Instrumentação de Perto prazo Sheep Fetal para multivariadas crônicas não-anestesiados Recordings

O modelo de fetos de ovelhas não-anestesiado cronicamente instrumentados é usado para estudar o desenvolvimento fetal humano na saúde e na doença, pois permite a colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, coleta de sangue repetitivo, injeção de substância, a gravação da atividade bioelétrica, e in vivo de imagens. Nós descrevemos os procedimentos necessários para estabelecer este modelo.

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as endotoxins, bacteria, umbilical cord occlusions, hypoxia and various pharmacological treatments. The life-saving clinical practices of glucocorticoid treatment in fetuses at risk of premature birth and the therapeutic hypothermia have been developed in this model. This is due to the unique amenability of the non-anesthetized fetal sheep to the surgical placement and maintenance of catheters and electrodes, allowing repetitive blood sampling, substance injection, recording of bioelectrical activity, application of electric stimulation and in vivo organ imaging. Here we describe the surgical instrumentation procedure required to achieve a stable chronically instrumented non-anesthetized fetal sheep model including characterization of the post-operative recovery from blood gas, metabolic and inflammation standpoints.

Uma variedade de modelos animais existem para o estudo de ambas as gravidezes normais e comprometidos, incluindo roedores de laboratório, primatas não humanos e animais domésticos. ^1,2,3,4,5 As ovelhas cronicamente instrumentadas grávida tem sido amplamente utilizado há 50 anos como um modelo de desenvolvimento fetal humano e respostas a estímulos fisiopatológicos como lipopolissacarídeo (LPS). ^6-10 As lesões após exposição LPS imitar exatamente o que é visto em prematuros com leucomalácia periventricular, que é devido a um perfil de maturação similar de ambas as espécies. ^{11, 12}

Outras complicações na gravidez também têm sido estudadas em grande detalhe, como a descoberta de que os glicocorticóides pré-natais promover o desenvolvimento pulmonar ^13-15 e compreender o impacto da restrição de crescimento intra-uterino (CIUR) sobre o feto ^16,17.

O uso extensivo do modelo de ovelha fetal é devido ao unique receptividade da ovelha fetal não-anestesiado para a colocação cirúrgica e manutenção de cateteres e eletrodos, permitindo a amostragem de sangue repetitivo, registro da atividade bioelétrica, aplicação de estimulação elétrica e em imagens do cérebro vivo. ¹⁸ Telemetry também é possível, embora utilizado com menos freqüência Ainda, devido à maior sofisticação para configurar, bem como o custo inicial e de manutenção. ¹⁹

Além disso, o modelo de fetos de ovelhas é muito versátil como muitas variações de instrumentação são possíveis, dependendo das medidas de interesse. Por exemplo, é possível gravar mais de dias a semanas sinais multivariados em tempo real, tais como movimentos fetais de respiração, a atividade elétrica do cérebro, as respostas cardiovasculares, eletrocardiograma, o fluxo sanguíneo regional para uma gama de órgãos usando sondas de fluxo ou microesferas, etc. Graças a Esta versatilidade, uma ampla gama de estudos têm sido realizados, incluindo o desenvolvimento da cardisistema ovascular ^20,21, hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) ^22, o desenvolvimento do cérebro e desenvolvimento ²³ estados do sono, em particular, ^24, os efeitos da hipoxia / asfixia ^25, a hipotermia terapêutica ^26, inflamação ^11/06, combinação de ^{ambos, 27 de} glicocorticóides ^28,29, anti-depressivos ^30, displasia bronco-pulmonar (BPD) ^{31,32, 33,34,35,36,37,38,39} programação fetal ou desenvolvimento de novas modalidades de monitorização fetal antes e durante o parto, para citar apenas algumas áreas de investigação ^40,41,42,43.

O objetivo geral do método apresentado é mostrar implementação básica deste modelo versátil. Ele permite estabelecer uma ampla variedade de protocolos experimentais agudas e crónicas estudo da fisiologia e patofisiologia fetal no integrativa, órgão, níveis celular e molecular.

Cuidados com os animais seguiu as diretrizes do Canadian Council on Animal Care e da aprovação pelo Conselho de Montréal Université on Animal Care (protocolo nº 10 Rech-1560). Informações pormenorizadas sobre materiais e os métodos utilizados são fornecidas na Tabela 1.

1. Anestesia

1. Inserir um cateter de lúmen único numa veia jugular.
2. Sedar o ovelha utilizando acepromazina (Atravet 10 mg / mL) por via intravenosa de 2 mg cerca de 30 minutos antes da indução da anestesia, a fim de reduzir o stress associado com o procedimento que por sua vez reduz os níveis de cortisol.
3. Administrar o diazepam (diazepam 5 mg / mL) 20 mg, cetamina (Ketalar 100 mg / mL), 4-5 mg / kg e de propofol (10 mg de propofol / mL) 0,5 a 1 mg / kg por via intravenosa para induzir a anestesia geral.
4. Inserir um cateter para a permuta das vias aéreas na traqueia usando um laringoscópio com uma lâmina tipo de Wisconsin (extra-longa 350 mm canhoto Blade) para ajudar com a intubação. Deslize o tubo endotraqueal de silício (diâmetro de 9 a 12 milímetros Inner) fora do cateter de permuta das vias aéreas e na traquéia. Esta técnica facilita o processo de intubação. Inflar o manguito do tubo endotraqueal com cuidado para evitar a ulceração induzida pela pressão da traqueia e fixar o tubo na cabeça da ovelha.
5. Conecte o tubo endotraqueal para o circuito respiratório do aparelho de anestesia e começar a ventilação mecânica imediatamente. Ajuste as configurações do ventilador para manter um _P a CO ₂ dentro dos limites normais de 35 a 45 mmHg.
6. Inserir um cateter na artéria auricular (22 a 20 g; 1 em [0,9 x 25 mm] de 1,16 em [1,1 x 30 mm]) e ligar a tubagem não conforme a monitorar a pressão sanguínea arterial directa.
7. Use um monitor multi-parâmetro fisiológico para gravar o eletrocardiograma, pressão arterial direta sangue, saturação de oxigênio _(SpO2), capnografia _(P ET CO _{2) e} temperatura a cada 5 minutos. Transferir todos physiologic dados através de um cabo serial para um computador de coleta de dados fisiológicos central. Manter a temperatura corporal normal, usando um cobertor de água circulante.
8. Administrar uma solução de poli-iónico equilibrada em 10 mL / kg para a primeira hora de anestesia geral e, em seguida, reduzir até 5 ml / kg / h.
9. Administrar trimetoprim-sulfadoxina 5 mg / kg IV da ovelha imediatamente antes da incisão da pele como profilaxia antibiótica.
10. Use técnicas assépticas standard, com todas as manipulações cirúrgicas do ewe e do feto.
11. Barreira enfermeira das ovelhas em todos os momentos. Isso inclui também o pessoal não-cirúrgicos. Isso irá minimizar o potencial enzoótica para, por exemplo, Coxiella burnetii. Use luvas e máscaras N-95 (tipo) em todos os momentos.

2. Visão geral do procedimento cirúrgico

1. Faça uma incisão na linha média 20 centímetros através da parede abdominal inferior imediatamente cranial ao úbere através da linha alba para minimizar o dano muscular abdominal.
   1. Retract omento maior cranial e os cornos uterinos são apalpadas manualmente. Palpe cada trompa do corpo do útero para a ponta do corno de notar o número de feto e a sua dimensão. Se houver mais do que um feto, escolher o feto maior avaliando manualmente o tamanho da cabeça e a largura entre as órbitas.
   2. Segure a cabeça do feto escolhido firmemente através do útero parcialmente exteriorizado. Executar um 10 centímetros hysterotomy na grande curvatura com uma tesoura Metzenbaum. Colocar imediatamente sobre a cabeça uma luva cirúrgica de látex não-estéril cheio com uma solução salina esterilizada, como se fosse uma mão. Como alternativa, use 4x4 umedecido para manter a cabeça fetal úmido. Prenda o útero para a parede abdominal.
      1. Exteriorizar a direita e esquerda membros torácicos e puxe delicadamente o feto fora do útero até o processo xifóide.
   3. Insira cateteres de polivinilo na veia direita e braquial esquerda e artérias utilizando uma técnica de corte-down padrão. Insira another polivinil cateter na cavidade amniótica fixando sua extremidade para o esterno do feto.
      1. Utilize apenas cateteres estéreis. Recomendamos a esterilização de gás em sua instalação padrão. Prenda cada cateter para uma agulha e a agulha de uma torneira de passagem dupla para permitir a coleta de sangue mais tarde ou monitoramento de pressão.
   4. Suturar eletrodos de aço inoxidável para o manúbrio, apêndice xifóide e para cada ponto do ombro para monitorar o eletrocardiograma (ECG).
   5. Retorne o feto no útero. Todos os cateteres e eletrodos de saída através de uma pequena incisão no flanco esquerdo.
   6. Feche a incisão laparotomia usando um encerramento de três camadas. Sutura da parede abdominal com uma sutura absorvível monofilamentos sintéticos USP 2 de forma contínua simples. Feche o espaço subcutâneo com uma sintética trançada fio absorvível USP 0 de forma contínua simples. Use grampos aço inoxidável cirúrgico para fechar a incisão na pele.
2. Descrição detalhada do procedimento cirúrgico
   1. Remover lã raspando o processo xifóide até a glândula mamária e ao longo da dobra do flanco de cada lado com uma lâmina # 40. Limpe o abdômen ventral depois completamente, com um gluconato de clorexidina 4% e uma escova macia para 3 min.
      1. Execute um matagal estéril padrão com gluconato de clorexidina 4% a partir do centro do abdômen e progredir de forma centrífuga para 3 min. Pour salina esterilizada sobre o abdómen para remover o sabão desinfectante. Para o passo final da preparação cirúrgica, executar três passagens alternadas de solução de gluconato de clorexidina a 2% e álcool isopropílico a 70%.
   2. Garantir a profundidade da anestesia é adequada antes da incisão. Faça uma incisão de laparotomia padrão a partir do umbigo para apenas craniano para o úbere através da linha alba para minimizar o dano muscular abdominal.
   3. Insira uma longa pinça de esponja no abdome ao longo da parede esquerda para cima abdominalpara o local de saída prevista para cateteres na região paracostal.
      1. Empurre as pontas das pinças contra a parede até que um assistente pode localizá-lo e confirmar o local apropriado. Abra ligeiramente (1 cm) das garras da pinça e deixar o assistente de fazer um 2 cm incisão de espessura total.
      2. Exteriorize as pontas das pinças através da incisão, abrir de novo, suavemente e agarrar os cateteres com os fórceps que finalmente é puxado para fora do abdómen através da incisão abdominal ventral. De nota, alguns grupos implantar os cateteres e, em seguida, exteriorizar-los. Isto tem a desvantagem de que a monitorização do ECG fetal intracirúrgico não é possível.
   4. Palpar o útero para determinar a posição fetal e números. Determine o maior feto usando a distância inter-aural. Inciso parede uterina na grande curvatura ao longo do dorso da cabeça, evitando-se os cotilédones.
      1. Inserir uma cânula de extremidades cegas através das membranas da placenta para obter um amamostra de fluido niotic livre de hemorragia. Inciso as membranas da placenta, utilizando uma tesoura.
   5. Exteriorizar a metade craniana do feto através dessa incisão. Coloque uma luva cirúrgica de látex não estéril cheio com solução salina estéril a 37 ° C ao longo da cabeça do feto para ajudar a manutenção da temperatura.
      1. Durante a remoção da parte superior do corpo do feto a partir do útero, têm o assistente realizar-se da Babcock para evitar a perda de líquido amniótico. Em seguida, novamente usando uma pinça Babcock, fixar as membranas fetais e a parede uterina para a pele para evitar a contaminação abdominal com líquido amniótico.
      2. Expor apenas as partes do corpo fetal que precisam ser instrumentada e manter as partes restantes dentro do útero ou coberto por panos esterilizados húmidos e quentes (37 ° C), respectivamente.
   6. Abduzir ambos os membros torácicos para facilitar a exposição à artéria e veia braquial bilateralmente. Inciso ao longo do aspecto medial de ambos antebraço e cuidadosdissecar completamente em torno da artéria braquial e veia.
   7. Insira cateteres de polivinilo na direita e artéria braquial esquerda ea veia braquial esquerda utilizando uma técnica de corte-down padrão.
      1. Livre o navio a ser cateterizada a partir de tecido adjacente mais de 1 cm. Ligadura da porção distal do vaso com uma sutura absorvível sintético trançado USP 2-0. Preplace uma ligadura no aspecto proximal da embarcação, mas mantê-lo desatado.
         1. Com uma tesoura de Castroviejo, cortar transversalmente o recipiente a aproximadamente 30% do seu diâmetro. Pare o fluxo sanguíneo parcialmente, puxando o fio de sutura proximal. Inserção do cateter numa direcção proximal.
      2. Insira o cateter de polivinil até 8 cm proximal ou até resistência é detectada e, em seguida, puxe ligeiramente para trás. Temporalmente fixar o aspecto proximal do cateter utilizando uma pinça vascular. Coloque um outro fio de sutura em torno de ambas as extremidades proximal e distal do cateter. Um assistente é continuamente aspirating e lavagem do cateter para assegurar a desobstrução do catéter.
      3. Feche a pele fetal usando um USP 2-0 trançado fio absorvível sintético, com um padrão de sutura contínua.
   8. Para a direita e ombro esquerdo, manubrium e apêndice xifóide, fixar um eléctrodo de aço inoxidável isolado para facilitar o acompanhamento do ECG fetal.
   9. Suturar a pressão amniótico e cateter de amostragem para o esterno. Este cateter é fenestrado na sua extremidade.
   10. Proteger todos os cateteres no dorso do feto utilizando um material de sutura absorvível trançado sintético USP 2-0.
   11. Antes da substituição do feto de volta para o útero, administrar clenbuterol 30 ug IV lentamente durante 15 minutos para evitar a hipotensão e para proporcionar relaxamento uterino.
   12. Suturar as membranas fetais utilizando USP 4-0 material de sutura absorvível sintético trançado com um padrão contínuo. Incorpore apenas um cateter ou eletrodo de cada vez para os closure para garantir um fecho estanque. Use um padrão de camada dupla Cushing respeitando princípios Halsted para fechar a camada muscular do útero usando um USP 0 trançado material de sutura absorvível sintético. Enterrar os nós cirúrgicos cuidadosamente.
   13. Usando um padrão de sutura em bolsa, proteger todos os cateteres e cabos de ECG como eles saem da incisão paracostal esquerda.
   14. Usando um monofilamentos sintéticos materiais USP 2 sutura absorvível garantir a linha alba com um padrão contínuo. Feche os tecidos subcutâneos usando USP 2-0 trançado material de sutura absorvível sintético com um padrão contínuo. Fixe a camada de pele com grampos cirúrgicos.
   15. Administrar 250 mg de ampicilina por via intravenosa, e mais uma vez através do cateter para dentro da cavidade amniótica amniótico. Repor os líquidos perdidos com soro fisiológico amniótico quente.
   16. Coloque todos os cateteres exteriorizados e eletrodos de ECG em um saco de lugar para manter a esterilidade. Coloque uma meia ao redor do tronco da ovelha para garantir toda a uma cateteresd eléctrodos ao corpo de ovelha.
   17. Pare de anestesia geral, e extubação a ovelha uma vez reflexos de laringe ter retornado ao normal.
   18. Retorne a ovelha para uma gaiola metabólica, uma vez que ela é estável após anestesia geral. A ovelha residirá na gaiola metabólica para a duração da experiência. A ovelha deve ser capaz de ficar de pé, deitar-se e comer ad libitum enquanto monitora o feto não-anestesiados sem sedativo a mãe.
   19. Para os três dias seguintes, administrar antibióticos prof ilacticamente para a ovelha (Trimetoprim sulfadoxina 5 mg / kg) e o feto (250 mg de ampicilina por via intravenosa, e mais uma vez através do cateter amniótico).
   20. Avaliar o estado metabólico de ambos ovelha e feto utilizando análises de sangue de gás.
   21. Lave todos os cateteres com o volume mínimo de solução salina heparinizada possível. Cuidado - não exceder a dose diária de heparina e fluidos admissível para o feto. É possível ao fluido sobrecarregar o feto. Lave lentamente uma vezum dia ~ 5 mL de NaCl por linha após profilaxia antibiótica.
3. Gravação e análise de dados
   1. Durante a cirurgia, opcionalmente, gravar os ECG e coração taxas maternas e fetais, assim como a pressão arterial materna e pressão nas vias aéreas (Paw) continuamente (Figura 1). Use a janela do monitor de vida para adquirir todos os dados maternos, exceto ECG. Alimentar estes dados em conversor analógico-digital, juntamente com sinais de ECG fetais e maternos; passar ECG materno e fetal pela primeira vez em 1901 pré-amplificador. Gravar e exibir todos os dados no software do fabricante.
   2. Tome um mL da amostra arterial 1 simultaneamente a partir da ovelha e do feto para gasometria arterial, lactato, glicose e do excesso de bases determinação (no plasma) no início da cirurgia fetal (imediatamente após a inserção do primeiro cateter arterial), após o encerramento do útero .
   3. Durante a recuperação pós-operatória, dê uma amostra de 3 ml de sangue fetal para medir a IL-6 e TNF-α inflammperfis Atory. Centrifugar o plasma a 4 ° C (4 min, 4000 xg), decanta-se o plasma e armazena-se a -80 ° C para subsequente ensaio ELISA.
      Nota: Para a finalidade de os resultados representativos relatados, seis dias após a cirurgia, os animais foram sacrificados com uma injecção intravenosa de pentobarbital de sódio a 20 mL. Crescimento fetal foi avaliada por corpo, do cérebro, fígado e pesos maternos. A duração do período experimental irá obviamente variar, dependendo do desenho escolhido para a questão de pesquisa particular e pode atingir ~ 6 semanas.
4. Análises de citocinas (etapa opcional)
   1. Determinar as concentrações de citocinas (IL-6, TNF-a) no plasma utilizando um sanduíche específicas de ovinos ELISA. Anticorpos anti-ovelha monoclonais Pré-revestimento de ratinho (anticorpo de captura da IL-6) ou um rato anticorpo monoclonal anti-bovino (TNF-α) a uma concentração de 4 ug / ml em placas de ELISA a 4 ° C para S / N, depois 3 vezes lava-se com tampão de lavagem (0,05% de Tween 20 em PBS, PBST).
   2. Bloquear as placas durante 1 h com 1% de BSA em PBST. Lavam-se as placas com tampão de lavagem 3 vezes.
   3. Use proteínas recombinantes ovinos (IL-6, TNF-a) como padrão de ELISA, preparar uma série de diluições de padrão 1 variar de 2,000 ng / ml a 7 padrão de 31,25 pg / ml.
   4. Carga de 50 ul de padrões de proteína diluídas em série e as amostras por poço e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente, lavar as placas 3 vezes. Execute todos os padrões e amostras em duplicata.
   5. Aplicar 50? L de anticorpos policlonais anti-ovelha de coelho (anticorpo de detecção de IL-6) ou anticorpo policlonal de coelho anti-bovino (TNF-a), a uma diluição de 1: 250 em poços e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Lavam-se as placas com tampão de lavagem 5 vezes.
   6. Adicionar 50 ul de cabra anti-IgG de coelho-HRP conjugado (diluição 1: 5000) durante 30 min.
   7. Incubar com 50 ul de solução de substrato TMB por poço.
   8. Parar a reacção de desenvolvimento de cor no momento desejado, com 25 ul de ácido sulfúrico 2N.
   9. Leia o plates de ELISA leitor de placas a 450 nm, com uma correção de comprimento de onda de 570 nm.
      Nota: Nos nossos ensaios, a sensibilidade de IL-6 ELISA foi de 16 pg / ml, a sensibilidade de ELISA foi de 13,9 pg / ml, respectivamente TNF-a. Para todos os ensaios, os intra-ensaio e inter-ensaio coeficientes de variância foi <5% e <10%, respectivamente.
5. analises estatística
   Nota: Os métodos estatísticos exatos dependerá da questão de pesquisa. Aqui relatamos os métodos utilizados para testar quaisquer diferenças significativas nos gases sanguíneos relatados na Tabela 2.
   1. Teste distribuição normal dos dados através do teste de Kolmogorov-Smirnov seguido por testes paramétricos ou não paramétricos com ajuste para múltiplas comparações, conforme o caso.
   2. Use K-significa análise de cluster para identificar os fetos na coorte que foram espontaneamente hipóxica e determinar as respectivas pO ₂ e O _{2 valores} Sat (considere _PO 2 <20 mmHg ou _O 2 Sat <55% como fetal hipoxia). ^44-48
   3. Use o software estatístico SPSS, como para as análises.
   4. Apresentam dados como média ± SD com diferença estatística em p <0,05 considerado significativo.

38 ovelhas datado de tempo grávidas foram instrumentados em 128 ± 2 dias de gestação (DGA, ~ 0,88 gestação, termo 145 DGA) com arterial, venosa e cateteres amniótico e eletrocardiograma (ECG) eletrodos com técnica estéril sob anestesia geral (tanto ovelha e feto ). Em caso de gravidez duplo o feto maior foi escolhido com base na palpação e estimar o diâmetro inter-temporal; alternativamente, o feto deve ser instrumentado podem ser selecionados aleatoriamente para evitar qualquer viés potencial ou ambos os fetos podem ser instrumentado. A duração total do processo foi de 124 ± 27 min. A porção da parte superior do corpo fetal a ser instrumentada permaneceram fora do útero por 92 ± 19 min. A maioria das ovelhas foram instrumentados animais F2. Sua mãe era F1 (Border Leicester * Romanov) eo pai era um carneiro Hampshire; eles foram cruzadas como se segue: Hampshire (50%) - Border Leicester (25%) - Romanov (25%) = HABLRV.

Representante materna e fetal fisiológicacaracterísticas durante a cirurgia e instrumentação são mostrados na Figura 1 e foram dentro da norma fisiológico para a idade gestacional do feto e comportamento maternal durante a anestesia.

Os pesos materno em média de 75 ± 11 kg e 21 para fora de 38 gémeos realizadas (isto é, a uma taxa de 1,6 ± 0,5). No momento da necropsia (134 ± 3 DGA), entre os fetos singletons instrumentados pesava 4.090 ± 800 g, enquanto o peso dos gêmeos foi menor em 3300 ± 740 g (p = 0,003). O peso de gémeos adição de instruções em 3.300 ± 670 g foi semelhante ao peso dos gémeos instrumentados (p = 0,78). 18 dos fetos instrumentados eram do sexo feminino e 20 eram do sexo masculino.

A dinâmica dos gases no sangue arterial fetal, estado de glicose e ácido-base durante a cirurgia e recuperação pós-operatória são apresentados na Tabela 1. Observou-se uma recuperação gradual do estado ácido-básico fetal e uma deterioração moderada de oxigenação com pouca mudança em glucose e eletrólitos de dias de pós-operatório de 1 a 3. Em particular, no dia de pós-operatório 3, 42% dos fetos foram encontrados para ser espontaneamente hipóxica com _pO 2 arterial de 11 mmHg e de _O 2 Sat, de 28%. O cluster normóxica fetal _pO 2 foi centrada em 22 mmHg e _O 2 Sat em 56%. Fetos gêmeos não eram mais do que hipóxico fetos únicas (p = 0,26).

Arterial fetal IL-6 ELISA rendeu valores abaixo do limiar de sensibilidade de 16 pg / ml durante o período de recuperação pós-operatória. Do mesmo modo, os níveis de TNF-α também permaneceu inalterada e muito baixo em 29 pg / ml com ~ 30% dos animais mostrando também os valores abaixo do limite de sensibilidade de 13,9 pg / ml durante o período de recuperação pós-operatória.

Figura 1. monitoramento materno e fetal intraoperatório. FHR, coração fetal taxa in batimentos por minuto (bpm); FECG, electrocardiograma fetal (V); PATA, pressão positiva materna (mmHg); PSM, a pressão de sangue arterial materno (mmHg); MHR, freqüência cardíaca materna (bpm); mECG, ECG materna (V). O eixo X é a escala de tempo no formato hh: mm:. Ss Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. espontânea fetal hipóxia e peso corporal. Nenhuma relação entre o peso corporal fetal e _pO 2 arterial no dia pós-operatório 3 foi detectado (Spearman R = 0,326, p = 0,161). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Tabela 1. Específico Reagentes / Equipamentos.

Por favor, clique elere para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2. visão completa do sangue fetal gases, metabolitos e eletrólitos durante a cirurgia e recuperação pós-operatória. Fetal pH do sangue arterial, _PCO 2 (mmHg), _pO 2 (mmHg), saturação de oxigênio (O _{2 Sat%),} glicose (mg / dL), lactato (mmol / L) e excesso de base (mmol / L) em vários momentos da instrumentação e recuperação períodos: início da cirurgia fetal imediatamente após a instalação do primeiro cateter arterial fetal (útero aberto), o fim da cirurgia fetal (útero dia fechado), no pós-operatório de 1 a 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O anestésico e procedimentos cirúrgicos que são apresentados são necessários para o estabelecimento de um modelo animal para o estudo da fisiologia e patofisiologia fetal: as ovelhas não anestesiados fetal cronicamente instrumentadas.

Quatro passos críticos no âmbito do protocolo deve ser enfatizada. Em primeiro lugar, passando os cateteres e eletrodos através do flanco materno: é importante que isso seja feito de uma só vez para evitar quaisquer lesões em órgãos internos. Em segundo lugar, fixando o local de operação uterotomia antes para exteriorizar o feto: este é crucial para evitar ou minimizar a perda de líquido amniótico e subsequente sutura da membrana amniótica antes do fechamento uterino. Cateterismo terceiro, arterial: artérias fetos de ovelhas são cerca de 1-2 mm de diâmetro e, portanto, não é difícil de cateterização para um cirurgião experiente; uma equipe de dois cirurgiões executa melhor e mais rápida nesta tarefa que ajuda a economizar tempo para minimizar o comprimento total do procedimento. Em quarto lugar, sec cuidadosaurante e organização de todos os cateteres e eletrodos na cavidade amniótica antes de devolver o feto dentro do âmnio e fechar o útero: o que ajuda a evitar a remoção acidental dos cateteres ou rasgar dos eletrodos de ECG devido a movimentos materno-fetais após a cirurgia.

Em vez da abordagem aqui apresentada a cateterização vasos braquial, carótida ou femoral, também pode ser usado. A escolha depende da abordagem geral instrumentação que por sua vez irá ser ditada pelo desenho do estudo. Recomenda-se minimizar o tempo passa o feto para fora do útero e para minimizar a extensão na qual o feto precisa de se manter fora do útero a ser instrumentada. Estas considerações levaram à escolha dos vasos instrumentados apresentado na "abordagem mínima". Recomendamos artérias cateterização de ambos os lados para permitir a monitorização da pressão arterial intra-arterial e coleta de sangue arterial, sem interferência mútua em todo tele experimentar. Uma vantagem adicional é a redundância fail-safe esta abordagem introduz: no caso de uma artéria não ficar bloqueado durante o período experimental, amostragem e monitorização de pressão são possíveis a partir do mesmo navio com o inconveniente de interromper o monitoramento quando a amostragem de sangue é feito.

Há três limitações que impedem uma adaptação mais ampla deste modelo animal. Estas limitações podem ser visado por algumas modificações sugeridas abaixo. Primeiro, é a exigência de nível de biossegurança 2 confinamentos em algumas jurisdições. Isto é devido a um risco de infecção por Coxiella burnetii de ovelhas grávidas em humanos com um sistema imunitário enfraquecido. ^49,50 A vacinação está disponível para os animais e os seres humanos expostos a diminuir este risco ^51,52 e PCR testes podem ser feitos para garantir que nenhum animais positivos são entregues para o centro de pesquisa da fazenda. Uma solução pode ser a de combinar a vacinação de animais com o teste de PCR múltiplas na fazenda dos swabs vaginais realizadas antes da reprodução começar, antes da entrega e, em seguida, novamente a partir do líquido amniótico durante a cirurgia. Com tais precauções, em algumas jurisdições, o uso de ovelhas em investigação não está limitada, uma vez que é em outros. Em segundo lugar, o custo por animal está no menor intervalo de quatro dígitos, comparável a algumas linhagens knockout murino. Com isto em mente, no entanto, o ganho de informação de cada experimento fetos de ovelhas compara só para os primatas não humanos no que se refere à grande quantidade de dados que podem ser coletados, as perguntas que podem ser feitas e as potencialidades da tradução para o devido humano para o momento do desenvolvimento dos órgãos em ovinos. Em terceiro lugar, há a questão da criação de animais ea disponibilidade de animais durante certas épocas em apenas um ano. Mesmo com o tratamento hormonal, os resultados de reprodução ovelhas como a taxa de gravidez e vitalidade de cordeiros (fetos) são satisfatórios apenas alguns meses em torno de estações de reprodução naturais. ⁵³ Assim, experimentoal programação requer um planejamento cuidadoso com os anos divididos em um outono ea primavera. Uma solução pode ser a criação de um abril a junho experiências », estações de ovinos Setembro-to-novembro e. Este problema também é uma virtude, pois permite tempo para analisar os muitos dados coletados durante cada estação experimental.

Há um número de factores que contribuem para o significado no que diz respeito aos métodos existentes. Os dados morfométricos, cardiovasculares e de gás no sangue apresentados estavam dentro da faixa para as espécies ^54,55 e se assemelham aos da espécie humana ^56, uma grande vantagem deste modelo animal. Uma exceção é a maior taxa de gravidez múltipla em comparação com a geminação humano. ⁵⁷ Este, porém, também é uma virtude do modelo, como estudar os efeitos de geminação no desenvolvimento fetal é uma tarefa importante biomédica. ^55,58,59 níveis muito baixos de pós inflamação-cirúrgica tal como medido por ELISA de TNF-a e IL-6combinada com a recuperação do estado ácido-base indicam que a instrumentação cirúrgica fetal é bem tolerado e o período de recuperação pós-operatória de 72 horas é suficiente para garantir uma condição de linha de base estável da ovelha fetal antes do início de um experimento. Elevada percentagem de espontânea hipóxia crônica moderada em fetos de ovelhas curto prazo torna-os um interessante modelo para estudar os efeitos crônicos da hipóxia pré-natal humano e inflamação no desenvolvimento fetal e perinatal, como por exemplo, CIUR, e insultos perinatais, como inflamação e asfixia aguda. ^60,61,62 Vários modelos RCIU carneiros são usados, alguns depender de hipoxia espontânea, alguns induzindo-o por embolização da placenta, por exemplo. ^16,63-66 Por outro lado, a hipoxia grave antes do início de uma experiência pode também ser um critério de exclusão nos casos em que, por exemplo, sistemas nervosos cardiovasculares ou centrais estão a ser estudada, como aqui as respostas de hipóxia crônica fetos umare conhecido por diferir daqueles que são normóxicas. ⁶⁰ Outra aplicação importante é o estudo de impacto stress materno pré-natal sobre o desenvolvimento fetal e pós-natal. ^5,67 Finalmente, como pode ser visto nas numerosas publicações citadas com este modelo, a instrumentação fetal pode ser feita ao longo de uma vasta gama de idades gestacionais em qualquer lugar de 70 a ~ 135 dGA correspondente a metade da gestação - estudos de curto prazo do desenvolvimento fetal. Com o avanço da idade gestacional, instrumentação de complexidade crescente são possíveis, mas considerações sobre a duração da instrumentação cirúrgica necessidade de ser pesado contra a necessidade de obter um número de gravações multivariados do mesmo feto.

Um número de aplicações futuras muito promissores da técnica apresentada é derivada do número cada vez maior de reagentes de biologia molecular específico do ovelhas e recente seqüenciamento do genoma ovelhas. Estes desenvolvimentos recentes têm promovida esta animal modelo a ser uma abordagem muito promissora e poderosa para a compreensão do desenvolvimento fetal humano, sadio e patológico em várias escalas de organização, de (epi) genoma de fisiologia integrativa ^{68 69-74.}

No disclosures have been made.

authors gratefully acknowledge funding support from the Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR), and Fonds de Recherche du Québec – Santé (FRQS) (to MGF) and CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (to LDD).

The authors wish to thank Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard and Carmen Movila for technical assistance.