, gênero e espécie, exceto para alguns dos congéneres estreitamente relacionadas. Com o uso desses iniciadores em Edna metabarcoding, Miya et al. ¹² detectou mais de 230 espécies marinhas subtropicais de aquários com conhecidos de composição de espécies e os recifes de coral perto do aquário.

Além de otimizar o protocolo metabarcoding para acomodar a água do mar natural, com diferentes níveis de concentração de Edna de peixes, temos notado que os primers MiFish ocasionalmente falhou para amplificar a região alvo para a preparação da biblioteca subsequente. Uma das razões mais prováveis ​​para esta amplificação PCR vencida é a falta de quantidades adequadas de teADN mplate contida em pequenos volumes de água filtrada (isto é, 1-2 G). Embora a concentração Edna de um grupo taxonômico específico é desconhecido antes da amplificação, filtragem de grandes volumes de água (> 1-2 L) seria um meio simples e eficaz para recolher mais Edna dos ambientes aquáticos com abundância de peixes raros e de biomassa, tal como -mar aberto e de profundidade ecossistemas.

Em relação a filtros de fibra de disco convencionalmente utilizados em uma série de pesquisas EdNA peixe ^16, os cartuchos de filtro têm a vantagem de acomodar maiores volumes de água antes de entupimento ^17. Na verdade, um estudo recente mostrou grande volume (> 20 L) filtração de amostras de água do mar costeiras usando cartuchos de filtro ^18. Além disso, eles são embalados individualmente e estéril, e vários passos do fluxo de trabalho experimental pode ser realizada no invólucro do filtro, reduzindo assim a probabilidade de contaminação a partir do laboratório de ^19. O últimoO recurso é fundamental para Edna metabarcoding, em que o risco de contaminação permanece entre os maiores experimental desafia ^20,21. Apesar destas vantagens técnicas de cartuchos de filtro, que não tem sido usado em estudos EdNA de peixes com duas excepções ^8,15.

Aqui nós fornecemos um protocolo para a filtração de amostras de água com o cartucho de filtro e a extracção de EdNA a partir do seu filtro sem ter que cortar abrir o invólucro. Nós também fornecemos dois sistemas de filtração de água alternativas, dependendo dos volumes de água (≤4 L ou> 4 L). Para comparar o desempenho do protocolo recém-desenvolvido e um protocolo previamente utilizados através de um filtro de fibra de vidro em nosso grupo de pesquisa ^12,14,22,23, eu executo Edna metabarcoding análise da água do mar a partir de um tanque do aquário enorme (7.500 m ³ ) com a composição de espécies conhecidas, e mostrar o número de espécies detectadas derivados dos dois protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo foi desenvolvido para metabarcoding EdNA de peixes, mas também é aplicável a EdNA de outros organismos.

NOTA: Este protocolo não lidar com métodos de amostragem de água e metabarcoding. A água pode ser colhidas amostras de diferentes maneiras, dependendo fins de estudo ¹⁶ e veja Miya et al. ¹² para detalhes dos métodos metabarcoding usando primers MiFish. Note-se que a água amostra deve ser mantido muito frio e filtrou-se dentro de algumas horas para evitar a degradação de EdNA. Observe também que este protocolo envolve o uso de um agitador rotativo e uma incubadora, e este último deve ser grande o suficiente para acomodar o ex. Além disso, uma centrifugadora que pode acomodar-se a 15 ml e 50 ml de tubos cónicos é indispensável para remover o líquido remanescente no filtro e pós-filtragem para recolher DNA extraído no interior do cartucho, respectivamente.

1. O processamento de uma tampa de rosca e um L saco de plástico 1

NOTA: Ignore esta etapa se o volume de filtração é> 4 L.

1. Perfurar um furo através do centro de um parafuso cAP (ligado a um saco de plástico descartável de 1 L) com o mesmo diâmetro (4,8 mm) como o tubo que se projecta a partir de um conector luer macho. Usando alicates diagonais, encurtar o tubo do conector luer macho de um comprimento apropriado (ca. 3 mm), para evitar o entupimento de uma pequena quantidade de água no interior da tampa depois de filtração.
2. Aplicar uma cola adesiva especializada para o polietileno (PE) e polipropileno (PP) para que o fundo e a superfície do conector luer macho e tampa de rosca, respectivamente. Aguarde alguns minutos para uma boa união adesiva (consulte as instruções do fabricante).
3. Insira o conector luer macho no buraco da tampa de rosca. Aguardar até que a ligação adesiva completa das duas partes (normalmente> 24 hr). Esterilizar a tampa de rosca com o conector macho luer com 10% de lixívia comercial (ca. 0,6% de hipoclorito de sódio) antes do uso.
4. Perfurar dois buracos nos dois cantos inferiores do saco de plástico 1 L, de modo a pendurar-lo de um mesh painel (passo 3). Certifique-se de que o diâmetro dos furos é maior do que o das pontas sobre o painel de malha.

2. Montagem do Sistema de Filtração

1. Prenda o tubo de vácuo elevado para o conector de entrada de uma bomba de aspiração e fixar a outra extremidade do tubo a um colector. Certifique-se de que os três t-válvulas vermelhas do colector estão na "posição de desligado" (ou seja, horizontal).
2. Vestindo um jogo limpo de luvas, inserir um luer fêmea montagem e um conector de vácuo nas extremidades superior e inferior do tubo de borracha de vácuo para filtração, respectivamente.
3. Cuidadosamente anexar o luer fêmea encaixe para um orifício de saída do cartucho de filtro e montar o conector de vácuo para uma rolha de silicone.

3. Filtração de amostras de água (≤4 L), utilizando o cartucho de filtro

NOTA: Ignore esta etapa se o volume de filtração é> 4 L. Este sistema de filtragem requer uma auto-pé painel fou pendurar o saco de plástico cheio com 1 L de água. Um painel de malha, vários dentes, e um suporte para o painel, todos disponíveis a partir de lojas on-line, seria útil para a montagem desta unidade. Autoclave a entrada e saída tampas luer do cartucho do filtro antes do uso.

1. Despeje a 1 L de água recolhidos num saco de plástico e feche a tampa de rosca com o conector luer macho.
2. Cuidadosamente ligar um orifício de entrada do cartucho de filtro montado com o conector luer macho do saco de plástico. Não aperte o conector luer-lock; caso contrário, a unidade vai vazar uma vez que o bombeamento começa. Certifique-se de que todas as ligações estão seguras antes de pendurar o saco de plástico a partir de um painel de malha.
3. pendurar cuidadosamente o saco de plástico com o cartucho de filtro a partir de dois pinos no painel de malha e inserir uma rolha de silicone a uma porta de entrada do colector.
4. Ligue o aspirador. Abra as t-válvulas vermelhas para filtração. Executar o colector até que o cartucho de filtro é seco, then transformar o t-válvula vermelha para a posição desligado.
5. Repetir 3.1-3.4 passos até que a quantidade desejada de água é filtrada.
   NOTA: Para 1 L de água retirado dos recifes de coral subtropicais, leva cerca de três minutos para a filtração.
6. Remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco de plástico e o conector de vácuo.
7. Tapar ambas as extremidades do cartucho com as tampas de entrada e de saída luer.
8. Rotular a tampa do cartucho e luer de entrada adequadamente usando uma caneta de solvente-prova para secagem rápida e rotulagem não-manchas.
9. Armazenar o cartucho do filtro a -20 ° C antes da extração de DNA.

4. Filtração de água (> 4 L) amostras utilizando o cartucho de filtro

Nota: Ignore esta etapa se o volume de filtração de água é ≤4 L. Este sistema de filtragem requer uma garrafa livro 10 L equipado com uma válvula e uma ponta de pipeta de 10 ml descartável. Um diâmetro interno de 10 ml a ponta da pipeta (15,0 mm) e uma conicidade da pontafinal deve caber a um diâmetro externo da válvula (15,0 mm) e a porta de entrada do cartucho do filtro, respectivamente. Ambas as ligações são firmemente retidas durante a filtração num encaixe por atrito. Esterilizar a ponta da pipeta com lixívia comercial a 10% (cerca de 0,6% de hipoclorito de sódio) antes do uso.

1. Prepara-se uma quantidade apropriada de água amostrada na garrafa livro. Firmemente inserir o 10 ml ponta da pipeta na válvula de 10 L garrafa livro.
2. Inserir firmemente a porta de saída do cartucho de filtro na extremidade da ponta da pipeta e inserir a rolha de silicone para o orifício de entrada do colector. Ligue o aspirador. Abra as t-válvulas vermelhas para filtração. Execute o colector até que o cartucho de filtro é seca, em seguida, vire o t-válvula vermelha para a posição desligado.
   NOTA: Para 10 L de água do mar tomado a partir dos recifes de coral subtropicais exteriores, que leva cerca de 30-40 min para a filtração.
3. Remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco de plástico e o conector de vácuo. Cap tantoextremidades do cartucho com as tampas de entrada e de saída luer. Rotular a tampa do cartucho e luer de entrada adequadamente usando uma caneta de solvente-prova para secagem rápida e rotulagem não-manchas. Armazenar o cartucho de filtro a -20 ° C antes da extracção do ADN.

5. Extração de Edna do Filtro

NOTA: Nos passos 4 e 5, usamos um kit comercial, em grande parte, na sequência de um protocolo para "sangue nucleada" fornecido pelo kit. Para simplificar, descreve-se o procedimento para o processamento de um cartucho individual. Na prática, recomenda-processamento 8 (ou o número máximo de centrífuga) ou menos filtros de cada vez.

1. Pré-aqueça uma incubadora a 56 ° C.
2. Preparar um tubo de 2,0 ml por corte da tampa articulada do tubo. Elimine a tampa.
   NOTA: Este tubo é usado como tubo de recolha para o líquido remanescente no filtro.
3. Remova a entrada (NÃO saída) tampa luer do cartucho do filtro e inserir o i porta de entradanto do tubo de coleta. Firmemente selar um tubo de ligação entre o cartucho e a recolha utilização de uma película de auto-selagem.
4. Insira a unidade combinados em um adaptador de centrífuga para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se o cartucho em 5000 xg durante 1 min para remover o líquido remanescente no filtro.
5. Remover o tubo de recolha do cartucho de filtro e rejeitar o tubo. Re-tampa da abertura de entrada do cartucho.
6. Prepara-se uma mistura de 20 ul de solução de proteinase-K, 220 ul de PBS (salino tamponado com fosfato; não fornecida pelo kit) e 200 ul de tampão de AL.
   NOTA: O cartucho do filtro acomoda até quatro vezes os volumes de mistura (. Ca 1,8 ml).
7. Retire a tampa de entrada e adicione a mistura (440 mL) para dentro do cartucho do filtro utilizando uma ponta de pipeta. Inserir a pipeta completamente para dentro da abertura de entrada de modo a que a ponta da pipeta é visível no interior do cartucho imediatamente acima da membrana.
8. Re-tampa da abertura de entrada e posicionar o carro filtroTridge num agitador rotativo.
9. Coloque o agitador rotativo na incubadora pré-aquecido a 56 ° C e ligar o agitador a uma velocidade de 20 rpm durante 20 min.
10. Durante a incubação, preparar um novo tubo de 2,0 ml, rotular o tubo adequadamente usando uma caneta de solvente-prova e colocá-lo em um tubo cônico de 50 ml.
    NOTA: Os primeiros (2,0 ml) e últimos tubos (50 ml) são utilizados para a recolha do ADN extraído e para segurar o tubo de 2,0 ml, respectivamente.
11. Após a incubação, remover a tampa de entrada e inserir a entrada (NÃO saída) da porta do cartucho dentro do tubo de 2,0 ml dentro do tubo de 50 ml. Fechar o tubo cónico de 50 ml com uma tampa de rosca.
12. Centrifuga-se o tubo cónico de 50 ml a 5000 xg durante 1 min para recolher o ADN extraído a partir do cartucho. Remova o cartucho do filtro e do tubo de 2,0 ml usando uma pinça esterilizados e tampa do tubo. Descarte o cartucho do filtro.

6. Purificação de DNA extraído

NOTA: Nós eluir Edna com 100 ul de tampão AE em vez de 200 ul especificadas no manual do kit comercial.

1. Adicionar 200 uL de etanol (96-100%) para o DNA extraído no tubo de 2,0 ml a partir do passo acima (ca. 440 uL), e homogeneizar por agitação em vórtex.
2. Pipetar a mistura numa coluna de rotação colocados num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar a 5.000 xg durante 1 min. Descartar o escoamento e o tubo de recolha.
3. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionar 500 ul de tampão de AW1, e centrifugação durante 1 min a 5000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha.
4. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionar AW2 tampão de 500 ul, e centrifuga-se durante 3 min a 20.000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha.
5. Prepare um novo tubo de 1,5 ml (não fornecido no kit) e rotular o tubo adequadamente usando uma caneta à prova d'água para a secagem rápida e não-manchando rotulagem. Transferir a coluna de centrifugação tO tubo de 1,5 ml.
6. Elui-se o ADN por adição de 100 ul de tampão AE para o centro da membrana por coluna de centrifugação. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente, e depois centrifugar a 6000 xg durante 1 min.
7. Descartar a coluna de rotação e tampa do tubo. Armazenar o ADN purificado a -20 ° C.

É tecnicamente difícil isolar e quantificar única Edna peixe da Edna volume extraído, porque os primers MiFish coamplify região alvo de alguns vertebrados não-peixes, tais como aves e mamíferos, com produtos de PCR do mesmo tamanho (ca. 170 pb ) ^12. Em vez de quantificar peixes Edna, realizamos MiFish metabarcoding análise de Edna de um tanque do aquário com composição de espécies conhecidas usando dois métodos diferentes de filtração e extracção do ADN e comparar os números de espécies detectadas por biblioteca dos dois protocolos. Este experimento simples foi projetado para mostrar a viabilidade do presente protocolo como os "resultados representativos" e não para demonstrar rigorosamente a sua superioridade sobre os outros.

Foram amostrados um total de 30 L de água do mar a partir de um tanque de Kuroshio na Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japão (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). O tanque de Kuroshio é projetado para expor megafauna marinha, com dimensões (L x W x D) de 35 mx 27 mx 10 m e um volume total de água de 7.500 m ^3. Abriga cerca de 60 grandes espécies de peixes marinhos -sized característicos para as áreas próximas do Kuroshio, uma das correntes de contorno oeste fluindo para nordeste ao longo de todo o comprimento do Japão. Num estudo MiFish metabarcoding anterior, Miya et al. ¹² detectado 61 das 63 espécies (97%) continha no tanque de cinco amostras de água do mar 2 L.

Por filtração da água do mar, que utiliza cartuchos de filtro (tamanho do poro = 0,45 um) e filtros de disco de fibra de vidro (tamanho de poro = 0,70 uM). Nós simultaneamente filtrada a água do mar no mesmo colector utilizando os dois protocolos de quatro volumes de água (1, 2, 3 e 4 L; totais, oito filtros). Após a filtração da água do mar, que também filtrou 1 L de água de grau de PCR com os dois filtros (fILTER cartucho de filtro e de fibra de vidro), como os controlos negativos (duas peças preliminares filtro). A partir desses tipos de filtros, foram extraídas Edna utilizando as novas e anteriormente utilizados protocolos ^12, sendo que ambos utilizam o mesmo kit comercial. Um total de 10 amostras EdNA (incluindo os dois controlos negativos) foram submetidos a análise MiFish metabarcoding como descrito no Miya et al. ¹²

Resumidamente, foi realizada de 1º ciclo de PCR para amplificar a região alvo (12S mitocondrial de genes rRNA;. Ca de 170 pb) e para acrescentar adaptadores para sequenciamento-end emparelhado. Durante oito amostras Edna (excluindo os dois controles negativos), realizamos replica 10 PCR para ver variações no número de espécies detectadas dentro de cada amostra (total de 80 PCRs). Nós também adicionamos o filtro e blanks de PCR para cada oito amostras Edna (total de 16 PCRs). No total, obtivemos 96 produtos de PCR do PCR primeira rodada e foram usados ​​como modelos para segunda-round PCR para a dupla indexação e acrescentar adaptadores adicionais para a preparação da biblioteca seguintes Miya et al. ¹²

O sequenciamento de extremidade emparelhado (2 x 150 pb) das 96 bibliotecas produziu lê 4127546, com uma média de 42,995 leituras por biblioteca (40539 lê no cartucho de filtro e 43.121 lê no filtro de fibra de vidro). Após demultiplexing e subsequente pré-processamento dos dados brutos, 1.068.266 leituras foram retidos para as pesquisas BLAST para atribuição taxonômica. Destes lê, 830,788 leituras foram identificadas como aquelas espécies contidas no tanque Kuroshio (Tabela 1). Foram detectadas 60 espécies tanque de 830.788 lê e os números médios de espécie detectada para o 10 PCR replica das oito amostras EdNA variou de 29 para 1 L (filtro de fibra de vidro) a 55 durante 4 G (cartucho de filtro) (Tabela 1) . números de leitura dos dois espaços em branco desde os oito amostras Edna foram menores, variando de 0a 12 para as espécies de tanque.

Verificou-se que o número de espécies detectadas por o cartucho do filtro foi significativamente mais elevada do que as dos filtros de fibra de vidro (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001; Figura 1) em volumes de água do mar 1-4 L. Número de espécies detectadas por o cartucho de filtro foram cerca de 1,5 vezes mais elevado do que aqueles que utilizam os filtros de fibra de vidro e, em ambos os métodos, o número de espécies detectadas aumentou com o volume de água filtrada (ANCOVA, F = 164,2, P <0,001).

Um número mais elevado de espécies detectadas por o cartucho de filtro pode resultar de uma ou mais das seguintes etapas nos fluxos de trabalho experimentais: filtração da água recolhida através (1) de diferentes materiais (PVDF hidrófilo [polivinilideno difluoreto] vs de microfibra de vidro) e / ou (2) tamanhos de poros nominais diferentes (0.4581; vs. 0,70 mm m) nos cartuchos filtrantes e filtros de fibra de vidro pode reter mais Edna de peixes no filtro ex-; (3) utilização de um agitador rotativo na incubadora pré-aquecido produz mais o rendimento de ADN a partir dos cartuchos de filtro do que nos filtros de fibra de vidro dobradas em uma coluna de rotação colocados sobre um bloco de aquecimento imóvel; (4) recolha do ADN extraído por centrifugação a partir do cartucho de filtro é mais eficiente do que o do filtro de fibra de vidro, devido a diferentes materiais de filtro e / ou diferentes métodos de centrifugação. Aparentemente, um estudo mais rigorosamente projetada é necessária para identificar os fatores responsáveis ​​pela consistentemente maior número de espécies detectadas pelo filtro cartucho no presente estudo.

Figura 1: Número de Detectado Espécies conspiraram contra Volumes água filtrada em MiFish Metabarcoding Ana lise de EdNA do Kuroshio tanque, Okinawa Churaumi aquário. O número de espécies detectadas é restrito às espécies contidas no tanque. A partir de 30 L de água do mar, que filtrada 1, 2, 3, e 4 L amostras utilizando os cartuchos de filtro e os filtros de fibra de vidro e extraiu-se EdNA desses filtros utilizando os presentes e anteriormente descritos protocolos de ^12, respectivamente. Foram realizadas análises metabarcoding MiFish (detecção simultânea de múltiplas espécies) por 10 PCR replica a partir dos quatro volumes de água utilizando dois protocolos. A barra horizontal na caixa representa a mediana; as bordas superior e inferior da caixa correspondem a inter-quartis, as barras verticais corresponde a 1,5 x quartis, e os pontos representam valores extremos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Tabela 1:.. Composição taxonômica e ler os números das 60 espécies detectadas em análises MiSeq de amostras Edna do tanque de Kuroshio Apenas as espécies contidas no tanque com sequências de referência no banco de dados personalizado são mostrados por favor clique aqui para ver uma versão maior essa mesa.

Em muitos estudos metabarcoding utilizando amostras ambientais, tais como a água eo solo, tratamento pós-filtração do cartucho de filtro é geralmente da seguinte forma ^24,25: 1) o corte aberto ou fissuras da caixa com ferramentas manuais (cortador de tubos ou um alicate); 2) remoção do filtro a partir do cartucho; e 3) o filtro de corte em pedaços pequenos com uma lâmina de barbear para a extracção do ADN. Para evitar tais pesado e procedimentos que são propensas à contaminação no laboratório demorado, nós tentámos vários métodos de extracção de ADN no interior do alojamento do cartucho de filtro, utilizando um kit comercial barato amplamente utilizada, e desenvolvido com sucesso o presente protocolo com favorável os resultados da análise metabarcoding EdNA (Figura 1).

Um dos passos mais críticos na presente protocolo é a utilização de um agitador rotativo numa incubadora pré-aquecido, que é capaz de proporcionar um rendimento bom para DNA subsequente prepar bibliotecação na análise metabarcoding Edna. agitação constante da solução de proteinase-K no interior do invólucro à temperatura óptima provavelmente facilita a extracção do ADN a partir de partículas retidas no filtro. Note-se, no entanto, que este protocolo envolve a utilização de ambos um agitador rotativo e de uma incubadora, a qual deve ser capaz de acomodar o ex. Além disso, uma centrifugadora que pode acomodar-se a 15 ml e 50 ml de tubos cónicos é indispensável para a remoção do líquido remanescente a partir do filtro de pós-filtração e recolhendo o DNA extraído no interior do cartucho, respectivamente.

Não há outra opção para alcançar tal extração de DNA sem ter que cortar abrir o cartucho (ver Tabela de Materiais / Reagentes). O kit não usa enzimas para a extração de DNA; em vez disso, ele usa um tampão de lise especial em combinação com a lise mecânica adicional com batida talão. Em experimentos preliminares com base em água do mar a partir da Pacific Coastal temperado, que attempextrações de DNA ted usando este kit, juntamente com um protótipo do presente protocolo utilizando o kit comercial. Com a utilização do protocolo de protótipo último, que consistentemente reconhecido produtos de amplificação distintas em electroforese em gel para a PCR 1-rodada. Em contraste, não conseguimos obter quaisquer produtos de PCR através da utilização de um kit diferente (ver Materiais / Reagentes Tabela) apesar seguindo dois protocolos alternativos fornecidos pelo fabricante. Considerando-se que os passos de remoção de inibidor da PCR estão incluídos nos dois protocolos de o segundo kit (ver Materiais / Reagentes Tabela), esta observação sugere uma falta de quantidades adequadas de ADN no modelo. Tais rendimentos relativamente baixos de ADN a partir de amostras ambientais utilizando o segundo kit são reportados em estudos recentes ^26,27.

No presente protocolo, nós escolhemos o cartucho do filtro com o grande tamanho dos poros nominal (0,45), enquanto os estudos microbianos aquático conventionally usar o um mais pequeno (0,22 um) após pré-filtração através de filtros de tamanho de poro maiores (de 1 a 3 pM) ^28. As razões de nossa escolha são simples e diretas, e não são baseadas em argumentos teóricos: 1) o tamanho dos poros é muito mais próximo ao dos filtros de fibra de vidro (0,70 ^ m) Temos convencionalmente usados em Edna estudos anteriores ^{12,14, 22,23;} 2) espera-se para permitir que um maior volume de água a ser filtrada do que a mais pequena. A última característica é particularmente significativo para os nossos atuais projetos de pesquisa submetidos nos-mar aberto e de profundidade ecossistemas com abundância de peixes raros e biomassa. De facto, constatou-se filtração com êxito de uma forma independente amostrado de 10 L de água do mar a partir do tanque de Kuroshio sem entupimento perceptível (resultados não mostrados). Recentemente, no entanto, de Turner et ai. ²⁹ demonstraram que 0,2 um de filtração captura maximizada EdNA carpa (85% ± 6%), minimizando total (isto é, não-alvo) EdNAcaptação (48% ± 3%), mas limita este entupimento do filtro de tamanho de poro para um volume de amostra inferior a 250 ml. Estudos adicionais são necessários para determinar os poros do filtro volume de tamanho e água filtração ideal do cartucho de filtro para Edna metabarcoding em vários tipos de ambientes aquáticos com diferentes níveis de abundância de peixe e de biomassa.

Uma das limitações deste protocolo é que a filtração de água deve ser realizada no laboratório em que uma fonte de alimentação está disponível. Devido à estabilidade química limitada de ADN, EdNA começa a degradar-se mais rapidamente, uma vez que é derramado a partir de um organismo e é detectável apenas por um curto período de tempo em ambientes aquáticos (horas ou dias) ^30. Por isso, é ideal para filtrar a amostra de água imediatamente após a colheita, para evitar uma degradação significativa de Edna. A este respeito, a evolução dos métodos de filtragem no local, usando o cartucho de filtro seria um passo seguinte promissora. A portabilidade e sterility do cartucho de filtro permitir o desenvolvimento dos métodos de filtragem no local, o que proporcionará Edna mais intacta que pode refletir a composição de espécies da comunidade de peixes mais precisamente em Edna metabarcoding. O Edna coletadas nos cartuchos de filtro pode ser estabilizada pela injeção de um reagente comercial ³¹ (ver Materiais / Reagentes Table) ou tampão Longmire ³² para o cartucho antes de trazê-lo de volta para o laboratório.

The authors have nothing to disclose.

This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.