Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Tolerância imunológica durante a gravidez requer que o sistema imunológico da mãe sofre alterações distintas, a fim de aceitar e nutrir o feto em desenvolvimento. Essa tolerância é iniciada durante o coito, estabelecida durante a fecundação e implantação, e mantida durante toda a gravidez. Mediadores celulares e moleculares activas de tolerância materno-fetal são enriquecidas no local de contacto entre os tecidos fetal e materno, conhecida como a interface materno-fetal, o que inclui a placenta e o útero e tecidos deciduais. Esta interface é composto de células do estroma e os leucócitos que se infiltram, e as suas características fenotípicas e abundância alterar no decorrer da gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal incluem neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células mastro, células T, células B, células NK, células NKT e que em conjunto, criam o micro-ambiente local que sustenta a gravidez. Um desequilíbrio entre essas células ou qualquer inappropriate alteração nos seus fenótipos é considerado um mecanismo de doença na gravidez. Portanto, o estudo de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial, a fim de elucidar os mecanismos imunológicos que levam a complicações relacionadas com a gravidez. Descreve-se aqui um protocolo que utiliza uma combinação de dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta com um cocktail enzimática proteolítica e colagenolítica para isolar os leucócitos que se infiltram nos tecidos de murino na interface materno-fetal. Este protocolo permite o isolamento de um elevado número de leucócitos viáveis ​​(> 70%) com propriedades antigénicas e funcionais suficientemente conservadas. Os leucócitos isolados podem então ser analisados ​​por várias técnicas, incluindo imunofenotipagem, separação de células, imagiologia, immunoblotting, a expressão do mRNA, cultura de células, e em ensaios funcionais in vitro tais como reacções de leucócitos mistos, proliferação ou ensaios de citotoxicidade.

Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico ^semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) ^2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna ^3; Contudo, o feto não seja rejeitada ^4,5. Este enigma não é totalmente compreendido.

A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação ^6,7 e mantido para manter uma gravidez completa ^8-10. A repartição deste tolerância materno-fetal é considerado um mecanismo de doença durante os estágios precoces e tardios da gravidez ^10-16. Tolerância materno-fetal envolve a participação de várias sub-populações de leucócitos, incluindo células T (células T reguladoras, células Th1, as células Th2 e células Th17), macrophages, neutrófilos, células mastro, células NK e células NKT, células dendríticas e células B, que a mudança em densidade e localização ao longo da gravidez ^15,17-19. Tolerância materno-fetal é enriquecido na interface materno-fetal ²⁰ - o local anatómico em que o sistema imune da mãe interage com os antigénios fetais ^20,21.

A interface materno-fetal é criado durante a placentação quando as células dos trofoblastos fetais extravilosas invadir a mucosa uterina ^22-24. No lado fetal desta interface, as membranas que envolvem o feto criar uma superfície epitelial especializado dentro da placenta, e as células de trofoblasto controlar a troca de nutrientes através do seu contacto directo com o sangue materno ^22. No lado materno da interface, a decídua recruta uma piscina heterogénea de leucócitos nos ratinhos que respondem por 30% a 50% de todas as células deciduais. Além de sua participação na Materntolerância imunológica al, estas células são principais contribuintes para diferentes processos durante a gravidez, por exemplo., a proteção do trato reprodutivo de infecções, fecundação, implantação do embrião ^7,25, angiogênese decidual ^26, remodelação vascular ^24,27, a invasão do trofoblasto ^28, placentária desenvolvimento ^24,25, e, em última análise, o trabalho de parto ^15,17. Por conseguinte, o estudo dos leucócitos envolvidas na tolerância materno-fetal é essencial para a elucidação da patogénese de complicações relacionadas com a gravidez.

Embora a utilização de imuno-histoquímica e imunofluorescência gerou dados para a visualização directa e localização de uterina, decidual, ou leucócitos da placenta ^29,30, análise de citometria de fluxo revelou mais subconjuntos específicos de leucócitos em cada um destes tecidos ^31,32. Além disso, citometria de fluxo foi utilizada para determinar a densidade e a proporção de maternal-fetal interface de leucócitos ³³ e expressão níveis de proteínas extracelulares e intracelulares ^8-10,34. Análise citométrica de fluxo de leucócitos na interface materno-fetal requer uma suspensão de célula única. A fim de isolar leucócitos infiltrantes do decidual, útero, placenta e tecidos, dois métodos de dissociação de tecidos têm sido usados: mecânica e enzimática. Os dois métodos permitem a separação de leucócitos infiltrados a partir da matriz extracelular (ECM) desses tecidos. Dissociação enzimática tecido é superior à dissociação mecânica do tecido, uma vez que permite uma maior produção de leucócitos associada com danos-cisalhamento-força inferior a ^35. Consequentemente, a dissociação do tecido mecânico exige a agregação tecidos ^36, que podem aumentar a variabilidade ea heterogeneidade das amostras. No entanto, a dissociação mecânica pode ser a escolha quando o antigénio de interesse pode ser alterada por dissociação enzimática ou quando a funcionalidade da célulaS de interesse devem ser preservados (por exemplo., a citotoxicidade de células NK) ^35.

O uso da proteólise com enzimas específicas para degradar a ECM elimina os rendimentos baixos observados com dissociação mecânica. Vários estudos têm relatado o uso de tripsina ^32, colagenase ^37, DNase ^31, Dispase ^38, e cocktails comerciais de várias enzimas ^32,39. No entanto, a natureza e concentração de enzimas diferentes e a duração da digestão deve ser cuidadosamente definida e validada, a fim de garantir a manutenção da integridade dos epitopos antigénicos de superfície celular necessárias para a imunofenotipagem. As várias estruturas de superfície são diferencialmente sensíveis à destruição por enzimas diferentes, com algumas enzimas, como a tripsina, sendo notório para a decapagem de epitopos de superfície de leucócitos reconhecidos por muitos anticorpos monoclonais.

Aqui introduzido é um método que utiliza um proteolytic e coquetel enzimático colagenolítica, chamado Accutase. Esta solução enzimática é suficientemente suave enquanto ainda eficaz na distinção entre tecidos murinos na interface materno-fetal, e não requer a adição de outros reagentes ou soro de dissociação para terminar a reacção de dissociação. Além disso, ela está pronta para uso imediato e, embora o tempo de dissociação deve ser validado, é mais robusta do que as enzimas acima mencionadas ^40,41.

A utilização de uma combinação de ambos os tipos de desagregação do tecido melhora a qualidade e quantidade de células obtidas; assim, vários estudos têm implementado o uso combinado de dissociação mecânica e enzimática com resultados satisfatórios ^31,32,37. O protocolo aqui descrito foi estabelecido e validado no nosso laboratório; utiliza uma combinação de uma dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta. Este protocolo permite o estudo de isolamento e mais deos leucócitos que se infiltram nos tecidos murinos na interface materno-fetal (útero, decidua, e placenta). O protocolo seguinte também mantém a integridade dos marcadores da superfície das células e rendimentos de células viáveis ​​suficientes para aplicações a jusante, como demonstrado por análise de citometria de fluxo. Finalmente, este protocolo mantém a consistência da preparação de células para análise e comparação dos diferentes tecidos de murino que compõem a interface materno-fetal.

Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética animal deve ser dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local e os institucionais Review Boards. Ao trabalhar com sangue animal, células ou agentes perigosos, como mencionado neste protocolo, as ações de biossegurança e segurança laboratoriais adequadas devem ser seguidas.

1. Rato Manuseio e Recolha de Tecidos

1. Prepara-se uma estação de trabalho estéreis e obter ferramentas estéreis para a recolha de tecido. Essas ferramentas incluem tesouras grandes e pequenas cirúrgicas, fórceps, e pinças de ponta fina. Incluem pequenas placas de Petri marcadas com os nomes apropriados de tecidos, cheio com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) (3-5 ml) equilibrada à temperatura ambiente (20-22 ° C). Também incluem uma grande placa de Petri, não marcado, encheu-se com solução de PBS 1x (10 - 15 mL).
2. Eutanásia um ratinho grávida (10,5-19,0 ​​dias pós-coitum (DPC) ou antes da entrega) utilizando dióxido de carbono (CO ₂). Para garantir que o rato é sacrificado, use a técnica de deslocamento cervical.
   Nota: Antes de 10,5 dpc, é difícil separar manualmente os tecidos deciduais dos tecidos uterinos. Se o isolamento de leucócitos deciduais não é necessária, a partir de leucócitos nos tecidos uterinos dos ratos não grávidas ou aqueles de ratinhos a <10,5 dpc pode também ser realizada seguindo este protocolo.
3. Utilizando um par de tesouras cirúrgicas esterilizadas, remover completamente a porção abdominal inferior da pele e do tecido muscular. Com uma pinça, afastar todos os outros órgãos até o útero e os ovários são visíveis. Com o útero ainda ligado, utilizar a pinça para se mover para fora da cavidade peritoneal (Figura 1A).
4. Localize os ovários distais à junção oviduto e uterotubal de cada corno uterino. Usando as pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na junção uterotubal e separar os cornos uterinos do mesentério contendo os vasos uterinos; então,consumos específicos no colo do útero para separar os cornos uterinos da cavidade peritoneal (Figura 1B).
5. Com pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão entre o colo do útero e o segmento inferior dos cornos uterinos. Deixar ligada uma porção do colo do útero durante este processo (Figura 1C) para evitar a abertura do corno uterino.
6. Mergulhar os cornos uterinos (incluindo colo do útero) num grande prato de Petri cheio com solução de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar os locais de implantação.
7. Enquanto ainda imersos em solução de PBS 1x, aparar qualquer gordura dos cornos uterinos com as pequenas tesouras cirúrgicas. Manter os tecidos imersos em solução de PBS 1x toda a dissecção.
8. Segurando os cornos uterinos no lugar com a pinça, retire um dos locais de implantação do útero com um corte transversal através da região inter-implantação, utilizando as pequenas tesouras cirúrgicas (Figura 1D). O local da implantação contém o feto, rodeado pelamembrana corioalant�ca, e uterina, decidual, e os tecidos placentários.
9. Usando fórceps, segure o local no lugar e fazer uma pequena incisão na parede uterina adjacente à placenta e tecidos deciduais (Figura 1E). Guarnição em torno do perímetro da placenta / decídua até que estas se separar tanto a parede uterina e da membrana corioalantóica que inclui o feto (Figura 1F).
10. Remover a placenta e tecidos deciduais ligados e coloque em solução PBS 1x (3-5 ml; veja o passo 1.12).
11. Inserir o feto rodeado pela membrana corioalantóica ligado aos tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). A hidratação destes tecidos vai facilitar a separação da membrana corioalantóica da parede uterina (ver passo 1.14).
12. Usando um par de pinças de ponta fina, delicadamente descascar o tecido decidual (camada branca-acinzentada) a partir da superfície placentária. Execute estapasso com cuidado para manter a integridade da placenta e tecidos deciduais (Figura 1G).
13. Coloque a placenta e tecidos deciduais em duas placas de Petri marcadas separadamente cheios com uma solução de PBS 1x (3-5 mL de cada).
14. Remova cuidadosamente a parede uterina da membrana corioalant�ca com uma pinça de ponta fina. Estes são os tecidos uterinos.
15. Colocar os tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL).
16. Repita os passos 1.8 a 1.15 até que todos os locais de implantação foram processadas.
17. Recolha diversos uterino, decidual, e tecidos da placenta para melhorar o rendimento das células durante a digestão enzimática. A quantidade de tecidos depende do tamanho da ninhada; no entanto, o isolamento de leucócitos requer> 2 peças de tecido.
    Nota: Para informações mais detalhadas sobre a dissecação dos locais de implantação em diferentes dias gestacionais, visualizar as imagens encontradas no capítulo dois do Guia para investigatiem ⁴² de rato Gravidez.

2. uterina, Decidual, e Placentário dissociação Tissue

1. Rotular vários estéreis 2 ml tubos cónicos com o nome do tecido adequado, e colocar num frasco com 1000 ml de solução enzimática em gelo.
2. A partir da placa de Petri com solução de PBS 1x, transferem dois pedaços (100-150 mg) de uterina, decidual, ou tecidos da placenta para um tubo de 2 ml rotulados cónica.
3. Adicione 500 ml de solução enzimática frio em cada 2 ml tubo cônico.
4. Com uma tesoura fina estéreis, começam a dissociar o tecido imerso na solução enzimática até que seja finamente picados. Ao longo do tempo, a suspensão irá desenvolver uma aparência leitosa. Este passo não deve ser superior a mais de 2 minutos para evitar o excesso de manipulação da amostra.
5. Uma vez que o tecido foi dissociado, adicionar um extra de 500 mL de solução enzimática frio para a 2 ml tubo cônico.
6. Colocar o tubo cónico de 2 ml em gelo.
7. Repita os passos 2.2 a 2.6 com todos os tecidos até que todos os tecidos foram processados.
8. Transferir todos os 2 ml de tubos cónicos com tecido homogeneizado (tecido moído + solução enzimática) amostras do gelo em uma incubadora a 37 ° C e realizar uma agitao orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Certifique-se de que a temperatura da incubadora é estabilizado antes do início do tempo de incubação.
9. Após a incubação, remove os 2 ml de tubos cónicos com tecidos dissociada da incubadora e colocá-los em gelo para evitar mais digestão.
10. Rotular estéreis de 50 ml tubos cônicos de acordo com o tipo de tecido. Retire as tampas e substituí-los com um filtro de células estéril (100 tamanho de poro).
11. Pour os tecidos dissociados do 2 ml de tubos cónicos de células através do filtro, utilizando ~ 20 ml de solução de PBS 1x. Os fragmentos de tecido permanece no filtro de células e a suspensão de células passarão através dela.
12. Lava-se a ditecidos ssociated no filtro celular de 2 - 3 vezes com 20 ml de solução de 1x PBS utilizando uma pipeta de transferência.
13. Lave os vazios 2 ml tubos cônicos com solução PBS 1x (1 ml) e despeje o conteúdo através dos filtros celulares.
14. Retire os filtros celulares de 50 ml tubos cônicos e substituir as tampas. Centrifugar os tubos a 1250 xg durante 10 minutos a 4 ºC.
15. Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. O sedimento celular contém os leucócitos e células do estroma isoladas.
16. Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio de cultura RPMI sem soro fetal bovino (FBS). Misture delicadamente. Não use vortex.
17. Adicionar 500 uL de SBF puro para um tubo de poliestireno de 5 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células.
18. Centrifugar durante 10 minutos a 1100 xg, sem o travão à TA para sedimentar as células viáveis ​​quando os restos celulares são retidos na interface PBS / FBS.
19. Aspirar o sobrenadante sem tocar no sedimento celular. O cell pastilha contém principalmente células viáveis.
20. Opcionalmente: Para concentrar as células mononucleares, usar uma solução de polissacárido saturada de 20%, como descrito abaixo.
    1. Ressuspender o sedimento celular em 1000 uL de meio de cultura RPMI sem FBS.
    2. Adicionar 1 ml de solução de polissacárido saturada de 20% para um tubo de plástico de poliestireno de 5 ml e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo desta solução, de acordo com as instruções do fabricante. Enquanto a disposição em camadas da amostra, evitar a mistura da solução de polissacárido saturada de 20% com a suspensão de células.
    3. Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min à TA sem travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e perder o gradiente. As células mononucleares podem ser encontrados na interface entre a solução de polissacárido saturada a 20% e a solução de PBS 1x.
    4. Aspirar e desprezar o sobrenadante. O sedimento de células contém principalmente células mononucleares.
       Nãote: Para realizar a coloração de viabilidade e coloração intracelular, consulte a etapa 3. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a etapa 4. Para realizar a coloração de viabilidade e coloração extracelular somente, veja o passo 5. Para executar uma cultura de células de leucócitos isolados, consulte o passo 6. Para executar separação de células magnéticas, consulte a etapa 7.

3. a coloração de viabilidade para Células fixável

1. Ressuspender o sedimento de células em 1,100 ml de solução de PBS 1x. Misturar suavemente usando uma micro-pipeta.
2. Transferir 100 ul da suspensão de células para um tubo de plástico de 5 ml de poliestireno. Adicionar 400 ul da solução 1x PBS para o tubo de polistireno de 5 ml. Este tubo é um controlo de tecido auto-fluorescência. Armazenar a 4 ° C até o passo 3.5.
3. Transferir os restantes 1.000 ul da suspensão de células para um novo tubo de 5 ml de poliestireno plástico. Adicionar 1 mL do corante de viabilidade e homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos no escuro a 4 ºC.
4. Após a incubação, adicionar 1000 & #181; l de solução de PBS 1x. Misture delicadamente com a mão.
5. Centrifugar ambos os tubos de poliestireno de 5 ml de plástico (as etapas 3.2 e 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
   Nota: O sedimento de células (passo 3.3) vai ser usado no passo 4. O sedimento de células (passo 3.2) vai servir como um controlo para o tecido auto-fluorescência.

4. A imunofenotipagem

1. Ressuspender o sedimento celular em 50 ul de anti-ratinho de CD16 / CD32 (diluído 1: 100 em tampão de SCAF [BSA a 0,1%, azida de sódio a 0,05%, solução de 1X PBS, pH 7,4]). Misturar suavemente a suspensão de células. Não use o vórtice.
2. Incubar a suspensão de células no tubo de polistireno de 5 ml no escuro a 4 ° C durante 10 min.
3. Após a incubação, adicionar 50 ul de cada anticorpo monoclonal anti-leucócito reagir com os marcadores de superfície celular ou extracelular anticorpo de controlo de isotipo coincidente (diluições de anticorpos deve ser validado). Por exemplo, para analisar as sub-populações de leucócitos, usar anti-Moutilizar os anticorpos que reagem com os seguintes marcadores de superfície de células de leucócitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabela 1).
4. Uma vez que os anticorpos contra marcadores extracelulares foram adicionados a 5 mL do tubo de poliestireno de plástico, mistura suavemente. Incubar no escuro durante 30 min a 4 ° C.
5. Durante esta incubação, preparar e pré-aquecer a solução de tampão de fixação (diluída com água desionizada, 1: 5) a 37 ° C, se necessário. Mantenha o tampão a 37 ºC no escuro até que seu uso é necessário.
6. Após 30 min de incubação, adicionar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo plástico de poliestireno e misturar suavemente. Este passo é necessário para lavar as células e remover qualquer excesso de anticorpo não ligado.
7. Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
   Nota: Se a coloração intracelular não é necessário, ver passo 5. Se a coloração intracelular é necessário, efectuar a permeabilização e intracelularcoloração ular aqui, e então prosseguir com a fixação (passo 4.8).
8. Adicionar 500 ul da solução tampão de fixação pré-aquecido ao sedimento de células e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ºC.
9. Dispensar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo de poliestireno plástico. Misture delicadamente.
10. Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
11. Adicionar 500 ul de tampão de FACS para cada amostra. Estas amostras podem agora ser analisadas por citometria de fluxo. Adquirir as amostras imediatamente para obter melhores resultados.

5. a coloração de viabilidade de células unfixable

1. Depois de imunofenotipagem extracelular, ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de FACS.
2. Adicionar 1 ml de 4 ', dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, a 200 ng / ml) imediatamente antes de adquirir a amostra.
3. Visualizar as amostras dentro de 1-2 minutos após a adição de DAPI utilizando um citómetro de fluxo.

6. Cultura De Células

1. Prepare uma estação de trabalho sob uma coifa estéril. Pré-aquecer o meio de cultura RPMI a 37 ° C usando um banho de água.
2. Ressuspender o sedimento celular em 1000 ul de tampão de FACS para contagem das células.
3. Contar o número de células viáveis ​​utilizando um contador de células automático ou hemocitómetro e solução de azul de tripano a 0,4%, seguindo as instruções do fabricante. Grave a contagem total de células vivas.
4. Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min para remover o tampão de SCAF.
5. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de meio de cultura RPMI pré-aquecido por pipetagem suave de 2 a 3 vezes.
6. Placa o número desejado de células em um filtro estéril placa de 24 poços e incuba-se a 37 ° C. O tempo de incubação será determinada pela questão de pesquisa.

7. Magnetic Seleção celular

1. Configurar uma estação de trabalho limpo, com os seguintes materiais: Colunas MS, separadores de células magnética, 15tubos cónicos de 30 ml uM filtros de pré-separação, e um multi-suporte.
2. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de MACS (0,5% de BSA, EDTA 2 mM, solução de 1x PBS, pH 7,2).
3. Usando um contador de células automático ou hemocit�etro e 0,4% de solução de azul de tripano, contar e registrar a contagem total de células vivas.
4. Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Adicionar mais 500 ul de tampão MACS.
5. Avance para realizar a separação magnética seguindo as recomendações do fabricante.
6. Determinar a pureza por citometria de fluxo ou microscopia.

A dissecação de tecidos de murino a partir da interface materno-fetal é mostrado na Figura 1; este procedimento inclui a abertura da cavidade peritoneal (Figura 1A, B), cornos uterinos (Figura 1C), incluindo os locais de implantação (Figura 1D), e a recolha dos tecidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), e tecidos deciduais (Figura 1G) em 16,5 dpc. A Figura 2 mostra a morfologia dos macrófagos isolados (F4 / 80 +) recolhidas a partir dos tecidos uterinos e deciduais em 16,5 dpc utilizando separação de células magnético. Isolado macrófagos manter a capacidade de libertação de citocinas (dados não mostrados). O rendimento de células viáveis ​​isolados do decidua, útero e placenta é mostrado na Figura 3, e a viabilidade das células é superior a 70% em todos os tecidos. A Figura 4 mostra a estratégia para a análise de gating polymorphonucle leucócitos AR e mononucleares dentro dos singuletos e portas de viabilidade, incluindo células T (CD45 + CD3 +), neutrófilos (CD45 + Ly6G +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), células dendríticas (CD45 + CD11c +) e células NK (CD45 + CD49b +) em 16,5 dpc. Uma elevada percentagem de macrófagos CD11c co-expresso. A Figura 5 mostra os neutrófilos, os macrófagos e células T no decidual, útero e tecidos da placenta em 16,5 dpc. A Figura 6 mostra a estratégia para a análise de linfócitos de propagação dentro dos singuletos portas e viabilidade, incluindo células T (CD3 + CD45 +) e células B (CD45 + B220 +) a 16,5 dpc. As células T incluem células T CD4 + e CD8 +. Tecidos murinos na interface materno-fetal também incluem CD3 + CD4-CD8- (células T gama-delta) em proporções elevadas. A Figura 7 mostra as células T e as células B no decidual, uterino, e tecidos da placenta em 16,5 dpc.

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Figura 1. Tissue dissecção. Chifres (A) uterinos em 16,5 dpc em um rato B6. As trompas uterinas são ligados ao mesentério e vasos de drenagem. Chifres (B) uterinos dissecado do mesentério e ainda ligado ao colo do útero. chifres (C) uterinos, incluindo os locais de implantação e colo do útero. (D) Dissecção de um local de implantação. (E) A dissecção dos tecidos uterinos do local de implantação. (F) Separação da placenta e decídua do local de implantação. (G) Destacamento da decídua (camada branca-acinzentada) a partir da placenta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Os macrófagos isolados a partir de tecidos uterinos e deciduais. Os macrófagos (F4 / 80 + células) isoladas a partir dos tecidos uterinos e deciduais em 16,5 dpc utilizando separação de células magnético. Ampliação 20X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Viabilidade de células isoladas. As células viáveis ​​(células DAPI- representadas com setas) isoladas de decidual, do útero, da placenta e tecidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. estratégia Gating para polimorfonucleares e mononucleares leucócitos. A população total de leucócitos foi fechado dentro dos interiores e portões de viabilidade. Células de células T (CD45 + CD3 +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), neutrófilos (CD45 + Ly6G +), células dendríticas (CD45 + CD11c +) e NK (CD45 + CD49b +) foram fechado dentro do porta-total de leucócitos ( CD45 +). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As células Figura 5. Os neutrófilos, macrófagos, e células T em tecidos murinos na interface materno-fetal. Os neutrófilos (CD45 + Ly6G +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), e T (CD45 + CD3 +) foram fechado dentro da viabilidade e portões em decidual isolado, uterina, e células da placenta total de leucócitos-(CD45 +).TPS: "target =" _ blank //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. estratégia gating para linfócitos. Mononucleares foram fechado dentro dos singuletos e portas de viabilidade. Células T (CD3 +) e células B (B220 +) foi fechado dentro do portão viabilidade. As células T CD4 + e CD8 + T foram fechado dentro do portão de células T (CD3 +). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. sub-populações de linfócitos em tecidos de murino na interface materno-fetal. Células T (CD3 +)e células B (B220 +) foi fechado dentro do portão viabilidade em decidual isolado, uterino, e células placentárias. As células T CD4 + e CD8 + T foram fechado dentro do portão de células T (CD3 +). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Lista de anticorpos utilizado para leucócitos subconjunto imunofenotipagem

A coleta de dados consistentes que registra as características fenotípicas e abundância de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial para a compreensão da patogênese das complicações relacionadas com a gravidez. Foram descritas várias técnicas que facilitam o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal durante a gravidez ^{31,38,39,43-46.} No entanto, cada técnica é diferente, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não especifica quantidades de tecido, e, mais importante ainda, não sempre especificar a viabilidade das células isoladas. O protocolo aqui descrito permite o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal com alta viabilidade, e fornece informações detalhadas sobre os reagentes comerciais, tampão de preparação, as quantidades de tecido, e os tempos de incubação validado nolaboratório.

Um dos passos mais críticos do processo de isolamento de leucócitos é a dissociação de tecidos; Esta etapa envolve a homogeneização mecânica e / ou reacções enzimáticas que podem alterar a integridade de proteínas extracelulares utilizados na caracterização fenotípica ^47. O protocolo aqui descrito oferece uma nova abordagem que combina a utilização de técnicas de dissociação de tecido mecânicos suaves e enzimáticas para preservar a integridade dos marcadores extracelulares nos leucócitos isolados a partir da placenta e deciduais e os tecidos uterinos dos ratos.

Enzimas individuais e combinações de enzimas diferentes têm sido utilizados para isolar leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal ^31,32,39,44. Em muitos casos, estas enzimas que estão preparadas para concentrações específicas à mão no laboratório pode estar sujeito a erro humano. Aqui, em vez disso, uma colagenase purificados / prot neutro ready-to-usefacilitar cocktail, Accutase, foi implementado em laboratório; como uma preparação enzimática comercialmente disponível, tem sido mostrado para fornecer resultados fiáveis ​​em cultura de células de ^48. Esta solução enzimática é conhecida para separar eficazmente macrófagos de as placas de cultura sem raspagem e, mais importante ainda, sem perder antígenos de superfície ^48. Esta enzima também preparado foi usado para processar a digestão de tecidos do sistema nervoso humano e animal, resultando em células isoladas viáveis ​​que permanecem sustentável por longos períodos, que permita a sua subsequente cultura ^47. Além disso, esta solução enzimática preserva antigenicidade CD24 em células isoladas a partir de tecidos do sistema nervoso central ^47. Quando comparado com Liberase-1, outro coquetel de colagenase e protease neutra, nem Accutase nem Liberase-1 gerar agregados de DNA livres; no entanto, é mais suave do que Accutase Liberase-1 durante a dissociação do tecido ^47. A colagenase / protease co neutrocktail utilizado neste protocolo também demonstrou superioridade de tripsina na preservação do CD44, uma haste do cancro da superfície celular marcador ^49. Estudos deste laboratório têm consistentemente observou que esta solução enzimática preserva antígenos de superfície do mouse leucócitos. Na verdade, as diferenças informativos foram encontrados na expressão de marcadores extracelulares em macrófagos (CD11b + F4 80 células / +), neutrófilos (células CD11b + Ly6G +), as células NKT (células CD3 + CD49b +), células T (células T CD3 +) e B (células B220 + CD19 + células), incluindo CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, e CTLA4, e na libertação de citoquinas. Portanto, o método aqui descrito é óptima para a imunofenotipagem de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal em ratinhos, como mostram os resultados representativos.

Uma vantagem importante do presente método é a determinação simultânea de vários antigénios extracelulares e intracelulares, dentro da porta de viabilidade. O corante utilizado para de maisa viabilidade celular termine é iodeto de propídio (PI); no entanto, a sua utilização é limitada uma vez que só pode ser utilizada em combinação com FITC. Isso ocorre porque PI não pode ser adequadamente distinguidos da maioria dos outros fluorocromos excitados por lasers azuis e vermelhas ^50. Uma solução é a utilização de DAPI ^{a 50} ou qualquer outro corante que é excitada por lasers de UV, mas não por laser azul e vermelho comumente utilizados para imunofenotipagem. Este protocolo permite a imunofenotipagem de células viáveis, uma vez que inclui a utilização de células ⁵⁰ para DAPI unfixable ou a utilização de corante de viabilidade de células fixável.

Uma segunda vantagem importante do protocolo aqui descrito é que ele permite o isolamento de leucócitos com um elevado rendimento de células viáveis. Os dados representativo mostra que 70% a 89% das células isoladas são viáveis. Isto é de grande importância como este protocolo permitiu o estudo das propriedades funcionais das células isoladas a partir de tecidos murinos na interface materno-fetal. Fou exemplo, as culturas de macrófagos deciduais e uterinas e o estudo da libertação de citocina sob estimulação ter sido realizada utilizando este método.

Para alcançar bons resultados, a aplicação do protocolo descrito é importante quando se considera os seguintes factores: 1) recolha de tecidos devem ser realizadas dentro de 5 a 10 min após a abertura da cavidade peritoneal, e esses tecidos devem ser colocadas em gelo para manter a viabilidade de as células isoladas; 2) homogeneização do tecido mecânica deve ser feita com tesoura de ponta fina e não pode ser superior a 2 minutos desde períodos mais longos têm demonstrado reduzir o rendimento de células viáveis; 3) A duração da incubação com a solução enzimática pode ser inferior a 1 hora uma vez que a sua actividade diminui depois de este período de tempo; 4) a temperatura de incubação com a solução enzimática deve ser mantida a 37 ° C para se obter a actividade óptima deste cocktail de enzimas; 5) Manipulação sedimento celularmento devem ser feito suavemente com micropipetas porque o uso do vórtice pode danificar a integridade das células (células isoladas são manipulação diferenciada e abrupta pode facilmente reduzir a sua viabilidade); 6) de tampão e temperaturas de centrifugação deve ser mantida à mesma temperatura como a suspensão de células; 7) As células isoladas deve ser processado para imunofenotipagem ou usado imediatamente como a sua viabilidade reduz rapidamente; e 8) ao realizar a imunofenotipagem, as amostras devem ser adquiridos usando um citômetro de fluxo imediatamente para obter melhores resultados.

Uma limitação deste protocolo é o custo da solução enzimática, que é mais caro do que outras enzimas com funções semelhantes, por exemplo, tripsina, dispase II, e colagenase. No entanto, as vantagens que esta solução enzimática exibe, acima das enzimas descritas são superiores.

Além de imunofenotipagem e cultura de células e triagem, as futuras aplicações deste protocolo são numerous e variada. Por exemplo, é agora possível para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro dos leucócitos (p.ex., fagocitose, citotoxicidade, proliferação de células T e ensaios de plasticidade, etc), e produção de espécies reactivas de oxigénio nos leucócitos isolados a partir de tecidos murinos na interface materno-fetal. Na verdade, a descrição de novos leucócitos e raros nos tecidos murinos na interface materno-fetal pode também ser realizada.

Os autores revelam que não há conflitos de interesse.

NGL foi apoiado pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) para sua leitura crítica do manuscrito.