Method Article
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
يشير الحمض النووي البيئي (إدنا) في البيئات المائية على المواد الجينية الموجودة في عمود الماء. أثبتت الدراسات الحديثة فائدة ادنا للكشف عن الأسماك من البيئات المائية المختلفة، بما في ذلك البرك 1-3، 4-8 الأنهار والجداول 9، ومياه البحر 10-14. ركزت معظم هذه الدراسات على الكشف عن الأنواع واحدة أو عدد قليل الغازية 1،4-6،8،14 ونادرة أو مهددة 3،9، في حين حاولت بعض الدراسات التي أجريت مؤخرا كشف في وقت واحد من أنواع متعددة في المجتمعات الأسماك المحلية 7،9، 12،13،15 وmesocosms 11،12.
ويسمى هذا النهج الأخير "metabarcoding" ويستخدم إدنا metabarcoding واحدة أو عدة مجموعات من الاشعال PCR لcoamplify منطقة الجين عبر عينات متنوعة تصنيفيا. ويلي ذلك إعداد مكتبة مع الفهرسة وإضافة محول، ويتم تحليل المكتبات فهرستها من قبل الإنتاجية العالية التسلسل الموازيمنصة. مؤخرا ميا وآخرون. 12 وضعت الاشعال PCR عالمية لmetabarcoding إدنا من الأسماك (وتسمى "MiFish"). الاشعال MiFish تستهدف في منطقة التغير الزائد من الميتوكوندريا 12S الريباسي جين (163-185 بي بي)، الذي يحتوي على معلومات كافية لتحديد الأسماك لعائلة التصنيف، جنس والأنواع باستثناء بعض المتجانسات ترتبط ارتباطا وثيقا. مع استخدام تلك الاشعال في إدنا metabarcoding، ميا وآخرون. 12 الكشف عن أكثر من 230 نوعا البحرية شبه الاستوائية من الدبابات حوض السمك مع المعروفة تكوين الأنواع والشعاب المرجانية بالقرب من الحوض.
مع تحقيق بروتوكول metabarcoding لاستيعاب مياه البحر الطبيعية مع مستويات تركيز إدنا من أسماك مختلفة، لاحظنا أن الاشعال MiFish فشلت في بعض الأحيان إلى تضخيم المنطقة المستهدفة لإعداد مكتبة لاحق. واحد من الأسباب الأكثر احتمالا لهذا التضخيم PCR ناجحة هو عدم وجود كميات كافية من الشركة المصرية للاتصالاتmplate الحمض النووي الواردة في كميات صغيرة من الماء المصفى (أي 1-2 L). وعلى الرغم من تركيز إدنا من مجموعة تصنيفية معينة هو مجهول قبل التضخيم، والترشيح من كميات المياه الكبيرة (> 1-2 لتر) من شأنه أن يكون وسيلة بسيطة وفعالة لجمع أكثر إدنا من البيئات المائية مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية، مثل المحيطات المفتوحة وأعماق البحار النظم الإيكولوجية.
بالنسبة للمرشحات الألياف القرص المستخدمة تقليديا في عدد من البحوث إدنا الأسماك 16، خراطيش تصفية لديها ميزة على استيعاب كميات المياه الكبيرة قبل انسداد 17. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة حجم كبير (> 20 L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية باستخدام خراطيش تصفية 18. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تعبئتها بشكل فردي ومعقمة، ويمكن إجراء عدة خطوات سير العمل التجريبي في السكن التصفية، وبالتالي تقليل احتمال تعرضها للتلوث من المختبر 19. الأخيرالميزة الهامة لإدنا metabarcoding، والذي من مخاطر التلوث ما زال ضمن أكبر التجريبية تتحدى 20،21. على الرغم من هذه المزايا التقنية خراطيش مرشح، لم يتم استخدامه في الدراسات إدنا من الأسماك مع اثنين من الاستثناءات 8،15.
نحن هنا نقدم بروتوكول لترشيح من عينات المياه مع فلتر خرطوشة واستخراج إدنا من مرشح من دون الحاجة إلى قطع فتح الإسكان. ونحن نقدم أيضا اثنين من أنظمة تنقية المياه البديلة اعتمادا على كميات المياه (≤4 L أو> 4 L). لمقارنة أداء بروتوكول المطورة حديثا وبروتوكول يستخدم سابقا باستخدام فلتر الألياف الزجاجية في مجموعتنا البحثية 12،14،22،23، ونحن أداء إدنا metabarcoding تحليل مياه البحر من خزان ماء ضخم (7500 م 3 ) مع تركيبة الأنواع المعروفة، وعرض عدد من أنواع الكشف المستمدة من البروتوكولين كنتائج التمثيلية. هذا البروتوكول حكما تم وضعها لmetabarcoding إدنا من الأسماك، ولكن ينطبق أيضا على ادنا من الكائنات الحية الأخرى.
ملاحظة: هذا البروتوكول لا يتعامل مع طرق أخذ العينات المياه وmetabarcoding. قد أخذ عينات المياه بطرق مختلفة اعتمادا على أغراض الدراسة 16 وانظر ميا وآخرون. (12) لتفاصيل الطرق metabarcoding باستخدام بادئات MiFish. لاحظ أن الماء عينات يجب أن تبقى باردة جدا وتصفيتها في غضون ساعات قليلة لتجنب تدهور إدنا. لاحظ أيضا أن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام شاكر الدوارة وحاضنة، وهذه الأخيرة يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب السابق. وبالإضافة إلى ذلك، جهاز للطرد المركزي التي يمكن أن تستوعب كل من 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية أمر لا غنى عنه لإزالة السائل المتبقي من مرشح ما بعد الترشيح وجمع الحمض النووي المستخرج داخل خرطوشة، على التوالي.
1. معالجة كاب برغي وL كيس من البلاستيك 1
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L.
2. جمعية نظام الترشيح
3. الترشيح من عينات المياه (≤4 L) باستخدام فلتر خرطوشة
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب قائمة بذاتها لوحة وأو معلقة في كيس من البلاستيك مليئة 1 لتر من الماء. ومن شأن شبكة لوحة، شوكات متعددة، وموقف لوحة، كل ما هو متاح من المخازن على الانترنت، أن تكون مفيدة لتجميع هذه الوحدة. الأوتوكلاف مدخل ومخرج قبعات LUER لخرطوشة الفلتر قبل الاستخدام.
4. ترشيح المياه (> 4 L) عينات باستخدام فلتر خرطوشة
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم تنقية المياه هو ≤4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب زجاجة كتاب 10 لتر مجهزة صمام والمتاح طرف ماصة 10 مل. قطرها الداخلي 10 مل ماصة (15.0 مم) وتفتق من طرفنهاية وينبغي أن تندرج إلى القطر الخارجي للصمام (15.0 مم) ومدخل الميناء من خرطوشة مرشح، على التوالي. يتم الاحتفاظ كلا اتصالات بشكل آمن أثناء الترشيح في نوبة الاحتكاك. تعقيم طرف ماصة مع التبييض التجارية 10٪ (حوالي 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.
5. استخراج إدنا من تصفية
ملاحظة: في الخطوات 4 و 5، ونحن نستخدم مجموعة تجارية، إلى حد كبير بعد بروتوكول ل "الدم الأنوية" التي تقدمها المجموعة. عن البساطة، ووصف الإجراء لمعالجة خرطوشة الفردية. في الممارسة العملية، ونحن نوصي تجهيز 8 (أو الحد الأقصى لعدد أجهزة الطرد المركزي) أو أقل المرشحات في وقت واحد.
6. تنقية المستخلصة الحمض النووي
ملاحظة: نحن أزل إدنا مع 100 العازلة ميكرولتر AE بدلا من 200 ميكرولتر المحددة في دليل من عدة التجارية.
فمن الصعب من الناحية الفنية لعزل وتحديد إدنا الأسماك فقط من إدنا الأكبر المستخرج، لأن الاشعال MiFish coamplify المنطقة المستهدفة من بعض الفقاريات غير السمكية، مثل الطيور والثدييات، مع منتجات PCR من نفس الحجم (كاليفورنيا 170 شركة بريتيش بتروليوم ) 12. بدلا من قياس السمك إدنا، ونحن أداء MiFish metabarcoding تحليل إدنا من خزان ماء مع تكوين الأنواع المعروفة باستخدام طريقتين مختلفة من الترشيح واستخراج الحمض النووي، ومقارنة أعداد من أنواع الكشف في مكتبة من البروتوكولين. وقد تم تصميم هذه تجربة بسيطة لإظهار جدوى هذا البروتوكول باسم "نتائج ممثل" وليس لإثبات بدقة تفوقها على الآخرين.
ونحن عينات ما مجموعه 30 لتر من مياه البحر من دبابة في Kuroshio في أوكيناوا Churaumi حوض السمك، أوكيناوا، اليابان (26˚41'39 "N،127˚52'41 "E). تم تصميم دبابة في Kuroshio لاظهار الحيوانات الضخمة البحرية، مع أبعاد (الطول × العرض × العمق) 35 م × 27 م × 10 م وبلغ حجم التداول الإجمالي للمياه من 7500 م 3. ويضم ما يقرب من 60 كبير -sized أنواع الأسماك البحرية المميزة إلى المناطق المحيطة في Kuroshio، واحدة من التيارات الحدودية الغربية تتدفق الشمال الشرقى على طول اليابان. وفي دراسة MiFish metabarcoding السابقة، ميا وآخرون. 12 الكشف عن 61 من الأنواع 63 (97٪) يرد في خزان من خمس عينات مياه البحر 2 لتر.
لتنقية مياه البحر، وكنا خراطيش تصفية (حجم المسام = 0.45 ميكرون)، والألياف الزجاجية مرشحات القرص (حجم المسام = 0.70 ميكرون). نحن تصفيتها في وقت واحد في مياه البحر على نفس متعددة باستخدام بروتوكولات اثنين لمدة أربعة مجلدات المياه (1، 2، 3، و 4 L، مجموعه ثماني مرشحات). بعد تنقية مياه البحر، ونحن تصفيتها أيضا 1 لتر من الماء PCR الصف مع المرشحات اثنين (وخرطوشة إلتر وفلتر الألياف الزجاجية) كما الضوابط السلبية (اثنان مرشح الفراغات). من هذه الأنواع من المرشحات، واستخرجنا إدنا باستخدام البروتوكولات الجديدة والمستعملة سابقا 12، وكلاهما توظيف نفس المجموعة التجارية. وتعرض ما مجموعه 10 عينات ادنا (بما في ذلك اثنين من ضوابط السلبية) إلى MiFish تحليل metabarcoding كما هو موضح في ميا وآخرون. 12
لفترة وجيزة، أجرينا جولة 1ST PCR لتضخيم المنطقة المستهدفة (12S الميتوكوندريا الريباسي الجينات؛ كاليفورنيا 170 بي بي) وإلحاق محولات لتسلسل إقران نهاية. لمدة ثماني عينات ادنا (باستثناء ضوابط السلبية اثنين)، أجرينا 10 PCR يعيد لرؤية الاختلافات في عدد من الأنواع المكتشفة داخل كل عينة (مجموع 80 تقارير إنجاز المشروعات). أضفنا أيضا مرشح والفراغات PCR إلى كل ثماني عينات ادنا (ما مجموعه 16 تقارير إنجاز المشروعات). في المجموع، وحصلنا على 96 المنتجات PCR من 1ST الجولة PCR وكانت تستخدم قوالب ل-2nd جولة PCR للفهرسة المزدوجة وإلحاق محولات إضافية لإعداد مكتبة التالية ميا وآخرون. 12
تسلسل إقران نهاية (2 × 150 بي بي) من مكتبات 96 أسفرت 4127546 يقرأ، بمتوسط 42995 يقرأ في مكتبة (40539 يقرأ في خرطوشة تصفية و43121 يقرأ في فلتر الألياف الزجاجية). بعد demultiplexing ولاحق قبل معالجة البيانات الخام، 1068266 يقرأ تم الاحتفاظ بها لعمليات التفتيش BLAST لتخصيص التصنيفية. هذه قراءة، 830788 تم تحديد يقرأ مثل تلك الأنواع الواردة في خزان في Kuroshio (الجدول 1). اكتشفنا 60 نوعا دبابات من 830788 يقرأ ومتوسط عدد الأنواع الكشف عن 10 PCR نسخ متماثلة من العينات إدنا ثمانية تراوحت بين 29 ل1 L (فلتر الألياف الزجاجية) إلى 55 لمدة 4 L (فلتر خرطوشة) (الجدول 1) . وكانت أرقام قراءة في الفراغات اثنين من العينات إدنا ثمانية طفيفة، تتراوح من 012 لأنواع الدبابات.
وجدنا أن عدد الأنواع الكشف عنها من قبل خرطوشة الفلتر كان أعلى بكثير من تلك التي للمرشحات من الألياف الزجاجية (ANCOVA، F = 381.8، P <0.001، الشكل 1) في كميات مياه البحر 1-4 L. وكان عدد من أنواع الكشف عنها من قبل خرطوشة الفلتر أعلى ما يقرب من 1.5 مرة من تلك التي تستخدم مرشحات الألياف الزجاجية وفي كلتا الطريقتين، وعدد من أنواع الكشف عن زيادة مع حجم المياه التي تمت تصفيتها (ANCOVA، F = 164.2، P <0.001).
قد يؤدي ارتفاع أعداد الأنواع الكشف عنها بواسطة فلتر خرطوشة من واحد أو أكثر من الخطوات التالية في سير العمل التجريبية: ترشيح المياه عينات من خلال (1) مواد مختلفة (PVDF ماء [polyvinylidine difluoride] مقابل ستوكات الزجاج) و / أو (2) مختلفة الأحجام المسام الاسمية (0.4581، مقابل 0.70 ميكرون م) في خراطيش تصفية والمرشحات من الألياف الزجاجية يمكن أن تحتفظ أكثر إدنا من الأسماك على مرشح السابق. (3) استخدام شاكر دوارة في الحاضنة مسخن ينتج المزيد من العائد الحمض النووي من خراطيش تصفية من من مرشحات الألياف الزجاجية مطوية في عمود الدوران وضعت على كتلة الحرارة بلا حراك. (4) جمع الحمض النووي المستخرج بواسطة الطرد المركزي من خرطوشة الفلتر أكثر فعالية من ذلك من مرشح من الألياف الزجاجية بسبب مواد التصفية مختلفة و / أو أساليب الطرد المركزي مختلفة. على ما يبدو، لا بد من دراسة تصميم أكثر صرامة لتحديد العوامل المسؤولة عن ارتفاع عدد باستمرار من أنواع الكشف عنها بواسطة خرطوشة مرشح في هذه الدراسة.
الشكل 1: عدد الكشف عن الأنواع دبر ضد أحجام التداول المصفاة المياه في MiFish Metabarcoding آنا يقتصر تحلل من إدنا من في Kuroshio دبابات، أوكيناوا Churaumi حوض السمك، ويبلغ عدد الأنواع الكشف على الأنواع الواردة في الخزان. من 30 لتر من مياه البحر، ونحن تصفيتها 1، 2، 3، و 4 عينات لتر باستخدام خراطيش تصفية و مرشحات الألياف الزجاجية واستخراج إدنا من هذه الفلاتر باستخدام البروتوكولات الحالية والتي سبق وصفها 12، على التوالي. وأجرى الباحثون تحليلا metabarcoding MiFish (كشف في وقت واحد من أنواع متعددة) لمدة 10 PCR يعيد من كميات المياه أربعة باستخدام اثنين من البروتوكولات. شريط أفقي في مربع يمثل المتوسط. الحواف العلوية والسفلية مربع من تقابل بين الشرائح الربعية، وأشرطة عمودية تتوافق مع 1.5 × الربعية، والنقاط تمثل القيم المتطرفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
الجدول 1:.. التركيب تصنيفية ومقروءة الأرقام من 60 أنواع الكشف في تحليلات MiSeq العينات إدنا من في Kuroshio دبابات وتظهر تلك الأنواع الواردة في الخزان مع تسلسل المرجعية في قاعدة بيانات مخصصة فقط الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه الطاولة.
في العديد من الدراسات metabarcoding باستخدام العينات البيئية مثل المياه والتربة، والعلاج في مرحلة ما بعد الترشيح من خرطوشة الفلتر بشكل عام على النحو التالي 24،25: 1) قطع مفتوحة أو تكسير السكن مع الأدوات اليدوية (قطع الأنابيب أو كماشة)؛ 2) إزالة عامل التصفية من خرطوشة. و3) قطع مرشح الى قطع صغيرة بشفرة حلاقة لاستخراج الحمض النووي. لتجنب مثل هذه عدة طرق استخراج الحمض النووي مرهقة والإجراءات التي تكون عرضة للتلوث في المختبر تستغرق وقتا طويلا، حاولنا داخل السكن من خرطوشة الفلتر باستخدام المستخدمة على نطاق واسع، مجموعة تجارية رخيصة، ونجحت في تطوير هذا البروتوكول مع مواتية النتائج من إدنا تحليل metabarcoding (الشكل 1).
واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو استخدام شاكر دوارة في حاضنة مسخن، وهذا هو قادرة على توفير العائد الحمض النووي جيد للprepar مكتبة لاحقأوجه في التحليل metabarcoding إدنا. التحريك المستمر من الحل بروتين-K داخل السكن في درجة الحرارة المثلى ربما يسهل استخراج الحمض النووي من الجسيمات المحاصرين في التصفية. نلاحظ، مع ذلك، أن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام كل من شاكر الدوارة وحاضنة، وهذه الأخيرة يجب أن تكون قادرة على استيعاب السابق. وبالإضافة إلى ذلك، جهاز للطرد المركزي التي يمكن أن تستوعب كل من 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية لا غنى عنه لإزالة السائل المتبقي من مرشح ما بعد الترشيح وجمع الحمض النووي المستخرج داخل خرطوشة، على التوالي.
هناك خيار آخر لتحقيق هذا استخراج الحمض النووي من دون الحاجة إلى قطع فتح خرطوشة (انظر جدول المواد / الكواشف). عدة لا يستخدم أي الانزيمات لاستخراج الحمض النووي. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم العازلة تحلل خاص في تركيبة مع تحلل ميكانيكية إضافية مع الضرب حبة. في التجارب الأولية على أساس مياه البحر الطبيعي من المحيط الهادئ الساحلي المعتدل، نحن المحاولهقلع تيد الحمض النووي باستخدام هذه المجموعة جنبا إلى جنب مع نموذج من هذا البروتوكول استخدام عدة التجارية. مع استخدام بروتوكول النموذج الأخير، أدركنا باستمرار منتجات التضخيم متميزة في الكهربائي للهلام ل1ST الجولة PCR. في المقابل، لم نتمكن من الحصول على أي من المنتجات PCR من خلال استخدام مجموعة مختلفة (انظر المواد / الكواشف الجدول) على الرغم التالية بروتوكولين البديلة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. وبالنظر إلى أن تدرج PCR خطوات إزالة المانع في البروتوكولين من مجموعة الثانية (انظر المواد / الكواشف الجدول)، وتشير هذه الملاحظة عدم وجود كميات كافية من الحمض النووي في القالب. وذكرت هذه العوائد الحمض النووي منخفضة نسبيا من العينات البيئية باستخدام مجموعة الثانية في الدراسات الحديثة 26،27.
في هذا البروتوكول، الذي اخترناه خرطوشة الفلتر مع كبير حجم المسام الاسمي (0.45 ميكرون)، في حين أن الدراسات الميكروبية المائية conventionaLLY استخدام واحد أصغر (0.22 ميكرون) بعد prefiltration من خلال أكبر المرشحات حجم المسام (1-3 ميكرون) 28. أسباب اختياره لدينا هي بسيطة ومباشرة، ولا تستند على الحجج النظرية: 1) حجم المسام هو أقرب بكثير إلى أن من المرشحات من الألياف الزجاجية (0.70 ميكرون) ونحن قد استخدمت تقليديا في إدنا سابقة يدرس 12،14، 22،23. 2) أنه من المتوقع أن تسمح كميات أكبر من الماء لتتم تصفيته من أصغر واحد. الميزة الأخيرة هي ذات أهمية خاصة للمشاريع البحثية الحالية لدينا تمر في النظم الإيكولوجية في المحيطات المفتوحة وأعماق البحار مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية. في الواقع، أكدنا الترشيح الناجح لأخذ عينات بشكل مستقل 10-L من مياه البحر من خزان في Kuroshio مع عدم وجود انسداد ملحوظ (النتائج غير معروضة). في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، أظهرت تيرنر وآخرون. 29 أن 0.2 ميكرون الترشيح القبض على تعظيم الكارب ادنا (85٪ ± 6٪)، في حين التقليل الكلي (أي غير المستهدفة) إدناالقبض على (48٪ ± 3٪)، ولكن مرشح انسداد يقتصر هذا حجم المسام لحجم العينة أقل من 250 مل. هناك حاجة لدراسات إضافية لتحديد مرشح المسام حجم حجم والمياه الترشيح الأمثل للخرطوشة فلتر لإدنا metabarcoding في مختلف أنواع البيئات المائية مع مستويات مختلفة من وفرة الأسماك والكتلة الحيوية.
واحد من أوجه القصور في هذا البروتوكول هو أن ترشيح المياه يجب أن يتم تنفيذ في المختبر حيث يتوفر التيار الكهربائي. بسبب الاستقرار الكيميائي محدود من الحمض النووي، إدنا يبدأ في التدهور بمجرد إلقاء أنه من كائن حي ويمكن كشفها إلا لفترة قصيرة من الزمن في البيئات المائية (ساعات إلى أيام) 30. لذلك فهي مثالية لتصفية عينة الماء مباشرة بعد جمع لتجنب تدهور كبير في إدنا. وفي هذا الصدد، فإن التطورات في أساليب الترشيح على الموقع باستخدام خرطوشة مرشح أن يكون الخطوة التالية واعدة. قابلية وsterilitذ من خرطوشة الفلتر يمكن تطوير أساليب الترشيح في الموقع، والذي سيوفر إدنا أكثر سليمة التي يمكن أن تعكس تركيبة الأنواع من المجتمع الأسماك أكثر دقة في إدنا metabarcoding. وادنا التي تم جمعها على خراطيش تصفية قد استقرت قبل حقن كاشف التجاري 31 (انظر المواد / الكواشف الجدول) أو Longmire العازلة 32 في خرطوشة قبل إعادته مرة أخرى إلى المختبر.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
Manifold | As One | 2-258-01 | |
Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved