Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con la colonna montante derivatizzazione (PCD) è un potente strumento che è utile a risolvere una serie di questioni nel laboratorio di analisi. Può essere usato per rilevare composti che sono altrimenti non rilevabili con la serie di rivelatori disponibili ^1,2, aumentare il segnale dell'analita bersaglio, che permette limiti inferiori di rivelazione e quantificazione ^3-5 o selettivamente derivatize un analita bersaglio per evitare effetti di matrice ^6. Reazioni PCD comunemente usati includono la reazione di ammine, come aminoacidi, con orto-phthaladehyde ^7-9, ninidrina ^9,10 o fluorescamina ^11,12, la derivatizzazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) con il 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicali (DPPH ^{•) 13,14} o 2,2'-Azino-bis (acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico (ABTS) ^15,16, e l'uso del reagente ioduro-azide per derivatize zolfo ccomposti ontaining ^17,18.

Vi sono, tuttavia, numerosi inconvenienti all'utilizzo di reazioni PCD con sistemi HPLC ^6. Principalmente fra questi è l'uso di bobine di reazione tra il punto di aggiunta del reagente di derivatizzazione (s) e il rilevatore, che consentono il tempo per la miscelazione e la reazione avvenga ^8. Questi reazione loop spesso hanno volumi di 500 ml o più, che è significativo rispetto al volume del resto del sistema HPLC ^19. L'uso di questi reazione alto volume passanti comporta un'accresciuta allargamento di picco rispetto a quello che sarebbe osservata senza la presenza del ciclo di reazione. Ciò si traduce in brevi picchi più ampi che hanno limiti superiori di quantificazione e rilevazione e negativamente effetti risoluzione cromatografica. Figure 1 e 2 evidenziare il deterioramento della forma del picco che risultano dalla somma dei vari postale colonna volumi ciclo di reazione. Questa analisiè stata eseguita con un cellulare composizione di fase di 94% metanolo e 6% di acqua Milli-Q. La portata della fase mobile era 1 ml / min, il volume di iniezione era di 20 microlitri e la lunghezza d'onda di analisi era 265 nm. Bobine di varia volumi morti da 20 ml a 1000 ml sono stati inseriti fra la colonna ed il rivelatore per simulare gli effetti di ciclo reazione volume morto nei metodi PCD. Questi cicli sono stati preparati da tubi di acciaio inossidabile di diametro interno 0,5 mm. L'esperimento è stato eseguito su un sistema HPLC costituito da un controllore (SCL-10AVP), una bassa pressione gradiente valvola (FCL-10ALVP), una pompa (LC-20AD), un iniettore (SIL-10ADVP), ed un rivelatore PDA ( SPD-M10ADVP). La fase mobile è stata pompata attraverso un sistema di degasaggio prima dell'introduzione nel sistema HPLC. La separazione è stata effettuata utilizzando un x 4.6 mm di diametro 5 micron colonna di 250 mm. Le condizioni sperimentali sono stati scelti per essere tipico delle reazioni PCD che sono stati recentemente pubblicati in letteratura.

Ilsemplice, più comune alberino configurazione reattore a colonna è definito un reattore tubolare non segmentato che è effettivamente un tubo lungo e sottile attraverso il quale il liquido può fluire e la reazione può avvenire. In questo picco sistema allargamento dipende non solo il volume morto aggiunto al sistema, ma anche il diametro interno del tubo, come evidenziato da Iijima et al. ^8. Inoltre, la geometria della bobina gioca un ruolo nella ampliamento marchio osservato. Stewart ²⁰ affermato che l'avvolgimento del reattore cambia i profili di flusso secondario, con conseguente migliore miscelazione, il che significa che il volume morto può essere minimizzato. E 'stato affermato che il picco allargamento non è significativo se si utilizza un tubolare aperto maglia della bobina ^21. Quando l'allargamento picco è troppo grande, altri tipi di reattore possono essere considerati ^20,22. Questi possono includere reattori a letto o reattori flusso segmentati. Questi reattori sono particolarmente utili per le reazioni lente che altrimenti require grande reazione loop. Come non segmentati reattori tubolari sono i tipi più comuni di reattori utilizzati in applicazioni PCD, il resto di questa voce con questo tipo di configurazione del reattore.

Il disegno della colonna flusso di reazione (RF) comprende un raccordo terminale multi-porta che permette fase mobile per uscire (o entrare) della colonna attraverso un singolo porto situato nella zona centrale radiale della colonna o tre porte situata al esterno regione di parete della colonna (vedi Figura 3). Questi due flussi sono separati usando un raccordo terminale contenente una fritta porosa centrale che è circondato da un anello impermeabile che è a sua volta circondato da un setto poroso esterna che si estende verso la parete della colonna. A causa del flusso anello trasversale impermeabile centrale non è possibile tra le due zone porose.

Durante reazione cromatografia flusso, il reagente di derivatizzazione (s) vengono pompati contro la direzione del flusso della fase mobile in uno o two delle porte esterne della colonna flusso di reazione. L'eluente colonna viene miscelato con il reagente di derivatizzazione (s) in fritta esterno e passa al rivelatore tramite una porta esterna libera. flusso di reazione può essere utilizzato sia per una derivatizzazione reattivo unico (1 porta per il reagente derivatizzazione, 1 porta per passare l'eluente della colonna al rivelatore e 1 porta bloccata) oppure un sistema di reagente doppio (2 porte per i reagenti di derivatizzazione e 1 porta ad passare l'eluente della colonna al rivelatore). Il flusso dal flusso centrale può essere utilizzato sia per rilevare eluente colonna underivatized, efficace rilevamento multiplexing ^23, o passato sprecato.

Un importante tecnica sintonizzazione che è disponibile quando si esegue RF-PCD cromatografia è il rapporto tra i flussi centrali e periferici. Il rapporto ottimale per ogni derivatizzazione dipende da una serie di fattori come se il flusso centrale sarà rilevato o passato a perdere. Pertanto una volta che il rapporto ottimale è stato determinato, Occorre garantire che il rapporto corretto flusso è ottenuta prima di essere eseguita ogni corsa.

Si è trovato che l'uso di una fritta di mescolare il flusso della colonna eluente ed il reagente derivatizzazione in RF-PCD risultati in miscelazione più efficiente rispetto alle tecniche di miscelazione tradizionali che impiegano tipicamente un raccordo a T di zero volume morto o volume morto partire W- pezzo per mescolare i due flussi. Ciò ha permesso l'uso di relativamente piccoli cicli di reazione, o addirittura l'eliminazione del ciclo di reazione del tutto. La riduzione dei risultati di reazione formato loop in picchi più rispetto ai metodi tradizionali di derivatizzazione post-colonna. Ciò significa che, nonostante il fatto che non tutti dell'eluente colonna viene derivatizzato, maggiore rapporto segnale rumore sono osservati e limiti quindi minori di rivelazione e quantificazione può essere raggiunto.

cromatografia flusso di reazione è stata sviluppata per superare le difficoltà con l'adattamento reazione PCDs alle moderne colonne HPLC e sistemi, in particolare la perdita di efficienza causata da banda ampliando causa di grande colonna montante volumi morti dovuti alla necessità di impiegare grandi volumi di reazione loop. I processi di miscelazione più efficienti in RF-PCD rispetto al PCD convenzionale significa che i volumi del ciclo di reazione più piccoli possono essere impiegati portando ad un aumento di efficienza di separazione osservata. Inoltre RF-PCD cromatografia mostra sia il segnale aumentata e diminuita rumore rispetto alle tecniche convenzionali PCD con conseguente limiti inferiori di rilevazione e quantificazione rispetto ai metodi convenzionali PCD. Un ulteriore vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è la capacità di monitorare il flusso underivatized che eluisce dalla porta centrale della colonna RF nonché il flusso derivatizzato che eluisce dalla regione periferica della colonna. RF-PCD è una relativamente nuova, ma promettente tecnica che consente di visualizzare molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali PCD.

Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC.

Attenzione: Si prega di fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell'uso (ad esempio, scheda di sicurezza per il metanolo). Garantire l'uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante la manipolazione di solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida eluente (HPLC). Garantire un uso appropriato di controlli tecnici di HPLC, analitica equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l'uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse).

Nota: Questo protocollo descrive 3 modi di flusso di reazione derivatizzazione post-colonna (RF-PCD) tecniche, ciascuna con un reagente diverso specifico per la natura di un composto chimico di interesse. Per l'analisi del ROS vai alla sezione "1. Rilevamento di ROS utilizzando DPPH ^•", per l'analisi delle ammine primarie vedere la sezione "2. Individuazione di ammine primarie con fluorescamina", e per l'analisi dei composti fenolici andare alla sezione "3 . rilevamento di fenoliusando 4 aminoantipyrene e ferricianuro di potassio ". Utilizzare acqua ultra-pura (ad esempio, acqua Milli-Q) in tutto.

Nota: Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC.

1. Rilevamento di ROS Utilizzando DPPH ^•

1. Messa a punto di strumenti HPLC
   1. Preparazione dello strumento HPLC con 100% di acqua sulla linea A e 100% metanolo sulla linea B come fase mobile. Eliminare le pompe secondo i requisiti del produttore.
   2. Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A.
   3. Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d'onda di 520 nm.
2. Messa a punto dicolonna RF
   1. Collegare l'ingresso della colonna RF allo strumento HPLC.
   2. Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF.
   3. Collegare un porto periferico di uscita al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubi id.
   4. Collegare il DPPH ^• linea di pompa ad una porta periferica sull'uscita della colonna RF.
   5. Bloccare la porta periferica inutilizzata sull'uscita della colonna RF con un tappo di colonna.
   6. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% linea B - 100% metanolo.
   7. Equilibrare la colonna con la fase mobile metanolo 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo deve essere scalata in base alle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.
3. Preparazione del DPPH ^• reagente
   1. Preparare una soluzione / ml 0,1 mg di DPPH ^• in metanolo.
   2. Sonicare il pallone contenente il DPPH ^• reagente per 10 min.
   3. Coprire il pallone in foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
   4. Spurgare la pompa DPPH ^• con il preparato DPPH ^• reagente secondo i requisiti del produttore.
4. Mettere a punto il uscita della colonna RF
   1. Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l'altro come periferica.
   2. Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min.
   3. Pesare nuovamente la nave porto centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue:
      Peso di Port centrale (g) = peso finale di Port Central Vessel (g) - peso iniziale di Port Central Vessel (g)
   4. Ripetere i punti 1.4.2 e 1.4.3 per l'effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per la nave porta periferica comesegue:
      Peso di porta periferica (g) = peso finale della porta periferica Vessel (g) - peso iniziale della porta periferica Vessel (g)
   5. Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue:
      % Port Centrale = Peso di Port centrale (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100
      % Porta periferica = Peso della porta periferica (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100
   6. Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 30:70 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore a 30%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all'uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è inferiore al 30% diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale.
   7. Ripetere il passaggio da 1.4.1 a 1.4.6 fino a un rapporto di segmentazione di 30:70 (centrale: periferica) è raggiunto.
   8. Impostare la portata del DPPH ^• Pompa reagente per 0,5 ml min ^-1.
      Nota: La colonna RF impostato con DPPH ^• reagente è ora pronto per l'analisi. I campioni possono ora essere iniettati.
5. Posta eseguire condizioni di arresto
   1. Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, fermare il flusso pompa derivatizzazione reagente.
   2. Rimuovere il DPPH ^• linea di pompa del reagente dalla porta periferiche e si chiude il porto.
   3. Equilibrare la colonna con la fase mobile in cui deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min ^-1 per 10 min.
   4. Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC.
   5. Sostituire il DPPH ^• reagente con metanolo e spurgare la pompa aggiuntiva.
      Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto.

2. Rilevamento di ammine primarie Uso flammina

1. Preparazione della fase mobile
   1. Preparare 1 L di una soluzione di acetato di ammonio 10 mM, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume.
   2. Aggiungere 52,6 ml di acetonitrile (ACN) al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95:05 (buffer: ACN).
2. Messa a punto di strumenti HPLC
   1. Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa secondo i requisiti del produttore.
   2. Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A.
   3. Fissare una bobina attenuatore di pulsazioni alla pompa derivatizzazione.
   4. Set-up rivelatore di fluorescenza (FLD) con lunghezza d'onda di eccitazione di 390 nm ed emissione lunghezza d'onda di 475 nm.
3. Messa a punto di colonna RF
   1. Collegare °e all'ingresso della colonna RF allo strumento HPLC.
   2. Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF.
   3. Collegare un porta periferica all'uscita della colonna RF al rivelatore FLD usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id.
   4. Collegare la linea pompa derivatizzazione ad una porta periferica sull'uscita della colonna RF.
   5. Bloccare la porta periferica inutilizzata sull'uscita della colonna RF con un tappo di colonna.
   6. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% linea A - 10 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% ACN.
   7. Equilibrare la colonna con la linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.
4. Preparazione del reagente fluorescamina
   1. Rendere 100 ml di 0,1 mg ml ^-1 fluorescamina reagente.
   2. ultrasuoni per 1 min.
   3. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
   4. Spurgare la pompa del reagente con il reagente fluorescamina preparato secondo i requisiti del produttore.
5. Mettere a punto il uscita della colonna RF
   1. Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l'altro come periferica.
   2. Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min.
   3. Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3.
   4. Ripetere i punti 2.5.2 a 2.5.3 per l'effluente uscire dal FLD che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4.
   5. Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5.
   6. Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e perifericaflusso è 43:57 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è sopra 43%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all'uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è sotto 43%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale.
   7. Ripetere il passaggio 2.5.1 a 2.5.6 fino a un rapporto di segmentazione di 43:57 (centrale: periferica) è raggiunto.
   8. Impostare la portata della pompa fase mobile a 0,7 ml min ^-1.
   9. Impostare la pompa derivatizzazione a scorrere a 0,1 ml min ^-1.
      Nota: La colonna RF impostato con il reagente fluorescamina è ora pronto per l'analisi. I campioni possono ora essere iniettati.
6. Posta eseguire condizioni di arresto
   1. Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, arrestare la pompa derivatizzazione.
   2. Rimuovere la riga pompa derivatizzazione dalla porta periferiche e tappo.
   3. Equilibrare la colonna con la fase mobile inquale deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min ^-1 per 10 min.
   4. Arrestare il flusso della pompa fase mobile.
   5. Sostituire il reagente fluorescamina con acetonitrile e spurgare la pompa derivatizzazione.
      Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto.

3. Rilevamento di fenoli con 4-Aminoantipyrene e Potassio ferricianuro

1. Preparazione della fase mobile
   1. Preparare 1 L di una soluzione di 100 mM di acetato di ammonio, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume.
   2. Aggiungere 52,6 ml di metanolo al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95: 5 (buffer: metanolo).
2. Messa a punto di strumenti HPLC
   1. Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa come da produttore '; S requisiti.
   2. Impostare i componenti strumentali HPLC e le due pompe reagenti supplementari come illustrato in Figura 4B.
   3. Attaccare una bobina attenuatore di pulsazioni a ciascuna delle pompe reagenti.
   4. Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d'onda di 500 nm.
3. Messa a punto di colonna RF
   1. Collegare l'ingresso della colonna RF allo strumento HPLC.
   2. Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF.
   3. Collegare un porta periferica all'uscita della colonna RF al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id.
   4. Collegare ciascun reagente (cioè, 4-aminoantipyrene e ferricianuro di potassio) linea di pompe a una porta periferica sull'uscita della colonna RF.
   5. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% linea A - 100 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% di metanolo.
   6. Equilibrare la colonna wesima linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.
4. Preparazione del reagente 4 aminoantipyrene
   1. Preparare un tampone di acetato di ammonio con un pH di 9, seguendo passo 3.1.1.
   2. Pesare 150 mg 4 aminoantipyrene e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio preparati (pH 9).
   3. Con ultrasuoni per 1 min.
   4. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
   5. Eliminare la prima pompa reagente con il preparato Reattivo 4 aminoantipyrene secondo i requisiti del produttore.
5. Preparazione di potassio reagente ferricianuro
   1. Pesare 150 mg di ferricianuro di potassio e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio (pH 9) preparati secondo passo 3.1.1.
   2. Con ultrasuoni per 1 min.
   3. Copertura in foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
   4. Purge la seconda pompa reagente con il preparato reagente ferricianuro di potassio secondo i requisiti del produttore.
6. Messa a punto di colonna RF
   1. Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l'altro come periferica.
   2. Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min.
   3. Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3.
   4. Ripetere i punti da 3.6.2 a 3.6.3 per l'effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4.
   5. Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5.
   6. Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 50:50 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore al 50%, diminuire laquantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id al porto centrale di uscita. Se il flusso centrale è inferiore al 50%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale.
   7. Ripetere il passaggio 3.6.1 a 3.6.6 fino a un rapporto di segmentazione di 50:50 (centrale: periferica) è raggiunto.
   8. Impostare la portata della pompa 4 aminoantipyrene a 0,5 ml min ^-1.
   9. Impostare la portata della pompa ferricianuro di potassio 0,25 ml min ^-1.
      Nota: La colonna RF istituito con i reagenti bicomponenti è ora pronto per l'analisi. I campioni possono ora essere iniettati.
7. Posta eseguire condizioni di arresto
   1. Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati corsa è terminata, indicando che la corsa è terminata, fermare entrambe le pompe reagenti.
   2. Rimuovere le linee della pompa del reagente dalle porte periferiche e sostituirli con un 15 centimetri pezzo di tubo 0,13 millimetri.
   3. Equilibrare la colonna con la fase mobile in WHIch esso deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min ^-1 per 10 min.
   4. Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC.
   5. Sostituire entrambi i reagenti sul reagente pompe con metanolo ed eliminare le pompe supplementari secondo il requisito del produttore.
      Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto.

Il primo metodo PCD che è stato adattato per l'utilizzo da RF-PCD era la derivatizzazione di antiossidanti utilizzando la 2,2-difenil-1-picrylhydrazil radicale (DPPH ^{•) 24.} Questa reazione è stato introdotto da Koleva et al. ²⁵ ed è stato ampiamente utilizzato fin. Il rilevamento si basa sulla decolorazione del DPPH ^• radicalico in presenza di specie reattive dell'ossigeno, quindi, la presenza di antiossidanti risultati in una goccia assorbanza osservata. La reazione DPPH ^• impiega spesso grandi anse di reazione di 500 microlitri o più ^13-15, ma è stato trovato che quando si usa la colonna RF-PCD è necessario alcun ciclo di reazione. La Figura 5 mostra due cromatogrammi di un campione di caffè Ristretto derivatizzati usando l' DPPH ^• radicale usando sia PCD convenzionale e la strumentazione RF-PCD.

Il secondo metodo PCD che è stata adattata per l'uso da RF-PCD è il derivatization di quattro aminoacidi (glicina, leucina, fenilalanina e triptofano) utilizzando fluorescamina come derivatizzazione reattivo ^23. Il metodo è stato adattato dal lavoro di Udenfriend et al. ¹¹ con la composizione cellulare di fase, la concentrazione fluorescamina e portata fluorescamina ottimizzato per l'utilizzo con le colonne RF. Il metodo convenzionale utilizzato un sistema derivatizzazione due reagenti in cui pH 9,0 tampone è stato aggiunto al flusso effluente prima dell'aggiunta del reagente fluorescamina, mentre il metodo RF-PCD utilizzato una fase mobile che è stato già tamponata, quindi solo un singolo sistema derivatizzazione reagente era necessario. Per questa applicazione, il flusso derivatizzato è stata analizzata a 390 nm utilizzando un rivelatore UV-Visibile, che corrisponde alla lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata per il rilevamento mediante fluorescenza. Il flusso derivatizzato potrebbe essere rilevato mediante rivelatore a fluorescenza, dando maggiore segnale al rumore e limita, pertanto inferiori di rilevazione e quantitazione, come per il lavoro di Udenfriend et al. ^11. Inoltre, l'eluente proveniente dalla porta centrale della configurazione RF-PCD è stata monitorata utilizzando un secondo rivelatore UV-Visibile.

Le prestazioni del metodo RF-PCD per la derivatizzazione di aminoacidi è stato confrontato con il tradizionale metodo di PCD. Tabella 1 elenca i limiti calcolati di quantificazione e rilevazione per ciascuno degli amminoacidi analizzati sia nella modalità PCD convenzionali RF-PCD e. Il limite di rilevazione è stata definita come la concentrazione di conseguimento di un rapporto segnale-rumore di 2 mentre il limite di quantificazione è stata definita come la concentrazione se è stato raggiunto un rapporto segnale-rumore di 10. Figura 6 mostra un cromatogramma dei quattro aminoacidi analizzati utilizzando il metodo PCD convenzionale, il metodo RF-PCD e il flusso underivatized dal metodo RF-PCD. la figura 7 è un confronto dei segnali ottenuti per il piselloks causa di glicina e leucina utilizzando sia il metodo PCD convenzionale e il metodo RF-PCD. Figura 8 confronta l'ampiezza di picco del picco triptofano nell'analisi utilizzando il metodo PCD convenzionale, il metodo RF-PCD e il flusso underivatized dal RF- metodo PCD.

Il metodo PCD finale che è stato adattato per l'uso da RF-PCD ²⁶ è la derivatizzazione di quattro fenoli (fenolo, 4-metossifenolo, p -cresol e tocoferolo). Il metodo è stato adattato da lavoro Bigley e Grob ²⁷ con lievi modifiche per ottimizzare il metodo di utilizzo con colonne RF. Questo lavoro utilizzata una reazione di derivatizzazione bicomponente in cui sono state aggiunte le soluzioni sia di 4 amionantiprine e potassio ferricianuro al eluente colonna al raccordo terminale della colonna RF. Si è riscontrato che quando si usa una colonna RF per la reazione nessun cicli di reazione post-colonna aggiuntivi necessari per essere usati. La Figura 9 mostra un esempio di un cromatogramma in cuiun campione 21-componente che conteneva alcuni componenti che mostrano una risposta al regime derivatizzazione e alcuni che non sono stati separati, derivatizzato e rilevato (traccia nera). La stessa miscela viene anche separato e rilevato underivatized di confronto (traccia rossa). In figura 9 la risposta RF-PCD è stata mostrata come una risposta negativa per una più facile distinzione visiva (risposta del rivelatore ottenuta era positiva). La Figura 10 mostra un confronto tra la forma del picco di p -cresol sia derivatizzato utilizzando la colonna RF-PCD e underivatized.

Figura 1. cromatografica sovrapposizione di hexylbenzene iniettato in un sistema HPLC con diversi volumi morti aggiunti fra la colonna ed il rivelatore. Favore clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. cromatografica sovrapposizione di toluene, etilbenzene e propilbenzene iniettato in un sistema HPLC con vari volumi morti aggiunti tra la colonna e il rilevatore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Illustrazione del disegno della colonna di reazione di flusso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. strumentale messa a punto di RF-PCD. (A) singolo reagente (cioè, DPPH ^• o reagenti di derivatizzazione fluorescamina) e (B) doppio reagente (cioè, a 4 aminoantipyrene e ferricianuro di potassio reagenti di derivatizzazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. cromatogrammi della separazione di caffè Ristretto con rilevamento dopo derivatizzazione post-colonna usando l'2,2-difenil-1-picrylhydrazil radicale (DPPH ^•). La derivatizzazione è stata effettuata utilizzando una colonna convenzionale con una bobina di reazione microlitri 500 (A) e una colonna flusso di reazione (B rong>). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. cromatografica sovrapposizione di quattro amminoacidi (glicina (G), leucina (L), fenilalanina (P) e triptofano (T)) sulla gamma di 10 a 1.000 ppm rilevata dalla colonna posta derivatizzazione con fluorescamina come reagente PCD dopo separazione mediante HPLC. I cromatogrammi sono i seguenti: (A) PCD convenzionale, (B) RF-PCD, e (C) porta centrale (underivatized) da RF-PCD. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7. Il confronto dei segnali ottenuti per glicina (primo picco) e leucina (seconda punta) da PCD convenzionale (traccia rossa) e RF-PCD (traccia nera). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Peak confronto larghezza del picco dovuto al triptofano base di (A) e tempo di ritenzione (B) volume di picco. La traccia nera mostra il metodo convenzionale PCD, la traccia rossa mostra il metodo RF-PCD e la traccia verde indica la flusso underivatized dal porto centrale del metodo di RF-PCD. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10. risposta cromatografica di p -cresol. La traccia nera rappresenta la risposta underivatized utilizzando un rivelatore UV a 254 nm, mentre la traccia rossa rappresenta la risposta derivatizzato (RF-PCD) a 500 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.

Tabella 1. Limiti di rilevazione e quantificazione dei quattro diversi amminoacidi rilevati da diversi sistemi post-colonna derivatizzazione con fluorescamina come reagente derivatizzazione dopo separazione mediante HPLC.

RF-PCD consente la miscelazione efficiente del reagente derivatizzazione con l'effluente post-colonna HPLC senza l'uso di bobine di reazione, minimizzando gli effetti di banda allargamento e migliorando le prestazioni di separazione. Metodi RF-PCD hanno anche mostrato miglioramenti nella risposta del segnale rispetto al metodo di rilevazione. Camenzuli et al. ²⁸ è stato il primo a segnalare l'uso di colonne di flusso di reazione con DPPH ^• per la rilevazione di ROS in un campione di caffè espresso. Il loro studio ha coinvolto l'analisi e l'ottimizzazione delle condizioni RF per ottenere il massimo delle prestazioni, test di una serie di DPPH ^• concentrazioni con vari DPPH ^• portate dei reagenti. Si è concluso che un DPPH ^• concentrazione di 0,1 mg ml ^-1 con DPPH ^• portata del reagente di 0,5 ml min ^-1 era ottimale per una performance migliore di separazione (ad esempio, l'efficienza e la sensibilità) sotto RF-PCDcondizioni rispetto al metodo convenzionale di PCD DPPH ^• derivatizzazione. La Figura 5 mostra due cromatogrammi che utilizzano il DPPH ^• dosaggio di antiossidanti in un campione di caffè espresso. Particolarmente interessanti sono i picchi di alta intensità con tempi di ritenzione di circa 5 min. Si può notare che quando si usa un anello di reazione 500 microlitri, tipica dei tradizionali DPPH ^• metodi di derivatizzazione, una singola, picco ampio può essere osservato. Tuttavia, quando il metodo RF-PCD viene utilizzato senza la necessità di un ciclo di reazione, diventa chiaro che l'unico picco osservato utilizzando un ciclo di 500 microlitri è infatti due picchi. Inoltre, ulteriori dettagli si può vedere dopo 5,5 minuti quando si utilizza la messa a punto RF-PCD. Così, per l'analisi di ROS in campioni usando DPPH ^•, la tecnica di RF-PCD dimostrato di essere superiore ai metodi convenzionali di analisi ROS utilizzando DPPH ^•.

RF-PCD conreagente fluorescamina è stato utilizzato per l'analisi di acidi amminici primari e rispetto alle forme convenzionali di PCD con fluorescamina ^20. Poiché la colonna RF end-montaggio anche fornito una piattaforma per il rilevamento multiplato, il flusso centrale underivatized è stata monitorata tramite UV-Vis, mentre la derivatizzazione tra dell'effluente e fluorescamina stata intrapresa nella regione esterna dell'estremità raccordo RF e rilevata tramite UV Vis. Una serie di test standard contenente quattro aminoacidi sono stati analizzati in condizioni RF-PCD multiplex. Figura 6 confronta il profilo cromatografico per il metodo convenzionale di PCD (figura 6A) e RF-PCD (rilevamento di derivatizzato (figura 6B) e underivatized (Figura 6C)) della serie di amminoacidi. la Figura 7 è una sovrapposizione dei due segnali amminoacidi ottenuti attraverso PCD convenzionale e RF-PCD. Si può vedere che il più efficiente separazione osservata causa tegli rimozione dell'anello di reazione ha portato ad una maggiore risposta al segnale, nonostante il fatto che non tutti dell'effluente della colonna è stato derivatizzato. Inoltre, il regime di miscelazione derivatizzazione reagente più efficiente provocato rumore di fondo inferiore, aumentando ulteriormente il rapporto segnale-rumore. Questo effetto è confermata nei limiti inferiori di rivelazione e quantificazione calcolato per il metodo RF-PCD rispetto al metodo PCD convenzionale nella Tabella 1. Questa tendenza è visibile anche in figura 5 in cui la risposta antiossidante a DPPH ^• è maggiore per la metodo RF-PCD rispetto al metodo convenzionale PCD. Significativo picco alterazioni palesi nei cromatogrammi in cui una configurazione convenzionale PCD stato usato che porta alla risposta del segnale inferiore di questo metodo.

Figura 8 a confronto il profilo del picco del triptofano, quando analizzato da RF-PCD (entrambi i flussi derivatizzati e underivatized) e PCD convenzionale. Quando il profilo picco è rilevata in tempo le larghezze del picco tutti sembrano essere sostanzialmente simile (Figura 8A). I miglioramenti si trovano in RF-PCD rispetto alla CPS convenzionale sono evidenti quando il profilo di picco è tracciata contro picco di volume (Figura 8B). Quando in funzione del volume di picco, è chiaro che mentre il picco RF-PCD mostra una piccola quantità di degradazione rispetto al picco underivatized, la degradazione, tuttavia, è minimo rispetto a quello osservato dal metodo PCD convenzionale. I miglioramenti in termini di efficienza di separazione di RF-PCD rispetto alla CPS convenzionale sono dimostrati anche in figura 7, che mette a confronto le forme dei picchi di glicina e leucina dopo derivatizzazione sia da PCD convenzionale e RF-PCD. Si può notare che in modalità PCD convenzionale picchi glicina e leucina sono appena basale separato in modalità RF-PCD il segnale è al basale per un periodo molto più lungo tra i due picchi.

Unulteriore vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è la capacità di monitorare effluenti underivatized dal porto centrale della colonna RF abilitazione rilevamento multiplexati. Questo è possibile in quanto il disegno della fritta all'interno del raccordo terminale RF non permette il flusso nella regione centrale radiale per mescolare con il flusso nella regione periferica del raccordo terminale, consentendo il monitoraggio del flusso derivatizzato dalla regione esterna il raccordo e monitoraggio del flusso underivatized dalla porta centrale. Questa capacità è evidenziato dai risultati ottenuti per triptofano in Tabella 1, che è noto per avere risposta del segnale scarsa dopo derivatizzazione da fluorescamina ^20, tuttavia, a differenza degli altri aminoacidi mostra una risposta ad un rivelatore UV quando underivatized (a 280 nm) . Per entrambi i sistemi di derivatizzazione i limiti di rilevamento e la quantificazione erano relativamente alta, tuttavia i limiti di rilevamento e la quantificazione erano molto più bassa per tegli underivatized flusso. Utilizzando la capacità di monitorare entrambi i flussi di effluenti derivatizzati e underivatized i parametri di rilevamento possono essere ottimizzati per dare il massimo livello di prestazioni per ogni amminoacido.

Il design multiporta della RF di fine raccordo permette di doppia analisi derivatizzazione reagente. Selim et al. ²³ esaminato le prestazioni di due reagenti (4-aminoantipyrene e ferricianuro di potassio) utilizzando condizioni RF-PCD per l'analisi di composti fenolici rispetto alla tecnica convenzionale di PCD con 4 aminoantipyrene e ferricianuro di potassio. Questo tipo di tecnica PCD richiede due pompe e reazione cicli per ogni reagente derivatizzazione al contrario di un loop pompa e di reazione per DPPH ^•. Vari fenolici e alchilbenzene composti sono stati analizzati in condizioni convenzionali e RF PCD. È interessante notare, composti non fenolici che non sono stati rilevati con il metodo convenzionale erano infatti rilevato under condizioni RF-PCD. Figura 9 mostra la risposta cromatografica UV-Vis e la risposta colorimetrica RF-PCD ad una combinazione di test standard. RF-PCD ha fornito una tecnica PCD semplificato in termini di strumentazione, senza compromessi di prestazioni di separazione come osservato in Figura 10. Figura 10 confronta il profilo di picco di p -cresol quando analizzato da RF-PCD e anche senza derivatizzazione. Si può vedere che la larghezza del picco sul cromatogramma RF-PCD è molto simile a quella del cromatogramma underivatized. La principale differenza tra i due cromatogrammi è che il cromatogramma RF-PCD è leggermente più largo alla base. Questo dimostra che non vi è poca o nessuna dispersione del picco dovuto alla tecnica RF-PCD. Una risposta simile è stato osservato in figura 9 che mostra che non è solo il picco -cresol p che ha simile ampiezza del picco quando derivatizzato da RF-PCD rispetto al suo picco underivatized, ma tutti i fenoli e alkylbenzenes che hanno risposto allo schema derivatizzazione hanno mostrato la stessa tendenza. Sebbene, RF-PCD con l'uso di due reagenti di derivatizzazione ottenuto un rendimento di separazione simile al metodo non derivatizzazione convenzionale, RF-PCD permesso la determinazione selettiva di composti fenolici, uno dei quali non è stata rilevata in condizioni non derivatizzati .

Come RF-PCD è uno sviluppo di metodi HPLC-PCD convenzionali, tutti gli strumenti di ottimizzazione disponibili in metodi generali HPLC come la composizione della fase mobile e portata, volume di iniezione e l'analisi di lunghezza d'onda sono applicabili ai metodi RF-PCD. Inoltre, gli strumenti di ottimizzazione disponibili metodi HPLC-PCD convenzionali, come la fase mobile a rate ratio PCD flusso di reagente e la composizione reagente PCD sono applicabili ai metodi RF-PCD. Uno strumento di regolazione aggiuntiva disponibile usando RF-PCD che non è disponibile in metodi convenzionali PCD è il rapporto tra flussi provenienti dalla centrale e perifericoporti della colonna. I flussi sono controllati modificando la contropressione relativa su ciascuna delle linee controllando la lunghezza e / o diametro interno del rivelatore posto (o posta colonna se non viene rilevato il flusso proveniente dal porto centrale) tubazione. Il rapporto ottimale della centrale per flussi periferici dipende dalla reazione in questione, nonché altri fattori, come ad esempio, se la porta centrale viene rilevato oppure no. Un rapporto di flusso di 60% periferico e il 40% centrale è spesso un buon punto di partenza.

Come con i parametri di regolazione, molti dei problemi che possono sorgere con l'uso della colonna RF-PCD sono comuni anche con metodi convenzionali PCD. Un parametro particolare che il chromatographer deve essere consapevole di quando eseguire analisi RF-PCD è la stabilità del flusso e della pressione nel sistema, in particolare quello della pompa del reagente (s). Se il flusso nel sistema non è stabile, può causare instabilità basale quindi diminuendo larapporto segnale-rumore e successivamente limiti di quantificazione e rilevazione.

RF-PCD cromatografia è stato sviluppato per superare le difficoltà di adattamento reazioni PCD moderne colonne e sistemi HPLC. Il principale vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è più efficiente miscelazione dovuto esso che avviene all'interno di una fritta nel raccordo fine della colonna RF, e questo miscelazione è ad una pressione leggermente superiore indietro. Questo permette di ridurre al minimo o addirittura eliminare le grandi anse di reazione di volume che sono utilizzati in molti metodi PCD convenzionali. Con questa riduzione al minimo di post-colonna volume morto, separazioni più efficienti con maggiore risoluzione cromatografica possono essere eseguite.

modalità RF-PCD ha portato a miglioramenti in efficienza di separazione, forma del picco e il segnale al rumore rispetto ai metodi convenzionali PCD. Tuttavia, è importante notare che i miglioramenti segnale sono rilevatore dipendenti. Ad esempio rilevatoritale quantità di campione dipendente non può presentare un aumento della risposta del segnale in condizioni RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali. Questo è così perché sotto metodi convenzionali viene rilevato il 100% di sulla colonna di esempio, se in condizioni RF-PCD solo una certa percentuale del campione sulla colonna viene rilevato in funzione del rapporto di segmentazione. È tuttavia previsto che le reazioni RF-PCD potranno essere adattati a qualsiasi uno o due reagenti (purché entrambi i reagenti vengono aggiunti contemporaneamente) reazione PCD con il minimo ri-ottimizzazione e che i benefici osservati per tutti e tre Le reazioni finora testati si tradurrà a tutte le altre reazioni PCD.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.