Aislamiento de leucocitos a partir de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

La tolerancia inmunológica en el embarazo requiere que el sistema inmunológico de la madre experimenta cambios distintivos para aceptar y nutrir al feto en desarrollo. Esta tolerancia se inicia durante el coito, establecido durante la fecundación y la implantación, y se mantiene durante todo el embarazo. Mediadores celulares y moleculares activos de la tolerancia materno-fetal se enriquecen en el sitio de contacto entre los tejidos fetales y maternas, conocidos como la interfaz materno-fetal, que incluye la placenta y el útero y los tejidos deciduales. Esta interfaz se compone de las células del estroma y leucocitos infiltrantes, y sus características fenotípicas de abundancia y cambia en el transcurso del embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal incluyen neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, células T, células B, células NK, las células NKT y que juntos crean el micro-entorno local que sustenta el embarazo. Un desequilibrio entre estas células o cualquier inappropalteración piados en sus fenotipos se considera un mecanismo de la enfermedad en el embarazo. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos que se infiltran en la interfase materno-fetal es esencial con el fin de dilucidar los mecanismos inmunológicos que conducen a complicaciones relacionadas con el embarazo. Descrito en el presente documento es un protocolo que utiliza una combinación de disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto con una proteolítica y cóctel colagenolıtica enzimática para aislar los leucocitos infiltrantes de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Este protocolo permite el aislamiento de un gran número de leucocitos viables (> 70%) con propiedades antigénicas y funcionales suficientemente conservadas. Leucocitos aislados pueden ser analizados mediante varias técnicas, incluyendo la inmunofenotipificación, clasificación de células, formación de imágenes, inmunotransferencia, la expresión de ARNm, cultivo celular, y en ensayos funcionales in vitro tales como reacciones mixtas de leucocitos, la proliferación, o ensayos de citotoxicidad.

La tolerancia inmune durante el embarazo es un período en que se producen cambios distintivos en el sistema inmunológico de la madre. Estos cambios permiten a la madre para tolerar el feto, un injerto alogénico ^semi-1. El feto expresa paternal complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) antígenos de ^2, y las células fetales se han encontrado en la circulación materna ^3; sin embargo, el feto no se rechaza ^4,5. Este enigma no se entiende completamente.

La hipótesis más reciente afirma que se crea la tolerancia materno-fetal durante el coito y su fecundación ^6,7 y mantenido para sostener un embarazo a término ^8-10. El desglose de esta tolerancia materno-fetal se considera un mecanismo de la enfermedad durante las primeras y últimas etapas del embarazo ^10-16. La tolerancia materno-fetal consiste en la participación de los diversos sub-poblaciones de leucocitos, incluyendo las células T (células T reguladoras, las células Th1, células Th2 y células Th17), macrophages, neutrófilos, mastocitos, células NK, y células NKT, células dendríticas y células B, que el cambio en la densidad y localización durante todo el embarazo ^15,17-19. Tolerancia materno-fetal se enriquece en la interfase materno-fetal ²⁰ - el sitio anatómico donde el sistema inmune de la madre interactúa con los antígenos fetales ^20,21.

Se crea la interfaz materno-fetal durante la placentación cuando las células trofoblásticas extravillous fetales invaden la mucosa uterina ^22-24. En el lado fetal de esta interfaz, las membranas que rodean al feto crean una superficie epitelial especializada dentro de la placenta, y las células sincitiotrofoblasto controlan el intercambio de nutrientes a través de su contacto directo con la sangre materna ^22. En el lado materno de la interfaz, el decidua recluta una piscina heterogéneo de leucocitos en ratones que representan el 30% a 50% de todas las células deciduales. Además de su participación en maternAl tolerancia inmune, estas células son los principales contribuyentes a los distintos procesos durante el embarazo, por ejemplo., la protección del tracto reproductivo de las infecciones, la fecundación, la implantación del embrión ^7,25, la angiogénesis decidual ^26, remodelado vascular ^24,27, la invasión del trofoblasto ^28, de la placenta desarrollo ^24,25, y, en última instancia, el trabajo y la entrega ^15,17. Por lo tanto, el estudio de los leucocitos implicados en la tolerancia materno-fetal es esencial para dilucidar la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo.

Aunque el uso de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia ha generado datos para la visualización directa y localización de uterina, decidual, o leucocitos placentarios ^29,30, citometría de flujo análisis ha revelado también subconjuntos específicos de leucocitos en cada uno de estos tejidos ^31,32. Además, la citometría de flujo se ha utilizado para determinar la densidad y la proporción de maternal-fetal interfaz de leucocitos ³³ y de expresión los niveles de proteínas extracelulares e intracelulares ^8-10,34. Análisis de citometría de flujo de leucocitos en la interfase materno-fetal requiere una suspensión de una sola célula. Con el fin de aislar los leucocitos infiltrantes de la decidual, uterino, y tejidos de la placenta, se han utilizado dos métodos de disociación de tejidos: mecánica y enzimática. Ambos métodos permiten la separación de los leucocitos infiltrados de la matriz extracelular (ECM) de estos tejidos. Disociación enzimática de tejido es superior a la disociación de tejido mecánica, ya que permite un mayor rendimiento de los leucocitos con daño asociado a la fuerza de cizallamiento menos ^35. En consecuencia, la disociación de tejido mecánico requiere la agrupación de tejidos ^36, que pueden aumentar la variabilidad y la heterogeneidad de las muestras. Sin embargo, la disociación mecánica puede ser la opción cuando el antígeno de interés puede ser alterada por disociación enzimática o cuando la funcionalidad de la células de las necesidades de interés que se conserva (por ejemplo., la citotoxicidad de las células NK) ^35.

El uso de la proteolisis con enzimas específicas para degradar la ECM elimina los bajos rendimientos observados con disociación mecánica. Varios estudios han reportado el uso de tripsina ^32, colagenasa ^37, DNasa ^31, Dispasa ³⁸ y cócteles comerciales de diversas enzimas ^32,39. Sin embargo, la naturaleza y concentración de diferentes enzimas y la duración de la digestión deben ser meticulosamente definidos y validados con el fin de asegurar el mantenimiento de la integridad de los epítopos antigénicos de la superficie celular necesarias para inmunofenotipo. Las diversas estructuras de la superficie son diferencialmente susceptibles a la destrucción por diferentes enzimas, con algunas enzimas, tales como tripsina, siendo notorio para pelar epítopos de superficie de leucocitos reconocidos por muchos anticuerpos monoclonales.

Introducido en el presente documento es un método que utiliza un proteolytic y cóctel enzimático colagenolítica, llamado Accutase. Esta solución enzimática es lo suficientemente suave mientras que todavía eficiente en disociar tejidos murinos en la interfase materno-fetal, y no requiere la adición de otros reactivos o suero de disociación para terminar la reacción de disociación. Por otra parte, está listo para usar tal como se suministra y, aunque el tiempo de disociación debe ser validado, es más robusto que las enzimas mencionadas anteriormente ^40,41.

La utilización de una combinación de ambos tipos de desagregación del tejido mejora la calidad y la cantidad de células obtenidas; Por lo tanto, varios estudios han implementado el uso combinado de disociación mecánica y enzimática con resultados satisfactorios ^31,32,37. El protocolo descrito en este documento se estableció y validó en nuestro laboratorio; que utiliza una combinación de una disociación mecánica suave seguido por una desagregación enzimática robusto. Este protocolo permite el estudio y el aislamiento adicional delos leucocitos infiltran en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal (útero, decidua y placenta). El siguiente protocolo también mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y los rendimientos de células viables suficiente para aplicaciones posteriores como se demuestra por análisis de citometría de flujo. Finalmente, este protocolo mantiene la consistencia de la preparación de células para el análisis y la comparación de diferentes tejidos murinos que componen la interfaz materno-fetal.

Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética animal debe ser dada por el Comité de Ética Local de Investigación y las Juntas de Revisión Institucional. Cuando se trabaja con sangre animal, células o agentes peligrosos que se mencionan en este protocolo, las medidas de bioseguridad y seguridad de laboratorio adecuados se deben seguir.

1. Manejo del ratón y Tejidos Colección

1. Preparar una estación de trabajo estéril y obtener herramientas estériles para la recogida de tejidos. Estas herramientas incluyen grandes y pequeñas tijeras quirúrgicas, pinzas y pinzas de punta fina. Incluir pequeñas placas de Petri marcadas con los nombres tejido apropiado, lleno de solución 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (de 3 - 5 ml) equilibrada a RT de (20 - 22 ° C). También incluir una gran placa de Petri, no marcado, lleno de solución PBS 1x (10 - 15 ml).
2. La eutanasia a un ratón embarazadas (10,5 a 19,0 días post-coito (dpc) o antes de la entrega) utilizando dióxido de carbono (CO ₂). Para asegurarse de que el ratón es sacrificado, utilice la técnica de dislocación cervical.
   Nota: Antes de 10,5 dpc, es difícil separar manualmente los tejidos deciduales de los tejidos uterinos. Si no se requiere el aislamiento de los leucocitos deciduales, leucocitos de los tejidos uterinos de ratones no embarazadas o los de ratones a <10,5 dpc pueden también ser realizadas siguiendo este protocolo.
3. Con un par de tijeras quirúrgicas estériles, eliminar por completo la parte inferior del abdomen de la piel y el tejido muscular. Con unas pinzas, a un lado todos los demás órganos hasta que el útero y los ovarios son visibles. Con el útero todavía unido, utilice el fórceps para moverlo fuera de la cavidad peritoneal (Figura 1A).
4. Localice los ovarios distal a la unión oviducto y uterotubárica de cada cuerno uterino. Uso de las pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión en la unión útero-tubárica y separar los cuernos uterinos de la mesenterio que contiene los vasos uterinos; después,especial en el cuello del útero para separar los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal (Figura 1B).
5. Con pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión entre el cuello del útero y el segmento inferior de los cuernos uterinos. Dejar adjunta una porción del cuello del útero durante este proceso (Figura 1C) para evitar la apertura de la trompa uterina.
6. Sumergir los cuernos uterinos (incluyendo el cuello del útero) en un gran plato de Petri llena con una solución de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar los sitios de implantación.
7. Aunque todavía inmerso en solución de PBS 1x, recortar la grasa de los cuernos uterinos con las pequeñas tijeras quirúrgicas. Mantener los tejidos sumergidos en solución de PBS 1x a lo largo de la disección.
8. La celebración de los cuernos uterinos en su lugar con las pinzas, quite uno de los lugares de implantación del útero con un corte transversal a través de la región inter-implantación, utilizando las pequeñas tijeras quirúrgicas (Figura 1D). El sitio de implantación contiene el feto, rodeado por elmembrana corioalantoidea, y el útero, decidual, y los tejidos placentarios.
9. Usando las pinzas, mantenga el sitio en su lugar y hacer una pequeña incisión en la pared uterina adyacente a la placenta y los tejidos deciduales (Figura 1E). Recorte alrededor del perímetro de la placenta / decidua hasta que éstos se separan tanto de la pared uterina y la membrana corioalantoidea que incluye el feto (Figura 1F).
10. Retire la placenta y tejidos deciduales adjuntos y lugar en solución PBS 1x (3-5 ml; consulte el paso 1.12).
11. Coloque el feto rodeado por la membrana corioalantoidea unido a los tejidos uterinos en una placa de Petri llena con solución de PBS 1x (de 3 - 5 ml). La hidratación de estos tejidos facilitará la separación de la membrana corioalantoidea de la pared uterina (véase el paso 1,14).
12. Con un par de pinzas de punta fina, pelar suavemente el tejido decidual (capa blanco-gris) de la superficie de la placenta. Realice estepaso cuidadosamente para mantener la integridad de la placenta y los tejidos deciduales (Figura 1G).
13. Coloque la placenta y los tejidos deciduales en dos platos etiquetados por separado Petri llenas de solución de PBS 1x (3-5 ml cada una).
14. Retire con cuidado la pared uterina de la membrana corioalantoidea con unas pinzas de punta fina. Estos son los tejidos uterinos.
15. Coloque los tejidos uterinos en una placa de Petri llena de solución de PBS 1x (de 3 - 5 ml).
16. Repita los pasos 1.8 a través de 1,15 hasta que se hayan procesado todos los lugares de implantación.
17. Recoger varios uterino, decidual, y tejidos de la placenta para mejorar el rendimiento de las células durante la digestión enzimática. La cantidad de los tejidos depende del tamaño de la camada; sin embargo, el aislamiento de leucocitos requiere> 2 piezas de tejido.
    Nota: Para obtener información más detallada sobre la disección de los lugares de implantación en diferentes días de gestación, ver las imágenes que se encuentran en el capítulo dos de la Guía de Investigatiel ratón del Embarazo ^42.

2. uterino, decidual y placenta Tejido Disociación

1. Etiquetar varios 2 ml estériles tubos cónicos con el nombre de tejido apropiado, y coloque un vial con 1.000 l de solución enzimática en hielo.
2. De la placa de Petri llena de solución de 1x PBS, transferir dos piezas (100 - 150 mg) de la uterino, decidual, o tejidos de la placenta a un tubo cónico de 2 ml etiquetados.
3. Añadir 500 l de solución enzimática en frío en cada tubo cónico de 2 ml.
4. Con tijeras estériles finas, comenzar a disociar el tejido sumergido en la solución enzimática hasta que se picada finamente. Con el tiempo, la suspensión se desarrollará un aspecto lechoso. Este paso no debe exceder más de 2 min para evitar el exceso de manipulación de la muestra.
5. Una vez que el tejido ha sido disociado, añadir un extra de 500 l de solución enzimática frío al tubo cónico de 2 ml.
6. Coloque el tubo cónico de 2 ml en hielo.
7. Repita los pasos 2.2 a 2.6 con cada tejido hasta que se hayan procesado todos los tejidos.
8. Transfiera todas las 2 ml tubos cónicos con tejido homogeneizado (tejido picado + solución enzimática) muestras del hielo en una incubadora a 37 ºC y realizar una agitación orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Asegúrese de que la temperatura de la incubadora se estabiliza antes de iniciar el tiempo de incubación.
9. Después de la incubación, retirar los 2 ml tubos cónicos con tejidos disociados de la incubadora y colocarlos en hielo para evitar la digestión más.
10. Etiquetar estériles 50 ml tubos cónicos de acuerdo con el tipo de tejido. Retire las tapas y reemplazarlos con un filtro de células estéril (100 micras de tamaño de poro).
11. Verter los tejidos disociados de los 2 ml tubos cónicos a través del filtro de células utilizando ~ 20 ml de solución de PBS 1x. Los fragmentos de tejido permanecerán en el filtro de células y la suspensión de células pasarán a través de él.
12. Lave el ditejidos ssociated en el filtro de células de 2 - 3 veces con 20 ml de solución de 1x PBS utilizando una pipeta de transferencia.
13. Enjuague los vacíos 2 ml tubos cónicos con solución de PBS 1x (1 ml) y verter el contenido a través de los tamices de células.
14. Quite los filtros celulares de los 50 tubos cónicos ml y reemplazar las tapas. Centrifugar los tubos a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC.
15. Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. El sedimento celular contiene los leucocitos aislados y células del estroma.
16. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio de cultivo RPMI sin suero fetal bovino (FBS). Mezclar suavemente. No utilice vórtice.
17. Añadir 500 l de FBS limpias a un tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y superponer lentamente la suspensión celular.
18. Centrifugar durante 10 min a 1.100 xg sin el freno a TA para sedimentar las células viables mientras que los desechos celulares se retiene en la interfase PBS / FBS.
19. Aspirar el sobrenadante sin tocar el sedimento celular. El cell pellet contiene principalmente células viables.
20. Opcionalmente: Para concentrar las células mononucleares, utilizar una solución de polisacárido saturada 20%, como se describe a continuación.
    1. Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de medio de cultivo RPMI sin FBS.
    2. Añadir 1 ml de solución de polisacárido saturada 20% a un tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y superponer lentamente la suspensión celular en la parte superior de esta solución, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mientras capas de la muestra, evitar la mezcla de la solución de polisacárido saturada 20% con la suspensión de células.
    3. Centrifugar con un rotor basculante a 500 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente y sin freno. Es muy importante para desactivar el freno para evitar la mezcla de las células y perder el gradiente. Las células mononucleares se encuentran en la interfaz entre la solución de polisacárido saturada 20% y la solución 1x PBS.
    4. Aspirar y desechar el sobrenadante. El sedimento celular contiene células mononucleares en su mayoría.
       Note: Para realizar la tinción de viabilidad y tinción intracelular, consulte el paso 3. Para realizar inmunofenotipo, consulte el paso 4. Para llevar a cabo la tinción de viabilidad y sólo tinción extracelular, consulte el paso 5. Para realizar un cultivo de células de leucocitos aislados, consulte el paso 6. Para llevar a cabo clasificación de células magnético, consulte el paso 7.

3. La tinción de viabilidad de células fijables

1. Resuspender el sedimento celular en 1.100 l de solución de PBS 1x. Mezclar suavemente utilizando un micro-pipeta.
2. Transferir 100 l de la suspensión celular en un tubo de plástico 5 ml de poliestireno. Añadir 400 l de solución de PBS 1x para el tubo de poliestireno de 5 ml. Este tubo es un control para el tejido auto-fluorescencia. Almacenar a 4 ° C hasta el paso 3.5.
3. La transferencia de los 1000 l restantes de la suspensión celular a un nuevo tubo de plástico de poliestireno de 5 ml. Añadir 1 l de colorante viabilidad y homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
4. Después de la incubación, añada 1000 & #181; l de solución de 1x PBS. Mezclar suavemente con la mano.
5. Centrifugar ambos tubos de plástico de poliestireno 5 ml (pasos 3.2 y 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar y desechar el sobrenadante.
   Nota: El sedimento celular (paso 3.3) se utilizará en el paso 4. El pellet de células (paso 3.2) servirá como un control para el tejido auto-fluorescencia.

4. Inmunofenotipificación

1. Resuspender el sedimento celular en 50 l de anti-ratón CD16 / CD32 (diluido 1: 100 en tampón FACS [0,1% de BSA, azida de sodio 0,05%, solución 1x PBS, pH 7,4]). Mezclar la suspensión celular suavemente. No utilice el vórtice.
2. Incubar la suspensión de células en el tubo de poliestireno de 5 ml en la oscuridad a 4 ° C durante 10 min.
3. Después de la incubación, añadir 50 l de cada anticuerpo monoclonal anti-leucocitos reaccionar con marcadores de superficie celular extracelular o anticuerpo de control de isotipo (diluciones de anticuerpos deben ser validados). Por ejemplo, para analizar subpoblaciones de leucocitos, usar anti-moutilizar anticuerpos que reaccionan con los siguientes marcadores de superficie de células de leucocitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, y CD8 (Tabla 1).
4. Una vez que los anticuerpos contra marcadores extracelulares se han añadido al tubo de plástico de poliestireno 5 ml, mezclar suavemente. Incubar en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C.
5. Durante esta incubación, preparar y pre-calentar la solución tampón de fijación (diluido con agua desionizada, 1: 5) a 37 ºC, si es necesario. Mantenga el tampón a 37 ºC en la oscuridad hasta que su uso es necesario.
6. Después de 30 min de incubación, añadir 500 l de tampón FACS en el tubo de plástico de poliestireno de 5 ml y mezclar suavemente. Este paso es necesario para lavar las células y eliminar el exceso de anticuerpo no unido.
7. Centrifugar las muestras a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante.
   Nota: Si no se requiere la tinción intracelular, consulte el paso 5. Si se requiere la tinción intracelular, realice permeabilización y intracelulartinción ular aquí y, a continuación, proceder a la fijación (paso 4.8).
8. Añadir 500 l de la solución tampón de fijación pre-calentado al sedimento celular y se incuba en la oscuridad durante 10 min a 37 ºC.
9. Dispensar 500 l de tampón FACS en el tubo de plástico de poliestireno de 5 ml. Mezclar suavemente.
10. Centrifugar las muestras a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante.
11. Añadir 500 l de tampón de FACS a cada muestra. Estas muestras pueden ahora ser analizadas por citometría de flujo. Adquirir las muestras inmediatamente para obtener mejores resultados.

5. La tinción de viabilidad de células irreparable

1. Después de inmunofenotipificación extracelular, resuspender el sedimento celular en 500 l de tampón FACS.
2. Añadir 1 l de 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 200 g / ml) justo antes de la adquisición de la muestra.
3. Visualice las muestras dentro de 1 - 2 minutos después de la adición de DAPI utilizando un citómetro de flujo.

6. Cultivo De Células

1. Preparar una estación de trabajo bajo una campana de humos estéril. Pre-calentar el medio de cultivo RPMI a 37 ° C usando un baño de agua.
2. Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de tampón FACS para el recuento celular.
3. Contar el número de células viables utilizando un contador celular automático o hemocitómetro y solución de azul de tripano al 0,4%, siguiendo las instrucciones del fabricante. Anote el número total de células vivas.
4. Centrifugar las células a 1250 xga 4 ° C durante 10 min para eliminar el tampón FACS.
5. Resuspender el sedimento celular en 500 l de medio de cultivo RPMI-pre calentado suavemente pipeteando 2 a 3 veces.
6. Placa el número deseado de células en una placa de 24 pocillos estéril y se incuba a 37 ° C. El tiempo de incubación será determinado por la pregunta de investigación.

7. Clasificación celular magnética

1. Configurar una estación de trabajo limpia con los siguientes materiales: Columnas MS, separador celular magnética, 15tubos cónicos ml, 30 micras filtros pre-separación, y un multi-soporte.
2. Resuspender el sedimento celular en 500 l de tampón MACS (0,5% de BSA, 2 mM EDTA, solución 1x PBS, pH 7,2).
3. El uso de un contador de células automático o hemocitómetro y el 0,4% de solución de azul de tripano, contar y registrar el número total de células vivas.
4. Centrifugar las células a 1250 xga 4 ° C durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante. Añadir otros 500 l de tampón MACS.
5. Proceda a realizar la separación magnética siguiendo las recomendaciones del fabricante.
6. Determinar la pureza por citometría de flujo o microscopía.

La disección de los tejidos murinos de la interfaz materno-fetal se muestra en la Figura 1; Este procedimiento incluye la apertura de la cavidad peritoneal (Figura 1A, B), cuernos uterinos (Figura 1C), incluyendo los sitios de implantación (Figura 1D), y la colección de los tejidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), y los tejidos deciduales (Figura 1G) a 16,5 dpc. La Figura 2 muestra la morfología de los macrófagos aislados (F4 / 80 +) obtenida de los tejidos uterinos y deciduales en 16,5 dpc utilizando la clasificación de células magnético. Macrófagos aislados mantienen la capacidad de liberar citoquinas (datos no mostrados). El rendimiento de células viables aisladas a partir de la decidua, útero y placenta se muestra en la Figura 3, y la viabilidad celular es mayor que 70% en todos los tejidos. La Figura 4 muestra la estrategia para el análisis de gating polymorphonucle leucocitos ar y mononucleares dentro de los singletes y puertas de viabilidad, incluyendo las células T (CD45 + CD3 +), neutrófilos (CD45 + Ly6G +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), células dendríticas (CD45 + CD11c +), y células NK (CD45 + CD49b +) a 16,5 dpc. Una alta proporción de macrófagos CD11c co-expresa. La Figura 5 muestra los neutrófilos, macrófagos y células T en el decidual, uterino, y tejidos placentarios en 16,5 dpc. La Figura 6 muestra la estrategia de gating para el análisis de los linfocitos dentro de los singletes y puertas de viabilidad, incluyendo las células T (CD45 + CD3 +) y células B (CD45 + B220 +) en 16,5 DPC. Las células T incluyen células T CD4 + y CD8 +. Tejidos murinos en la interfase materno-fetal también incluyen CD3 + CD4-CD8 (células T gamma-delta) en altas proporciones. La Figura 7 muestra las células T y las células B en el decidual, uterino, y tejidos de la placenta en 16,5 dpc.

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Figura 1. disección de tejidos. Cuernos (A) uterinos en 16,5 dpc en un ratón B6. Los cuernos uterinos se unen a la mesenterio y los vasos de drenaje. Cuernos (B) uterinos disecados de mesenterio y todavía unidos al cuello uterino. cuernos (C) uterinos, incluyendo los sitios de implantación y cuello uterino. (D) La disección de un sitio de la implantación. (E) La disección de los tejidos uterinos de la zona de implantación. (F) La separación de la placenta y decidua desde el sitio de implantación. (G) Desprendimiento de la decidua (capa gris-blanco) de la placenta. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Los macrófagos aislados de tejidos deciduales y uterinos. Los macrófagos (F4 / 80 + células) aislado de los tejidos deciduales y uterino en 16,5 DPC utilizando la clasificación de células magnético. Magnificación 20X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La viabilidad de las células aisladas. Las células viables (células DAPI- representados con flechas) aisladas de decidual, de útero, y los tejidos placentarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Estrategia de apertura de puerta de polimorfonucleares y mononucleares de leucocitos. Población total de leucocitos fue cerrada en los interiores y puertas de viabilidad. Células células T (CD45 + CD3 +), los macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), neutrófilos (CD45 + Ly6G +), células dendríticas (CD45 + CD11c +) y NK (CD45 + CD49b +) fueron cerrada dentro de la puerta total de leucocitos ( CD45 +). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Células Figura 5. Los neutrófilos, macrófagos, y células T en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Los neutrófilos (CD45 + Ly6G +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), y T (CD45 + CD3 +) fueron cerrada dentro de la viabilidad y puertas en aislado decidual, de útero, y las células placentarias total de leucocitos (CD45 +).tps: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. estrategia de apertura de puerta para los linfocitos. Mononucleares células fueron cerrada dentro de los interiores y puertas de viabilidad. Células T (CD3 +) y células B (B220 +) fueron cerrada dentro de la puerta de la viabilidad. Las células T CD4 + y CD8 + fueron cerrada dentro de la puerta de las células T (CD3 +). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. subpoblaciones de linfocitos en los tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Las células T (CD3 +)y células B (B220 +) fueron cerrada dentro de la puerta de la viabilidad en aislado decidual, uterino, y células de la placenta. Las células T CD4 + y CD8 + fueron cerrada dentro de la puerta de las células T (CD3 +). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Lista de los anticuerpos utilizados para leucocitos subconjunto inmunofenotipado

La recogida de datos consistentes que registra las características de abundancia y fenotípicas de los leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal es esencial para la comprensión de la patogénesis de las complicaciones relacionadas con el embarazo. Varias técnicas se han descrito que facilitan el aislamiento de la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal durante el embarazo ^{31,38,39,43-46.} Sin embargo, cada técnica es diferente, utiliza enzimas o combinaciones de enzimas diferentes, requiere diferentes momentos de disociación, no especifica cantidades de tejido, y, lo más importante, no siempre especificar la viabilidad de las células aisladas. El protocolo se describe en este documento permite el aislamiento de la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal con alta viabilidad, y proporciona información detallada sobre los reactivos comerciales, la preparación de amortiguamiento, cantidades de tejido, y los tiempos de incubación validado en ellaboratorio.

Uno de los pasos más críticos del proceso de aislamiento de leucocitos es la disociación de tejido; este paso implica la homogeneización mecánica y / o reacciones enzimáticas que puede alterar la integridad de las proteínas extracelulares utilizados en la caracterización fenotípica ^47. El protocolo descrito en el presente documento ofrece un nuevo enfoque que combina el uso de técnicas de disociación de tejidos mecánicos y enzimáticos suaves para preservar la integridad de los marcadores extracelulares en los leucocitos aislados de la placenta y los tejidos uterinos deciduales y de ratones.

Enzimas y combinaciones de diferentes enzimas individuales se han utilizado para aislar la infiltración de leucocitos de los tejidos murinos en la interfase materno-fetal ^31,32,39,44. En muchos casos, estas enzimas que se preparan a concentraciones específicas a mano en el laboratorio pueden estar sujetos a errores humanos. Aquí, en cambio, una colagenasa purificada / prot neutral-listo para el usoaliviar cóctel, Accutase, se ha implementado en el laboratorio; como una preparación de enzima comercialmente disponible, se ha demostrado proporcionar resultados fiables en cultivo celular ^48. Esta solución enzimática es conocido para separar eficazmente los macrófagos de las placas de cultivo sin raspar y, lo más importante, sin perder superficie antígenos de ^48. Esta enzima preparado también se ha utilizado para procesar la digestión de los tejidos del sistema nervioso humanos y animales, lo que resulta en células aisladas viables que permanecen sostenible durante largos períodos, lo que permite su posterior cultura ^47. Además, esta solución enzimática conserva antigenicidad CD24 en células aisladas de los tejidos del sistema nervioso central ^47. Cuando se compara con Liberase-1, otro cóctel de colagenasa y proteasa neutra, ni Accutase ni Liberase-1 generar agregados de ADN libre; sin embargo, es más suave que Accutase Liberase-1 durante la disociación del tejido ^47. La colagenasa / neutral proteasa cocktail utilizado en este protocolo también ha demostrado la superioridad de la tripsina en la preservación de CD44, una madre del cáncer marcador de superficie celular ^49. Los estudios de este laboratorio han señalado reiteradamente que esta solución enzimática conserva los antígenos de superficie de leucocitos de ratón. De hecho, las diferencias informativos han sido encontrados en la expresión de marcadores extracelulares en los macrófagos (CD11b + F4 / 80 + células), neutrófilos (células CD11b + Ly6G +), las células NKT (+ células CD3 + CD49b), células T (células CD3 +) y B células (células B220 + CD19 +), incluyendo CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, y CTLA4, y en la liberación de citoquinas. Por lo tanto, el método descrito en el presente documento es óptimo para el inmunofenotipo de la infiltración de leucocitos en la interfase materno-fetal en ratones, como se muestra en los resultados representativos.

Una ventaja importante de este método es la determinación simultánea de varios antígenos extracelulares e intracelulares dentro de la puerta de la viabilidad. El tinte más utilizado para desla viabilidad celular Termine es yoduro de propidio (PI); sin embargo, su uso es limitado, ya que sólo se puede utilizar en combinación con FITC. Esto es debido a PI no se puede distinguir adecuadamente de la mayoría de otros fluorocromos excitados por láser azul y rojo ^50. Una solución es utilizar DAPI ⁵⁰ o cualquier otro tinte que es excitado por láser UV pero no por láseres azules y rojos comúnmente utilizados para inmunofenotipo. Este protocolo permite inmunofenotipo de células viables ya que incluye el uso de DAPI ⁵⁰ para las células irreparable o el uso de colorante de viabilidad para las células pueden corregir.

Una segunda ventaja importante del protocolo descrito en este documento es que permite el aislamiento de los leucocitos con un alto rendimiento de células viables. El representante de datos muestra que 70% a 89% de las células aisladas son viables. Esto es de gran importancia ya que este protocolo ha permitido el estudio de las propiedades funcionales de las células aisladas de tejidos murinos en la interfase materno-fetal. Fo el ejemplo, cultivos de los decidua y útero macrófagos y el estudio de la liberación de citoquinas bajo estimulación se han realizado con este método.

Para lograr resultados exitosos, la aplicación del protocolo descrito es importante al considerar los siguientes factores: 1) la recogida de tejidos debe realizarse dentro de 5 a 10 minutos después de la apertura de la cavidad peritoneal, y estos tejidos debe ser colocado en hielo para preservar la viabilidad de las células aisladas; 2) homogeneización mecánica del tejido debe realizarse con unas tijeras de punta fina y no puede exceder de 2 min desde períodos más largos se han demostrado para reducir el rendimiento de células viables; 3) la duración de la incubación con la solución enzimática debe ser inferior a 1 hr ya que su actividad disminuye después de este período de tiempo; 4) la temperatura de la incubación con la solución enzimática debe mantenerse a 37 ° C para obtener la actividad óptima de este cóctel de enzimas; 5) manip sedimento celularulación debe hacerse suavemente con micropipetas porque el uso del vórtice puede dañar la integridad de las células (células aisladas son diferenciados y manipulación brusca puede reducir fácilmente su viabilidad); 6) tampón y las temperaturas de centrífuga deben mantenerse a la misma temperatura que la suspensión de células; 7) las células aisladas se deben procesar inmunofenotípica o utilizados de inmediato como su viabilidad reduce rápidamente; y 8) al realizar la inmunofenotipificación, las muestras deben ser adquiridos usando un citómetro de flujo inmediatamente para mejores resultados.

Una limitación de este protocolo es el costo de la solución enzimática, que es más caro que otras enzimas con funciones similares, por ejemplo, tripsina, dispasa II, y colagenasa. Sin embargo, las ventajas que esta solución enzimática muestra por encima de las enzimas descritas son superiores.

Además inmunofenotipo y cultivo celular y la clasificación, las futuras aplicaciones de este protocolo son numerous y variada. Por ejemplo, ahora es posible determinar la metilación del ADN, la expresión de genes diana, en funcionalidad vitro de leucocitos (por ejemplo, ensayos, fagocitosis, citotoxicidad, la proliferación de células T y de plasticidad, etc.), y la producción de especies reactivas del oxígeno en los leucocitos aislados a partir de tejidos murinos en la interfase materno-fetal. De hecho, puede ser también realizó descripción de nuevas y raras leucocitos en tejidos murinos en la interfase materno-fetal.

Los autores describen ningún conflicto de intereses.

NGL fue apoyado por la Iniciativa Universitaria Perinatal Wayne State en maternas, perinatales y Salud Infantil. Agradecemos Maureen McGerty y Amy E. Furcron (Wayne State University) por su lectura crítica del manuscrito.