Síntese Facile de micelas Worm-like por luz visível Mediated Dispersão Polimerização Usando Photoredox Catalisador

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (λ = 460 nm, 0.7 mW/cm²), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)₃Cl₂ can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

A síntese de não esféricas (e outros) morfologias de nanopartículas tem sido tradicionalmente conseguida utilizando um procedimento de auto-montagem de múltiplos passos começando com a síntese e purificação de dibloco bem definido anfifílico (ou multibloco) copolímeros. Uma das técnicas de auto-montagem mais comuns foi popularizado por Eisenberg na década de 1990, e envolve a dissolução do copolímero de blocos anfifílico de um solvente comum para ambos os blocos de polímero seguindo-se a adição lenta de um solvente selectivo para um dos blocos de ^1-3 . À medida que o solvente selectivo (normalmente água) é adicionado, o copolímero em bloco é submetido a auto-montagem de modo a formar nanopartículas poliméricas. A morfologia final (ou misturas de morfologias) das nanopartículas são determinadas por um grande número de factores, tais como os comprimentos relativos de cada bloco de polímero, a taxa de adição de água e da natureza do solvente comum. No entanto, esta abordagem geralmente só permite a produção de nanopartigos a relativamente baixo teor em sólidos (menos do que 1% em peso) e por isso limita a sua prática escalabilidade ^4. Além disso, a formação reprodutível de fases "intermédias", como micelas semelhantes a vermes pode ser difícil devido à estreita gama de parâmetros necessários para estabilizar esta morfologia não esféricas ^5.

A abordagem induzida por auto-montagem de polimerização (PISA) resolve parcialmente os inconvenientes da abordagem Eisenberg, utilizando-se o processo de polimerização para conduzir a auto-montagem in situ, permitindo a síntese de nanopartículas de muito mais alto teor de sólidos (tipicamente 10-30% em peso) ^{6 -8.} Em uma abordagem típica PISA, um processo de polimerização viva é utilizada para prolongar a cadeia de uma macroiniciador solvente solúvel (ou macro-CTA) com um monómero que é inicialmente solúvel no meio de reacção, mas forma um polímero insolúvel. A abordagem PISA foi usado para sintetizar micelas vermiformes testando sistematicamente um número de ex parâmetros rimentais e usando diagramas de fase detalhadas como um "roteiro" sintética ^5,9.

Apesar de sua síntese desafiador, há um grande interesse em nanopartículas semelhantes a vermes, devido às suas propriedades interessantes em relação aos seus homólogos esféricas. Por exemplo, demonstramos que as micelas carregadas com droga de curta e longa vermiformes sintetizados usando uma abordagem PISA têm significativamente maior citotoxicidade in vitro em comparação com micelas esféricas ou vesículas ^10. Outros têm mostrado uma correlação entre a proporção de nanopartículas e tempo de circulação sanguínea in vivo em modelos ^11. Outros mostraram que a síntese de nanopartículas vermiformes utilizando uma metodologia PISA apropriada produz um gel macroscópico devido à nanoescala emaranhamento dos filamentos de nanopartículas. Estes géis demonstraram potencial como géis esterilizáveis, devido ao seu comportamento de sol-gel termorreversível ^12.

Recentemente, relatou a utilização de uma técnica temperatura ambiente fotopolimerização fácil para mediar o processo de PISA para produzir nanopartículas dediferentes morfologias ^15. Aqui, um protocolo visualizado é apresentado para a síntese reprodutível de micelas vermiformes ao observar o comportamento viscosidade da solução durante a polimerização. A dispersão polimerização prossegue prontamente utilizando diodos emissores de luz disponíveis comercialmente (LEDs) (λ = 460 nm, 0,7 mW / ^cm2).

1. Síntese e Caracterização de POEGMA Macro-CTA

1. Adicionar oligo (etilenoglicol) éter metil metacrilato (OEGMA) (12 g, 4 × 10 ^-2 mol), 4-ciano-4- (phenylcarbonothioylthio) pentanóico (CPADB) (0,224 g, 8 x 10 ^-4 mol), 2,2'-azobis (2-metilpropionitrilo) (AIBN) (16,4 mg, 0,1 mmol) e 50 ml de acetonitrilo (MeCN) para um frasco de 100 ml de fundo redondo.
2. Veda-se o balão com um septo de borracha e fios de aço adequadamente dimensionado e arrefecer o balão até a temperatura ambiente e <4 ° C num banho de gelo-água.
3. Desoxigena-se o balão durante 30 minutos por borbulhamento de azoto directamente para a mistura reaccional através de uma agulha 21 G (0,8 mm x 120 mm) com uma segunda agulha 21 G (0,8 mm x 38 milímetros), que actua como um respiradouro.
4. Colocar o balão num banho de óleo a 70 ° C durante 5,5 h antes de ser desactivada a polimerização por imersão num banho de gelo-água e expondo o conteúdo ao ar.
5. Remova o MeCN por agitação sob acontinuous fluxo de ar comprimido e re-dissolver-se a mistura em bruto em ~ 40 ml de tetra-hidrofurano (THF).
6. Adicionar o conteúdo do balão, gota a gota a 400 ml de uma mistura rapidamente agitada de éter de petróleo (pe 40-60 ° C) e éter dietílico (70:30, v / v) e continuar a agitar até que o sobrenadante não é mais turvo.
   Nota: se arrefecia num banho de gelo pode ser utilizado para acelerar o processo de precipitação.
7. Decantar o sobrenadante e re-dissolve-se o resíduo de polímero em ~ 40 ml de THF.
8. Repetir o processo de precipitação (passos 1,5-1,7) pelo menos mais duas vezes para assegurar a remoção completa de monómero residual OEGMA. Remover o excesso de solvente a partir do POEGMA purificada macro-CTA em primeiro lugar por agitação sob um fluxo contínuo de ar comprimido e de secagem num forno de vácuo (20 ° C, 10 mbar) durante 4 horas.
9. Determinar o número do peso molecular médio do POEGMA macro-CTA por ressonância magnética nuclear (RMN) (M _{n, RMN)} usando um método anteriormente relatado 15. Utilizando cromatografia de permeação de gel a ¹⁵ (GPC) (dimetilacetamida como fase móvel e padrões apropriados para calibração) calcular a dispersibilidade do polímero (D).
   Nota: A utilização da síntese acima (passos 1,1-1,8) deve render um POEGMA macro-CTA com M _{n, RMN} = 9.000, e D <1,15. Se o peso molecular (e dispersibilidade) do sintetizado POEGMA macro-CTA difere da síntese aqui apresentada (entre 7000 - 1000 g / mol), a formação de micelas semelhantes a vermes (como indicado por na gelificação in situ) ainda pode ocorrer usando a metodologia PISA subsequente apresentado em (seção 2) embora a um tempo de reação ligeiramente alterada.

2. Preparação de POEGMA- b -PBzMA Nanopartículas Usando PISA

1. Prepara-se uma solução stock de 1 mg / ml de Ru (bpy) ₃ Cl ^_2. 6H ₂ O em etanol (EtOH). Guardar a solução estoque na geladeira para minimizar a evaporação do solvente.
2. Ligue uma pipeta Pasteur com um pequeno chumaço de algodão com uma segunda pipeta para ajudar a embalá-lo firmemente. Pour óxido de alumínio básico para a pipeta, com o tampão de algodão para dar uma coluna de cerca de 5 cm. Remover o inibidor hidroquinona éter monometílico de BzMA comercial passando ~ 3 ml de BzMA através da coluna e recolhendo o eluente BzMA deinhibited.
3. Adicionar POEGMA macroCTA (~ 9000 g / mol; 76,9 mg, 8,5 x 10 ^{-6 mol).,} Deinhibited BzMA (0,301 g, 1,71 x 10 ^-3 mole), Ru (bpy) ₃ Cl ₂ 6H ₂ O (128 mg, 1,71 x 10 ^-7 mol, 128 ul de uma solução a 1 mg / ml etanólico estoque), 0,383 mL de MeCN e 1,402 mL de EtOH (1.913 ml total de solvente, de 80% em peso, de 20 v / v% de MeCN) para um frasco de vidro de 4 ml .
4. Execute o procedimento de desoxigenação como descrito nas etapas 1.2-1.3.
5. Colocar o frasco dentro de um béquer de vidro de 2000 ml (Figura 2) alinhadas com tiras LED azul (λ _max = 460nm, 0,7 mW / cm ²⁾ e irradiar à temperatura ambiente com agitação magnética. Monitorar o frasco de reacção rotineiramente após 20 h e removê-la a partir do reactor, quando a solução de alta viscosidade forma um gel posição livre quando o frasco é invertido (Figura 3).
   Nota: O tempo total para produzir um gel de free-standing deve ser de cerca de 24 horas de irradiação de luz azul usando as condições aqui apresentados. Pequenas diferenças nos reactores de irradiação de luz (dimensões físicas, intensidade, etc.) pode exigir condições ligeiramente diferentes (especificamente de tempo de reacção) para se conseguir a formação in situ de micelas semelhantes a vermes.
6. Após remoção do reactor, extinguir a polimerização por exposição do gel de nanopartículas ao ar durante alguns minutos, e de armazenar o frasco fechado vertical no escuro.

3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) por imagem das nanopartículas Morfologia

1. Coloque cerca de 40 mg do nanopa brutoArtigo de gel (a partir da secção 2) num frasco de vidro de 4 ml.
2. Continuamente agitar o gel de nanopartículas utilizando um misturador de vórtice e adicionar 4 mL de EtOH gota a gota durante um período de pelo menos 5 min. O gel deve tornar-se uma solução de fluxo livre durante a adição do solvente.
   Nota: Se o gel é diluído com EtOH demasiado rapidamente ou não agitado adequadamente, pode ocorrer alguma precipitação das nanopartículas. Veja o passo 3.3.
3. Remova todos os agregados macroscópicos das nanopartículas diluído por filtração através de lã de vidro.
4. Realizar TEM imagiologia (coloração com acetato de uranilo) da amostra diluída de acordo com um procedimento relatado anteriormente. ¹⁵

Neste estudo, o protocolo de polimerização em duas etapas é utilizado para a síntese de micelas semelhantes a vermes, utilizando uma abordagem PISA (Figura 1). No primeiro passo, a polimerização é realizada de OEGMA obtendo-se um macro-POEGMA CTA, que pode ser usado como um estabilizador no passo de polimerização subsequente. A polimerização prossegue PET-RAFT sob condições de dispersão, devido à insolubilidade do PBzMA em etanol que em última análise conduz à formação de nanopartículas. Durante a polimerização, a mistura reaccional inicialmente transparente pode ser observado a tornar-se turvo, de acordo com uma polimerização em dispersão e, eventualmente, faz a transição para um estado semelhante a gel altamente viscoso que indica a formação de micelas do tipo sem-fim (Figura 3). Indicações de uma polimerização "viva" são evidentes (Figura 1A), com dispersities baixas de polímero (D <1,3) e uma boa correlação entre a w molecularoito e conversão do monómero. Além disso, vestígios de GPC (Figura 1B) indicam uma distribuição unimodal predominantemente com diferentes de conversão, embora alguns terminação de elevado peso molecular e baixo peso molecular tailing é observado neste sistema. Mais importante, estas cadeias de polímero "mortos" não estão em uma quantidade suficiente para inibir a formação de micelas vermiformes puros. A mudança da distribuição de peso molecular com o aumento da conversão sugere a formação predominante de POEGMA- b copolímeros dibloco -PBzMA com uma estreita distribuição de comprimentos de cadeia.

Figura 2A ilustra a configuração do reactor luz utilizada neste experimento no qual uma tira comercial LED 1 metro (λ = 460 nm, 4,8 W / m) é enrolada dentro de 2 L proveta. Nas nossas experiências, também foi determinado que uma lâmpada de agregado com uma intensidade de luz azul semelhante (Figura 1B) também pode ser utilizada no PET-P RAFTprocesso ISA.

A Figura 4 demonstra que a formação da micela morfologia vermiforme também é realizável em diferentes condições de reacção, tais como tipos de frascos variáveis ​​e composições de reagentes, mas também, se a fonte de luz é aplicado de um modo intermitente. Isto implica que, apesar do forte efeito de penetração da luz sobre as taxas de polimerização, na maioria dos sistemas de fotopolimerização, o comportamento de gelificação no protocolo de PET-RAFT PISA pode ainda ser utilizada como um indicador de confiança para a formação de micelas do tipo sem-fim. Este é um resultado importante, pois de imagem tipicamente ex situ TEM é obrigada a fornecer evidências de formação de micelas de minhoca. Para além do comportamento de gelificação observado, a formação de micelas puramente vermiformes deve ser confirmada através da observação da morfologia de uma quantidade significativa de nanopartículas (> 100) por MET (coloração com acetato de uranilo). Se morfologias vesículas parciais são observados, O tempo de irradiação deve ser reduzida; inversamente, se micelas esféricas são observados, em seguida, tempo de irradiação devem ser ligeiramente aumentados.

Figura esquema 1. A reacção para a síntese de micelas semelhantes a vermes que utilizam PET-JANGADA, uma técnica de fotopolimerização vida. (Acima) abordagem em duas fases para a síntese de micelas semelhantes a vermes, utilizando uma abordagem PISA. (Abaixo) demonstra cinética estudo (A) a evolução do peso molecular e dispersividade do polímero durante a polimerização PISA e (B) a evolução da distribuição do peso molecular por cromatografia de permeação em gel (GPC) com conversão. Adaptado com permissão de ref ^15. Copyright (2015) American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versio maiorn desta figura.

Figura 2. As fotografias digitais de diferentes reatores de luz visível. (A) O reactor circular utilizado no presente estudo tiras revestidas com azul LED (λ _max = 460 nm, 0,7 mW / ^cm2). (B) A lâmpadas domésticas equipados com uma lâmpada de 5 W, que também pode ser usado neste protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. fotografias digitais representativos de um PET-JANGADA mediada PISA polimerização. As imagens foram tiradas (A) antes da polimerização, (B) após 15 horass e (C) depois de 24 horas de irradiação de luz visível. Durante a polimerização, a mistura de reacção, inicialmente transparente torna-se turva e, eventualmente, a transição para um estado de gel de free-standing indicativo da formação in situ de micelas semelhantes a vermes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Caracterização e TEM imagens de POEGMA- b copolímeros dibloco -PBzMA formados usando uma abordagem PET-JANGADA PISA produzindo micelas semelhantes a vermes. MET (e inserções de fotografia digital) de micelas semelhantes a vermes formados utilizando-se diferentes condições de polimerização. (A) e (C) foram iluminadas durante 24 horas, enquanto que (B) Exigiu um ON / OFF tempo total de irradiação de 39 horas antes da gelificação (quando se utiliza um 10.000 g / mol POEGMA macro-CTA). Em cada caso, um gel de elevada viscosidade é formada, que é característica da formação de micelas do tipo sem-fim. Adaptado com permissão de ref ^15. Copyright (2015) American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo visualizado demonstra a capacidade para controlar a formação de micelas vermiformes simplesmente observando o aparecimento de um comportamento do tipo gel. A utilidade desta abordagem reside na capacidade para controlar a formação de sem-fim durante a polimerização em comparação com outros métodos. Este procedimento pode ser realizado usando uma polimerização em duas etapas de dois monómeros disponíveis comercialmente (OEGMA e BzMA) para se obter POEGMA- b -PBzMA copolímeros dibloco anfifílicos auto-montadas.

Deve notar-se aqui que os reactores com diferentes geometrias de reactor, as intensidades de luz, etc, em comparação com aqueles na Figura 2, pode exigir condições para produzir géis de micelas vermiformes ligeiramente alterada. Devido às características de absorção de o catalisador à base de ruténio, a polimerização só pode ocorrer a uma taxa razoável sob luz visível azul. Em princípio, também poderiam ser utilizados outros catalisadores com diferentes propriedades de absorção de luz. Cuidados devem ser tomados para não deixar os géis verme no reactor muito tempo de outra forma precipitados macroscópicos podem começar a se formar. Isto ocorre à medida que as nanopartículas tentar reorganizar nas estruturas vesiculares, mas são inibidas por o meio altamente viscoso. Em alguns casos, observou-se a formação de vesículas ou parciais (medusa octopi estruturas) por meio de imagem TEM quando a polimerização foi mantida no reactor para além da primeira observação de um estado semelhante a gel auto-sustentável.

Para aumentar a acessibilidade desta tecnologia, as polimerizações PET-JANGADA PISA relatados neste protocolo foram realizados à temperatura ambiente, sem regulação externa da temperatura (resfriamento ventilador, banho de água etc.). tiras Além disso, o diodo emissor de luz de baixa voltagem não geram aumentos observáveis ​​nas temperaturas do frasco durante o decurso da polimerização (a menos de 5 ° C). Embora seja bem conhecido que a taxa de polimerização tem uma forte dependência da temperatura, INHibition da capacidade de micelas semelhantes a vermes para induzir o comportamento macroscópico do tipo gel, mesmo quando a polimerização a 50 ° C não foi observada.

Obtenção de micelas vermiformes mais curtos (em média) também é possível através da remoção da fonte de luz, antes do meio de reacção atingiu um estado que está livre, mas tem um aumento perceptível na viscosidade. Esta abordagem pode ser favorável desde que a diluição destes géis mais "brandas" (sem precipitação) para análise é significativamente mais fácil em comparação com os geles de livre-pe. De um modo semelhante, as micelas esféricas podem ser obtidas através da redução do tempo de irradiação ainda mais; tipicamente após o primeiro aparecimento de turbidez durante a polimerização.

Em princípio, uma gama de diferentes monómeros solvophillic poderia ser usado em vez de OEGMA (por exemplo, poli (2-hidroxietil metacrilato), poli (ácido metacrílico), no entanto alguns optimização da cinética de polimerização e os parâmetros de auto-montagemseria necessária. Uma elevada vitalidade da homopolimerização do macro-CTA deve ser demonstrado, a fim de aumentar a eficiência da polimerização subsequente PISA. No entanto, desde que existe uma fase de micela vermiforme suficientemente puro durante o decurso da polimerização, a gelificação pode ocorrer ainda. A utilidade da abordagem apresentada reside no fato de que diferentes estabilizadores comprimento macro-CTA pode ser utilizado sem a necessidade de reotimizar significativamente o procedimento para a formação de micelas do tipo sem-fim. Neste protocolo, o POEGMA macro-CTA foi sintetizado utilizando um protocolo JANGADA termicamente iniciado no entanto, também têm demonstrado a capacidade de gerar POEGMA com alta fidelidade de cadeia-end usando um homogênea protocolo PET-JANGADA ^16. Embora monómeros estruturalmente semelhantes aos BzMA também têm sido relatados para formar géis micelas vermiformes ^17, é provável que apenas um número limitado de monómeros são capazes de sofrer polimerização em dispersão controlada radical Yield sem-fim-como micelas com propriedades significativas gelificação.

Embora diferentes configurações do reactor (incluindo a reacção geometria frasco) pode resultar em diferentes taxas de polimerização, na maioria dos sistemas de fotopolimerização, a capacidade para monitorizar visualmente a formação in situ de micelas vermiformes ajuda a superar esta limitação quando se utiliza uma abordagem de PET-RAFT PISA. Como resultado, o tempo de polimerização pode ser alterada dependendo da configuração precisa do reactor implementado. É bem conhecido que a fase de micela vermiforme pode ser difícil de produzir em elevada pureza e rendimento, no entanto, no método apresentado, somos capazes de produzir partículas semelhantes a vermes para um teor de sólidos de> 10% em peso. Importante, a formação destas partículas pode ser monitorizada durante a polimerização em vez de relatórios anteriores em que a síntese de micelas vermiforme só pode ser confirmada após têmpera a polimerização e a realização de imagem TEM ex situ.

importantly, a capacidade de gerar de forma reprodutível estas nanopartículas com uma elevada relação de aspecto em altos teores de sólidos tem implicações importantes para um número de aplicações particularmente na arena biológica como veículos de entrega de drogas. Um certo número de estudos demonstraram o comportamento interessante de morfologias não esféricas em ambientes biológicos, tais como um aumento do tempo de circulação sanguínea em comparação com os seus homólogos esféricas ¹¹ ou variando o comportamento das células-absorção ^10. Embora estas partículas são sintetizados em solução etanólica, já anteriormente demonstrado que, sob condições apropriadas de diálise a morfologia destas nanopartículas PISA pode ser retido em solução aquosa a ^10. A vantagem desta abordagem reside na capacidade para encapsular agentes terapêuticos em primeiro lugar pouco solúveis em água sob condições de dispersão antes da diálise etanólico em água para estudos biológicos. Além disso, é provável que estas partículas alongadas apresentam variados Beh absorção celularAvior em relação às estruturas esféricas, devido às suas morfologias semelhantes a vírus.

The authors have nothing to disclose.

CB is thankful for his Future Fellowship from Australian Research Council (ARC-FT12010096) and UNSW Australia.