Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com pós-coluna de derivação (PCD) é uma poderosa ferramenta que é útil para resolver uma série de questões em laboratório analítico. Ele pode ser usado para detectar compostos que são de outra forma indetectável, com o conjunto de detectores disponíveis ^1,2, aumentar o sinal do analito alvo, o que permite que os limites inferiores de detecção e quantificação ^3-5 ou derivatizar selectivamente um analito alvo, a fim de evitar efeitos de matriz ^6. PCD reacções comumente usados ​​incluem a reacção de aminas, tais como aminoácidos, com orto-phthaladehyde ^7-9, ninidrina ^9,10 ou ^11,12 fluorescamina, a derivatização de espécies reactivas de oxigénio (ROS) com a 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicais DPPH ^{(•) 13,14} ou 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) ^15,16, e o uso do reagente de iodeto-azida para derivatizar enxofre ccompostos ontaining ^17,18.

Existem, no entanto, numerosos inconvenientes para a utilização de reacções de PCD com sistemas de HPLC ^6. Principalmente entre estes é a utilização de bobinas de reacção entre o ponto de adição do reagente de derivatização (s) e o detector, que permite que o tempo para a mistura e a reacção ocorra ^8. Estes laços de reacção muitas vezes têm volumes de 500 uL ou mais, o que é significativo em comparação com o volume do restante do sistema de HPLC ^19. A utilização destes reacção alto volume ciclos resulta em aumento de alargamento do pico em relação ao que seria observada sem a presença do circuito de reacção. Isto resulta em picos menores, mais largas que têm limites superiores de quantificação e de detecção e resolução cromatográfica negativamente os efeitos. As Figuras 1 e 2 destacar a deterioração da forma do pico que resultam da adição de vários volumes de coluna de ansa reacção pós. esta análisefoi realizado com uma composição de fase móvel de 94% de metanol e 6% de água Milli-Q. O caudal da fase móvel foi de 1 ml / min, o volume de injecção foi de 20 pi e o comprimento de onda análise foi 265 nm. foram inseridos bobinas de diferentes volumes mortos a partir de 20 uL a 1.000 ul entre a coluna e o detector para simular os efeitos de volume morto ciclo de reacção em métodos de PCD. Estes laços foram preparados a partir de tubagem de aço inoxidável de diâmetro interno de 0,5 mm. A experiência foi realizada num sistema de HPLC consiste de um controlador (SCL-10AVP), uma pressão baixa Gradiente válvula (FCL-10ALVP), uma bomba (LC-20AD), um injector (SIL-10ADVP), e um detector de PDA ( SPD-M10ADVP). A fase móvel foi bombeada através de um desgaseificador, antes da introdução no sistema de HPLC. A separação foi efectuada utilizando um x 4,6 mm ID 5? M 250 milímetros. As condições experimentais foram escolhidas para ser típica de reacções de PCD que foram recentemente publicados na literatura.

omais simples, mais comum pós configuração do reactor de coluna é denominado um reactor tubular não segmentada que é efectivamente um tubo longo, fino, através do qual o líquido pode fluir e a reacção pode ter lugar. Neste sistema de alargamento de pico é dependente não apenas o volume morto adicionado ao sistema, mas também o diâmetro interno do tubo, como realçado por Iijima et al. ^8. Além disso, a geometria da bobina desempenha um papel na ampliação da marca observada. Stewart ²⁰ indicou que enrolamento do reactor muda os perfis de fluxo secundário, o que resulta em uma melhor mistura, o que significa que o volume morto pode ser minimizada. Tem sido afirmado que o pico ampliação não é significativo quando se usa um tubo aberto malha bobina ^21. Quando o alargamento do pico é excessivamente grande, outros tipos de reactores também podem ser considerados ^20,22. Estes podem incluir reatores de leito ou reatores de fluxo segmentado. Estes reactores são particularmente úteis para reacções lentas que de outra forma protece grande reação laços. Como reactores tubulares não-segmentadas são os tipos mais comuns de reatores utilizados em aplicações de PCD, o resto deste artigo lida com este tipo de configuração do reator.

O desenho da coluna de fluxo de reacção (RF) incorpora uma montagem final de multi-porta que permite fase móvel para sair (ou enter) a coluna, quer através de uma única porta situada na região central radial da coluna ou três portas localizadas no exterior zona da parede da coluna (ver Figura 3). Estes dois fluxos são separados usando uma montagem final contendo uma frita porosa central que está rodeada por um anel impermeável que é por sua vez rodeado por uma frita porosa externa que se estende para fora da parede da coluna. Devido ao fluxo de anel de cruzeta impermeável central não é possível entre as duas regiões porosas.

Durante a cromatografia de fluxo reacção, o reagente (s) de derivatização são bombeados contra a direcção do fluxo da fase móvel em um ou TWo das portas exteriores da coluna de fluxo reacção. O eluente da coluna é misturado com o reagente (s) derivatização na frita exterior e passado para o detector por meio de uma porta exterior livre. fluxo reacção pode ser utilizada tanto para uma derivatização reagente único (uma porta para o reagente de derivatização, uma porta para passar o eluente da coluna para o detector e uma porta bloqueada) ou um sistema de reagentes dupla (2 portas para os reagentes de derivatização e uma porta de passar o eluente da coluna para o detector). O fluxo da corrente central pode ser usado para detectar o eluente da coluna não derivatizado, de forma eficaz de detecção de multiplexação ^23, ou passado para o lixo.

Uma técnica importante de sintonização que é disponível quando executado cromatografia RF-PCD é a razão entre os fluxos de centrais e periféricos. A razão óptima para cada derivação depende de um número de factores tais como se o fluxo central irá ser detectado ou passado para o lixo. Por conseguinte, uma vez que a razão óptima foi determinada, Deve garantir-se que o rácio fluxo correto é alcançado antes de cada corrida a ser realizada.

Verificou-se que a utilização de uma frita para misturar o fluxo de eluente de coluna e o reagente de derivatização em RF-PCD resulta em uma mistura mais eficiente em comparação com técnicas de mistura tradicionais que empregam tipicamente uma peça em T volume morto zero ou de baixo volume morto W- peça de misturar as duas correntes. Isto permitiu a utilização de relativamente pequenas laçadas de reacção, ou mesmo a eliminação da laçada de reacção completamente. A redução dos resultados de reacção de tamanho de malha em mais nítidas picos em comparação com métodos tradicionais de derivatização pós-coluna. Isto significa que, apesar do facto de nem todo o eluente da coluna é derivatizado, maior sinal para relações de ruído são observados e, portanto, os limites inferiores de detecção e de quantificação pode ser conseguida.

cromatografia de fluxo reacção foi desenvolvido para ultrapassar as dificuldades com a adaptação de reacção PCDs a colunas de HPLC modernos sistemas e, em particular a perda de eficiência causada por banda alargando devido a volumes mortos pós-coluna grandes causadas pela necessidade de empregar um grande volume de reacção de laços. Os processos de mistura mais eficientes na FR-PCD em comparação com PCD convencional significa que os volumes de ansa de reacção mais pequenas podem ser empregues levando a um aumento na eficiência de separação observada. Além disso cromatografia RF-PCD mostra tanto o aumento do sinal e ruído diminuiu em comparação com técnicas convencionais de PCD, resultando em limites inferiores de detecção e quantificação, em comparação com os métodos convencionais de PCD. Uma vantagem adicional de RF-PCD em comparação com os métodos convencionais de PCD é a capacidade de controlar o fluxo não derivatizado, que elui a partir da porta central da coluna de RF, assim como o fluxo de derivatizado que elui a partir da região periférica da coluna. RF-PCD é uma técnica relativamente nova, mas promissora que apresenta muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais de PCD.

Conexão da coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC.

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados).

Nota: Este protocolo descreve 3 métodos de fluxo de reacção de derivatização pós-coluna técnicas (RF-DCP), cada um com um reagente diferente específico para a natureza de um composto químico de interesse. Para a análise dos ROS vá para a seção "1. Detecção de ROS usando DPPH ^•", para a análise de aminas primárias ver secção "2. Detecção de aminas primárias usando fluorescamine", e para a análise de compostos fenólicos vá para a seção "3 . Detecção de fenóisusando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio ". Use água ultra-pura (por exemplo, água Milli-Q) por toda parte.

Nota: A ligação a coluna de RF é conseguida em quase da mesma maneira como uma coluna de HPLC convencional, com a principal diferença sendo o número de acessórios terminais numa coluna de RF. Acessórios utilizados para ligar uma coluna de HPLC padrão para o sistema de HPLC é capaz de ser utilizado para ligar uma coluna de RF para o sistema de HPLC.

1. Detecção de ROS Usando DPPH ^•

1. Criação de instrumento HPLC
   1. Prepara-se o instrumento de HPLC com 100% de água na linha A e 100% de metanol em linha B como a fase móvel. Purgar as bombas como por exigências do fabricante.
   2. Defina-se os componentes instrumentais HPLC e a bomba de derivatização adicional como ilustrado na Figura 4A.
   3. Ajuste o detector de UV-Vis a analisar num comprimento de onda de 520 nm.
2. Criação decoluna de RF
   1. Ligue a entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC.
   2. Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF.
   3. Conectar uma porta periférico de saída para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros.
   4. Ligue o DPPH ^• linha da bomba para uma porta periférica na saída da coluna de RF.
   5. Bloquear a porta periférica não utilizado na saída da coluna de RF usando uma rolha de coluna.
   6. Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% da linha B - 100% de metanol.
   7. Equilibrar a coluna com a fase móvel de metanol a 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo deve ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar.
3. Preparação de DPPH ^• reagente
   1. Prepara-se uma solução / ml 0,1 mg de DPPH ^• em metanol.
   2. Sonicar o balão contendo o DPPH ^• reagente durante 10 min.
   3. Cobrir o balão em folha para evitar a exposição à luz.
   4. Purgar o DPPH ^• bomba com o preparado DPPH ^• reagente como por exigências do fabricante.
4. Ajustando a saída de coluna RF
   1. Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico.
   2. Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min.
   3. Re-pesar o recipiente de porta central e calcular o peso do caudal da ligação central, como segue:
      Peso de Port Central (g) = peso final de navios no porto Central (g) - peso inicial de Port Central Vessel (g)
   4. Repita os passos 1.4.2 e 1.4.3 para o efluente que sai do UV-Vis que é conectada à porta periférica da coluna de RF e calcular o peso em relação ao navio porta periférica comosegue:
      Peso de Peripheral Porto (g) = Peso final do vaso periférico Porto (g) - peso inicial de Peripheral Porto Veículo (g)
   5. Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma:
      % Porto central = Peso da porta central (g) / (peso da porta central (g) + peso da porta periférica (g)) x 100
      % Porta periférica = Peso da Peripheral Porto (g) / (peso de Port Central (g) + Peso do Peripheral Porto (g)) x 100
   6. Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e o fluxo periférico é 30:70 (central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 30%, diminuir a quantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central. Se o fluxo central estiver abaixo de 30% de redução do comprimento da tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central.
   7. Repetir o passo 1.4.1 a 1.4.6, até uma proporção de 30:70 de segmentação (Central: periférica) é alcançado.
   8. Definir a taxa de fluxo do DPPH ^• bomba do reagente a 0,5 ml min ^-1.
      Nota: A coluna RF configurado com DPPH ^• reagente está pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado.
5. Pós-condições executar desligamento
   1. Uma vez que todas as amostras foram injetados, indicando que a execução foi concluída, interrompa o fluxo da bomba de reagente de derivatização.
   2. Remova o DPPH ^• linha de bomba do reagente a partir do porto periférica e tapar a porta.
   3. Equilibrar a coluna com a fase móvel, em que é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL ^min-1 durante 10 min.
   4. Pare o fluxo da bomba de fase móvel de HPLC no instrumento.
   5. Substitua o DPPH ^• reagente com metanol e purgar a bomba adicional.
      Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado.

2. Detecção de aminas primárias Usando fluoresamina

1. Preparação da fase móvel
   1. Prepare 1 L de uma solução de acetato de amónio 10 mM, ajustando o pH da solução a 9,0 com hidróxido de amónio 5 M, antes da diluição para o volume.
   2. Adicionar 52,6 ml de acetonitrilo (ACN) para o tampão acetato de amónio para atingir uma fase móvel pré-misturada de 95:05 (tampão: ACN).
2. Criação de instrumento HPLC
   1. Prepara-se o instrumento de HPLC com o tampão de pré-misturada preparada na linha A, tal como a fase móvel. Purgar a bomba como por exigências do fabricante.
   2. Defina-se os componentes instrumentais HPLC e a bomba de derivatização adicional como ilustrado na Figura 4A.
   3. Anexar uma bobina amortecedor de pulsações para a bomba de derivação.
   4. Defina-se o detector de fluorescência (FLD) com um comprimento de onda de excitação de 390 nm de comprimento de onda e de emissão de 475 nm.
3. Criação de coluna RF
   1. Ligue the de entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC.
   2. Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF.
   3. Conectar uma porta periférica saída da coluna de RF para o detector FLD utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros.
   4. Ligar a bomba de linha de derivação para um porta periférica na saída da coluna de RF.
   5. Bloquear a porta periférica não utilizado na saída da coluna de RF usando uma rolha de coluna.
   6. Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% da linha A - 10 mM de tampão de acetato de amónio pH 9, pré-misturado com 5% de ACN.
   7. Equilibrar a coluna com a linha de uma fase móvel de 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo pode ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar.
4. Preparação do reagente de fluorescamina
   1. Adicione 100 ml de uma solução a 0,1 mg mL ^-1 fluorescamina reagente.
   2. Sonicate durante 1 min.
   3. Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
   4. Purgar a bomba do reagente com o reagente fluorescamine preparado de acordo com as exigências do fabricante.
5. Ajustando a saída de coluna RF
   1. Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico.
   2. Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min.
   3. Re-pesar o recipiente central e calcular o peso do caudal da ligação central, como se segue no passo 1.4.3.
   4. Repita os passos 2.5.2 a 2.5.3 para o efluente que sai do FLD que é conectada à porta periférica da coluna de RF e para calcular o peso periférico da seguinte forma no passo 1.4.4.
   5. Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma no passo 1.4.5.
   6. Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e periféricofluxo é 43:57 (Central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 43%, diminuir a quantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central. Se o fluxo central estiver abaixo de 43%, reduzir o comprimento de tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central.
   7. Repita o passo 2.5.1 a 2.5.6 até um rácio de segmentação das 43:57 (central: periférica) é alcançada.
   8. Definir a taxa de fluxo da bomba de fase móvel a 0,7 ml min ^-1.
   9. Defina a bomba de derivação a fluir a 0,1 ml min ^-1.
      Nota: A coluna RF configurado com reagente fluorescamine está agora pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado.
6. Pós-condições executar desligamento
   1. Uma vez que todas as amostras foram injetados, indicando que a execução foi concluída, desligue a bomba de derivação.
   2. Remova a linha da bomba de derivação a partir do porto periférica e rolha.
   3. Equilibrar a coluna com a fase móvel emque é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL ^min-1 durante 10 min.
   4. Pare o fluxo da bomba da fase móvel.
   5. Substitua o reagente fluorescamine com acetonitrilo e purgar a bomba de derivação.
      Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado.

3. Detecção de fenóis utilizando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio

1. Preparação da fase móvel
   1. Prepare 1 L de uma solução de acetato de amónio 100 mM, ajustando o pH da solução a 9,0 com hidróxido de amónio 5 M, antes da diluição para o volume.
   2. Adicionar 52,6 ml de metanol ao tampão de acetato de amónio para atingir uma fase móvel pré-misturada de 95: 5 (tampão: metanol).
2. Criação de instrumento HPLC
   1. Prepara-se o instrumento de HPLC com o tampão de pré-misturada preparada na linha A, tal como a fase móvel. Purgar a bomba de acordo com o fabricante "; S exigências.
   2. Defina-se os componentes instrumentais de HPLC e as duas bombas de reagentes adicionais, como ilustrado na Figura 4B.
   3. Anexar uma bobina amortecedor de pulsações para cada uma das bombas de reagentes.
   4. Ajuste o detector de UV-Vis a analisar num comprimento de onda de 500 nm.
3. Criação de coluna RF
   1. Ligue a entrada da coluna de RF para o instrumento de HPLC.
   2. Conectar um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros para a saída da porta central da coluna de RF.
   3. Conectar uma porta periférica saída da coluna de RF para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubo ID de 0,13 milímetros.
   4. Conectar cada reagente (isto é, 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio) A linha da bomba para uma porta periférica na saída da coluna de RF.
   5. Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% da linha A - 100 mM de tampão de acetato de amónio pH 9, pré-misturado com 5% de metanol.
   6. Equilibrar a coluna Wom a linha de uma fase móvel de 100% durante 10 min para um 4,6 mm Dl x 100 mm de comprimento da coluna. Este tempo pode ser dimensionado de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar.
4. Preparação do reagente de 4-aminoantipireno
   1. Preparar um tampão de acetato de amónio com um pH de 9 seguindo a etapa 3.1.1.
   2. Pesar 150 mg de 4-aminoantipireno e dissolve-se em 100 ml de tampão de acetato de amónio preparada (pH 9).
   3. Sonicar durante 1 min.
   4. Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
   5. Purgar a primeira bomba do reagente com o reagente 4-aminoantipireno preparado de acordo com as exigências do fabricante.
5. Preparação do reagente de ferricianeto de potássio
   1. Pesar 150 mg de ferricianeto de potássio e dissolve-se em 100 ml de tampão de acetato de amónio (pH 9) preparados como no passo 3.1.1.
   2. Sonicar durante 1 min.
   3. Cobrir em papel alumínio para evitar a exposição à luz.
   4. Purge a segunda bomba do reagente com o reagente de ferricianeto de potássio preparada de acordo com as exigências do fabricante.
6. Ajustamento de coluna RF
   1. Pesar dois recipientes limpos e secos. Rotular um navio como central eo outro como periférico.
   2. Recolher o efluente que sai do porto central para o recipiente rotulado central para 1,0 min.
   3. Re-pesar o recipiente central e calcular o peso do caudal da ligação central, como se segue no passo 1.4.3.
   4. Repita os passos 3.6.2 a 3.6.3 para o efluente que sai do UV-Vis que é conectada à porta periférica da coluna de RF e para calcular o peso periférico da seguinte forma no passo 1.4.4.
   5. Calcula-se a percentagem do fluxo proveniente das portas centrais e periféricas da seguinte forma no passo 1.4.5.
   6. Verifique se o rácio de segmentação entre o fluxo central e o fluxo periférico é 50:50 (central: periférica). Se o fluxo central estiver acima de 50%, diminuir oquantidade de fluxo que sai pela adição de um comprimento de tubagem ID de 0,13 milímetros ao centro da porta de saída. Se o fluxo central estiver abaixo de 50%, reduzir o comprimento de tubagem de 0,13 milímetros a partir do porto central.
   7. Repetir o passo 3.6.1 a 3.6.6, até uma proporção de 50:50 de segmentação (Central: periférica) é alcançado.
   8. Definir a taxa de fluxo da bomba de 4-aminoantipireno a 0,5 ml min ^-1.
   9. Definir a taxa de fluxo da bomba de ferricianeto de potássio a 0,25 ml min ^-1.
      Nota: A coluna RF configurado com os reagentes de dois componentes está agora pronto para análise. As amostras podem agora ser injectado.
7. Pós-condições executar desligamento
   1. Uma vez que todas as amostras foram injetados a corrida terminou, indicando que a execução foi concluída, pare de ambas as bombas dos reagentes.
   2. Remova as linhas de bomba de reagente a partir dos portos periféricos e substituí-los com um pedaço 15 cm de tubo 0,13 mm.
   3. Equilibrar a coluna com a fase móvel em WHICH é para ser armazenada, permitindo que a fase móvel, para passar através da coluna a 1 mL ^min-1 durante 10 min.
   4. Pare o fluxo da bomba de fase móvel de HPLC no instrumento.
   5. Substitua ambos os reagentes sobre o reagente bombas com metanol e purgar as bombas adicionais como por exigência do fabricante.
      Nota: O sistema HPLC agora pode ser desligado.

O primeiro método de PCD que foi adaptado para utilização por RF-CPD foi a derivatização de antioxidantes, utilizando o radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH ^{•) 24.} Esta reacção foi introduzido por Koleva et al. ^25, e tem sido amplamente utilizada desde então. A detecção se baseia na descoloração do radical DPPH ^• na presença de espécies de oxigénio reactivas, portanto, a presença de antioxidantes resulta numa queda na absorvância observada. O DPPH ^• reacção emprega frequentemente grandes laços de reacção de 500 uL ou superior ^13-15, no entanto, verificou-se que quando se utiliza a coluna de RF-CPD foi necessário nenhum circuito de reacção. A Figura 5 mostra dois cromatogramas de uma amostra de café Ristretto derivatizados utilizando o DPPH ^• radical usando tanto PCD convencional e RF-PCD instrumentação.

O segundo método de PCD, que foi adaptada para utilização por RF-PCD é o derivatization de quatro aminoácidos (glicina, leucina, fenilalanina e triptofano), utilizando fluorescamina como o reagente de derivatização ^23. O método foi adaptado do trabalho por Udenfriend et ai. ¹¹ com a composição de fase móvel, concentração e fluorescamina caudal fluorescamina optimizado para utilização com colunas de RF. O método convencional utilizado um sistema de derivatização de dois reagentes em que o pH 9,0 tampão foi adicionada à corrente de efluente antes da adição do reagente de fluorescamina, enquanto que o método de RF-PCD utilizada uma fase móvel que já foi tamponada, assim, apenas um único sistema de derivatização reagente era necessário. Para esta aplicação, o fluxo de derivatizado foi analisada a 390 nm utilizando um detector de UV-visível, o que corresponde ao comprimento de onda de excitação utilizado para detecção por fluorescência. O fluxo derivatizado pode ser detectada utilizando um detector de fluorescência, dando maior sinal para ruído e, por conseguinte, os limites inferiores de detecção e quantitation, de acordo com o trabalho de Udenfriend et al. ^11. Além disso, o eluente proveniente da porta central da configuração de RF-CPD foi monitorizada utilizando um segundo detector de UV-Visível.

O desempenho do método RF-PCD para a derivatização dos aminoácidos foi comparado com o método convencional de PCD. A Tabela 1 lista os limites calculados de quantificação e de detecção para cada um dos aminoácidos analisados ​​em ambos os modos convencionais de RF PCD-PCD e. O limite de detecção foi definido como sendo a concentração onde uma relação sinal-ruído de 2 foi obtida enquanto o limite de quantificação foi definida como sendo a concentração em que foi obtida uma relação sinal-ruído de 10. A Figura 6 mostra um cromatograma de quatro aminoácidos analisados ​​utilizando o método convencional de PCD, o método de RF-PCD e o fluxo não derivatizado a partir do método de RF-CPD. a Figura 7 é uma comparação dos sinais obtidos para a ervilhaKS devido a glicina e leucina utilizando tanto o método convencional de PCD e o método de RF-CPD. A Figura 8 compara a largura do pico do pico do triptofano na análise usando o método convencional de PCD, o método de RF-PCD e o fluxo não derivatizado da FR- método PCD.

O método PCD final que foi adaptado para utilização por RF-PCD ^26, é a derivatização de quatro fenóis (fenol, 4-metoxifenol, p-cresol e tocoferol). O método foi adaptado do trabalho por Grob Bigley e ²⁷ com pequenas modificações para optimizar o processo para uso com colunas de RF. Este trabalho utilizou uma reacção de derivatização de dois componentes em que as soluções de ambos 4-amionantiprine e ferricianeto de potássio foram adicionados ao eluente da coluna na montagem final da coluna de RF. Verificou-se que quando se usa uma coluna de RF para a reacção não há lacetes de reacção pós-coluna adicionais necessários para ser utilizado. A Figura 9 mostra um exemplo de um cromatograma ondeuma amostra de teste 21-componente que contém alguns componentes que apresentam uma resposta ao regime de derivatização e algumas que não foram separados, e detectados derivatizado (traço negro). A mesma mistura foi também separados e detectados não derivatizado para comparação (traço vermelho). Na Figura 9, a resposta de RF-CPD foi exibido como uma resposta negativa para facilitar a distinção visual (a resposta do detector obtido foi positivo). A Figura 10 mostra uma comparação da forma do pico de p-cresol tanto derivatizado utilizando a coluna e RF-PCD não derivado.

Figura 1. Cromatografia de sobreposição hexylbenzene injectada num sistema de HPLC com vários volumes mortos adicionados entre a coluna e o detector. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. cromatográfica sobreposição de tolueno, etilbenzeno e propilbenzeno injetado em um sistema HPLC com vários volumes mortos adicionados entre a coluna eo detector. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Ilustração do projeto coluna Fluxo de reação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Instrumental configurar de RF-PCD. (A) reagente único (ou seja, DPPH ^• ou reagentes de derivatização fluorescamine) e (B) reagente dupla (ou seja, 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio reagentes de derivatização). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Os cromatogramas da separação de café Ristretto com detecção após derivatização pós coluna utilizando o radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH ^•). A derivatização foi realizada utilizando uma coluna convencional com uma serpentina de reacção 500 ul de (A) e uma coluna de fluxo de reacção (B rong>). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. cromatográfica sobreposição de quatro aminoácidos (glicina (G), leucina (L), fenilalanina (P) e triptofano (T)) na gama de 10 a 1000 ppm detectado por derivatização pós coluna utilizando fluorescamina como um reagente depois de PCD separação por HPLC. Os cromatogramas são os seguintes: (A) PCD convencional, (B) RF-PCD, ea porta central (não derivado) a partir de RF-PCD (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7. A comparação dos sinais obtidos para a glicina (primeiro pico) e leucina (segundo pico) do PCD convencional (traço vermelho) e RF-PCD (traço preto). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Peak comparação largura do pico devido ao triptofano com base em (A) tempo de retenção e (B) o volume de pico. O traço preto mostra o método convencional PCD, o traço vermelho mostra o método RF-PCD eo traço verde mostra a fluxo não derivado da porta central do método de RF-PCD. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. resposta cromatográfica do p-cresol. O traço preto representa a resposta não derivado usando um detector de UV a 254 nm, enquanto o traço vermelho representa a resposta derivados (RF-PCD) a 500 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Tabela 1. Os limites de detecção e quantificação de quatro aminoácidos diferentes detectados por diferentes sistemas de pós-coluna de derivação utilizando fluorescamina como o reagente de derivatização após separação por HPLC.

RF-PCD permite a mistura eficiente do reagente de derivatização com o efluente pós-coluna de HPLC, sem a utilização de bobinas de reacção, minimizando os efeitos de alargamento de banda e melhorar o desempenho da separação. métodos de RF-PCD também mostraram melhorias na resposta de sinal em relação ao método de detecção. Camenzuli et al. ²⁸ foi o primeiro a reportar o uso de colunas de fluxo de reacção com DPPH ^• para a detecção de ROS em uma amostra de café espresso. O estudo envolveu a análise e otimização das condições de RF para atingir o desempenho máximo, testando uma variedade de DPPH ^• concentrações com vários DPPH ^• taxas de fluxo de reagente. Concluiu-se que uma concentração de DPPH ^• de 0,1 mg ^mL-1 com um caudal de DPPH ^• reagente de 0,5 ml min ^-1 foi óptima para um melhor desempenho de separação (isto é, eficiência e sensibilidade) sob RF-PCDas condições em comparação com o método convencional de PCD DPPH ^• derivatização. A Figura 5 mostra dois cromatogramas utilizando o ensaio de DPPH ^• de antioxidantes em uma amostra de café expresso. Especialmente interessantes são os picos de alta intensidade com tempos de retenção de aproximadamente 5 min. Pode ser visto que quando se utiliza uma malha de reacção de 500 ul, o que é típico de DPPH ^• métodos tradicionais de derivatização, um único pico largo pode ser observada. No entanto, quando o método de RF-PCD é utilizado sem a necessidade de um ciclo de reacção, torna-se claro que o único pico observado usando um loop de 500 ul é, de facto, dois picos. Além disso, detalhes adicionais podem ser observados após 5,5 min quando se utiliza a configuração de RF-PCD. Assim, para a análise de ROS em amostras usando DPPH ^•, a técnica de RF-PCD provou ser superior aos métodos convencionais de análise que utilizam ROS DPPH ^•.

RF-PCD comfluorescamina reagente foi utilizada para a análise de aminoácidos primárias e em comparação com as formas convencionais de CPD com fluorescamina ^20. Uma vez que a coluna de RF extremidade de encaixe também fornecida uma plataforma para a detecção multiplexado, o fluxo central não derivatizado foi monitorizada por meio de UV-Vis, enquanto a derivatização entre os efluentes e fluorescamina foi realizada na região exterior da extremidade de encaixe-RF e detectada através de UV Vis. Uma série de padrões de ensaio contendo quatro aminoácidos foram analisados ​​sob condições de RF-PCD multiplexados. A Figura 6 compara o perfil cromatográfico para o método convencional da PCD (Figura 6A) e RF-CPD (detecção de derivatizado (Figura 6B) e não derivatizado (Figura 6C)), da série de ácidos aminados. a Figura 7 é uma sobreposição de dois sinais de aminoácidos obtidos por meio de PCD convencional e RF-PCD. Pode ser visto que a separação observada mais eficiente devido ao tele remoção do loop de reacção levou a uma maior resposta de sinal, apesar do facto de nem todo o efluente da coluna foi derivatizado. Além disso, o regime mais eficiente mistura de reagente de derivatização resultou em menor ruído da linha de base, aumentando ainda mais a relação sinal-ruído. Este efeito é confirmado nos limites inferiores de detecção e quantificação calculado para o método de RF-PCD em comparação com o método de PCD convencional na Tabela 1. Esta tendência também pode ser visto na Figura 5, onde a resposta antioxidante para DPPH ^• é maior para o método de RF-PCD em comparação com o método convencional de PCD. Significativo pico deterioração pode ser observado nos cromatogramas onde uma configuração convencional CPD foi utilizado que leva à resposta de sinal inferior deste método.

Figura 8 compara o perfil do pico do triptofano, quando analisados ​​por RF-PCD (ambos os fluxos derivados e não derivados) e PCD convencional. Quando o perfil do pico é representada graficamente contra o tempo as larguras de pico todos parecem ser muito semelhantes (Figura 8A). As melhorias encontradas no RF-PCD em comparação com PCD convencional são óbvias quando o perfil do pico é representada em função do volume de pico (Figura 8B). Quando representados graficamente contra o volume de pico, é claro que, enquanto o pico de RF-PCD mostra uma pequena quantidade de degradação em comparação com o pico não derivatizado, a degradação, no entanto, é mínimo em comparação com o observado a partir do método convencional de PCD. As melhorias na eficiência de separação de RF-PCD em comparação com PCD convencional também são demonstradas na Figura 7, a qual compara as formas dos picos de glicina e leucina após derivatização por tanto convencional PCD e PCD-RF. Pode ver-se que, no modo convencional PCD os picos de glicina e leucina são mal linha de base foi separada enquanto que no modo de RF-PCD é o sinal na linha de base por um período muito mais longo entre os dois picos.

Avantagem adicional de RF-PCD em comparação com os métodos convencionais de PCD é a capacidade de monitorizar efluente não derivatizado a partir da porta central da coluna de RF permitindo a detecção multiplexado. Isto é possível porque o desenho do filtro poroso dentro da extremidade de encaixe RF não permitir que o fluxo na região central radial para misturar com o fluxo na região periférica da extremidade de encaixe, permitindo assim a monitorização da corrente derivada a partir da zona exterior da a montagem, bem como o monitoramento do fluxo não derivado da porta central. Esta capacidade é realçada pelos resultados obtidos para o triptofano na Tabela 1, que é conhecido por ter resposta de sinal pobre após derivatização por fluorescamina ^20, no entanto, ao contrário dos outros ácidos aminados que apresenta uma resposta de um detector de UV quando não derivatizado (a 280 nm) . Para ambos os sistemas de derivatização dos limites de detecção e de quantificação eram relativamente elevados, no entanto, os limites de detecção e de quantificação eram muito mais baixos para o tele não derivado de fluxo. Usando a capacidade de monitorar ambos os fluxos de efluentes derivatizadas e não derivados os parâmetros de detecção podem ser otimizados para dar o maior nível de desempenho para cada aminoácido.

O projeto de múltiplas do fim-encaixe RF permite a análise dupla reagente de derivatização. Selim et al., ²³ investigou o desempenho de dois reagentes (4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio) usando condições de RF-PCD para a análise de compostos fenólicos em comparação com a técnica convencional de CPD utilizando 4-aminoantipireno e ferricianeto de potássio. Este tipo de técnica PCD requer duas bombas e reação loops para cada reagente derivação em oposição a um anel de bomba ea reação de DPPH ^•. Vários compostos fenólicos e alquilbenzeno foram analisados ​​sob condições convencionais e RF PCD. Curiosamente, os compostos não fenólicos que não foram detectadas pelo método convencional eram de facto detectado under condições RF-PCD. A Figura 9 mostra a resposta cromatograf ica de UV-Vis e a resposta colorimétrica RF-PCD a uma mistura de teste padrão. RF-PCD fornecida uma técnica PCD simplificado em termos de instrumentação, sem compromisso de desempenho da separação, como observado na Figura 10. Figura 10 compara o perfil de pico de p-cresol, quando analisados ​​por RF-PCD e também sem derivação. Pode ser visto que a largura do pico do cromatograma de RF-PCD é muito semelhante ao do cromatograma não derivatizado. A principal diferença entre os dois cromatogramas é que o cromatograma de RF-PCD é ligeiramente mais larga na base. Isso mostra que há pouca ou nenhuma dispersão de pico devido à técnica de RF-PCD. Uma resposta similar foi observado na Figura 9, que mostra que é não só o pico p-cresol, que tem a largura de pico semelhante quando derivatizados por RF-PCD em comparação com o pico não derivatizado, mas todos os fenóis e alquillbenzenes que responderam ao esquema de derivação mostrou a mesma tendência. Embora, RF-PCD com a utilização de dois reagentes de derivatização obtido um desempenho de separação semelhante ao método não derivatização convencional, o FR-PCD permitido para a detecção selectiva de compostos fenólicos, um dos quais que não foi detectada sob condições de não-derivatizados .

Como RF-PCD é um desenvolvimento de métodos de HPLC-PCD convencionais, todas as ferramentas de afinação disponíveis em métodos gerais de HPLC, como composição da fase móvel e o caudal, o volume de injecção e análise de comprimento de onda são aplicáveis ​​a métodos de RF-PCD. Além disso, as ferramentas de afinação disponíveis em métodos de HPLC-PCD convencionais, tais como a fase móvel a razão da taxa de fluxo do reagente de PCD, bem como a composição reagente de CPD são aplicáveis ​​a métodos de RF-PCD. Uma ferramenta de ajuste adicional quando disponível usando RF-PCD que não está disponível nos métodos convencionais de PCD é a relação de fluxos provenientes da central e periféricoportas da coluna. Os fluxos são controlados através da alteração da pressão para trás em relação a cada uma das linhas por meio do controle do comprimento e / ou diâmetro interno do detector de pós (ou pós-coluna, se não está a ser detectado o fluxo proveniente da porta central) tubagem. A proporção óptima do centro de fluxos periféricos depende da reacção em questão, bem como outros factores, tais como, se a porta central está a ser detectado ou não. A razão de fluxo de 60% periférica e 40% central é muitas vezes um bom ponto de partida.

Tal como acontece com os parâmetros de ajuste, muitos dos problemas que podem surgir com a utilização da coluna de RF-PCD também são comuns com os métodos convencionais de PCD. Um parâmetro em particular que o cromatógrafo tem de estar ciente de ao realizar análises de RF-PCD é a estabilidade do fluxo e a pressão no sistema, nomeadamente a de a bomba (s) de reagente. Se o fluxo, em que o sistema não é estável, isto pode causar instabilidade da linha de base, portanto, diminuindo aa relação sinal-ruído e subsequentemente limites de quantificação e de detecção.

cromatografia de RF-CPD foi desenvolvido para ultrapassar as dificuldades na adaptação de reacções de PCD a colunas e sistemas de HPLC modernos. A principal vantagem de RF-PCD em comparação com os métodos convencionais de PCD é uma mistura mais eficiente devido ao facto de ter lugar dentro de uma frita no interior da montagem final da coluna de RF, e esta mistura é, a uma pressão ligeiramente mais elevada de volta. Isto permite a minimização ou mesmo eliminação dos grandes laços da reacção de volume que são usados ​​em muitos métodos convencionais de PCD. Com esta minimização do volume morto pós-coluna, as separações mais eficiente e com maior resolução cromatográfica pode ser realizada.

Modo de RF-PCD tem resultado em melhorias na eficiência de separação, formato de pico e sinal ao ruído em relação aos métodos convencionais de PCD. No entanto, é importante notar que as melhorias de sinal são dependentes detector. Por exemplo, os detectoresque amostra quantidade dependente não podem exibir um aumento na resposta de sinal de RF, sob condições-PCD em comparação com métodos convencionais. Isto é assim porque, sob métodos convencionais de 100% na coluna de amostra é detectada, onde, sob condições de RF-PCD apenas uma determinada percentagem da amostra na coluna é detectada dependendo da relação de segmentação. No entanto, é antecipado que as reacções de RF-PCD será capaz de ser adaptado a qualquer um ou dois reagentes (contanto que ambos os reagentes são adicionados ao mesmo tempo) reacção PCD com o mínimo de re-optimização e que os benefícios observados para todos os três reações até agora testado irá traduzir para todas as outras reações PCD.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.