Modelo de Rato Induzida fotoquimicamente posterior neuropatia óptica isquémica

O objetivo deste protocolo é para induzir fotoquimicamente lesão isquêmica ao nervo óptico posterior em ratos. Este modelo é fundamental para estudos de fisiopatologia da neuropatia óptica isquêmica posterior e abordagens terapêuticas para essa e outras neuropatias ópticas, bem como de outras doenças isquêmicas do sistema nervoso central.

Neuropatia óptica isquêmica posterior (PION) é uma doença devastador vista na prática clínica. No entanto, sua patogênese e história natural permaneceram mal compreendida. Recentemente, foi desenvolvido um modelo animal fiável, reprodutível e de PION testado o efeito do tratamento de alguns factores neurotróficos ¹ neste modelo. O objetivo deste vídeo é demonstrar o nosso modelo induzida fotoquimicamente de neuropatia óptica isquêmica posterior, e avaliar seus efeitos com marcação retrógrada de células ganglionares da retina. Após a exposição cirúrgica do nervo óptico posterior, um corante fotossensibilizador, eritrosina B, é injectado por via intravenosa e um feixe de raios laser é focado sobre a superfície do nervo óptico. Interacção fotoquímica de eritrosina B e o laser durante a irradiação danos do endotélio vascular, o que levou a oclusão microvascular mediada por trombose plaquetas e compressão edematosa. A lesão isquêmica resultante produz uma gradual mas pronounced morte das células ganglionares da retina, devido a uma perda axonal de entrada - uma unidade remota, induzida por lesão e resultado clinicamente relevante. Assim, este modelo proporciona uma nova plataforma para estudar o curso de patofisiológico PION, e pode ser ainda mais optimizada para o ensaio de abordagens terapêuticas para neuropatias ópticas, assim como outras doenças isquémicas do SNC.

Em pacientes com mais de 50 anos de idade, neuropatia óptica isquêmica (ION) é o tipo mais comum de neuropatia óptica aguda ^2. A condição pode apresentar-se como um dos dois subtipos de acordo com a fonte de abastecimento específico afetado arterial e apresentação clínica: anterior (NOIA) ou posterior (PION) ^3. Embora a patogênese e no curso da AION têm sido estudados extensivamente ^4-7, PION manteve-se mal compreendido, devido à sua baixa prevalência, apresentação variável, critérios diagnósticos mal definidos e falta de um modelo animal. Além disso, não há tratamentos têm sido comprovada para prevenir ou reverter a perda de visão por AION ou PION eficaz. Por conseguinte, um modelo animal fiável e reprodutível de PION é de grande valor para o estudo do processo da doença in vivo e testar novos regimes terapêuticos para a neuroprotecção e regeneração axonal.

Fotoquimicamente induzida lesão isquêmica ao microvasculature resultando em vasogedema ENIC trombose e isquemia de tecido cria efectivamente regionais ^8-12. Após a injeção para a circulação vascular, o corante fotossensível eritrosina B produz o oxigênio molecular singlete reativa depois da ativação por irradiação com laser de navios-alvo. O oxigénio singuleto peroxidizes diretamente o endotélio vascular, estimulação de plaquetas de adesão / agregação e levando à formação de trombo oclusivo. Dano isquêmico é se espalhar para áreas vizinhas e ainda mais exacerbada pela compressão microvascular devido a edema vasogênico. O objetivo geral deste protocolo é para induzir fotoquimicamente isquemia no nervo óptico retrobulbar para espelhar os danos causados ​​por PION.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro modelo de lesão isquêmica no nervo óptico posterior ^1. Como este modelo produz isquemia, evitando trauma físico, os processos fisiológicos de neuropatia óptica isquêmica posterior são melhores imitou e estudou. Além disso, este modelo oferece uma nova plataforma para a seleção de candidatos terapêuticos para neuropatias ópticas e outras doenças isquêmicas do CNS. Aqui, um protocolo detalhado para cateterismo de veia femoral, a exposição do nervo óptico, a injeção intravenosa de Eritrosina B e irradiação com laser em um modelo de rato PION são descritos.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade da Califórnia, San Diego e Universidade de Miami cuidados com os animais institucional e comitês de uso (IACUC) e executadas em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual. Todos os reagentes e instrumentos utilizados em procedimentos cirúrgicos são estéreis.

1. Prepare o Anesthetize e Rat para a cirurgia

1. Antes do procedimento, os ratos são anestesiados com uma injecção intraperitoneal de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg) de acordo com o peso corporal. Profundidade adequada da anestesia deve ser determinada por uma resposta negativa a toe pitada de estímulo.
2. Uma vez anestesiados, puxe a língua para a frente para evitar a asfixia e aplicar pomada lubrificante em ambos os olhos para evitar a secagem das córneas durante a cirurgia.
3. Raspar os locais cirúrgicos, utilizando uma máquina de cortar cabelo e limpe a área três vezes com solução de detergente providone-iodo a 10% e 70% de etanol.
4. Drape tele animais dentro de um campo estéril. Luvas esterilizadas e instrumentos cirúrgicos durante a cirurgia são utilizados sobrevivência. Re-esterilizar as pontas dos instrumentos usando um esterilizador talão quente entre os animais.

2. Abordagem Cirúrgica

1. Indução PION
   1. Cateterização da veia femoral
      1. Preparar e limpar o local cirúrgico. Raspar a parte interna da coxa direita, usando uma máquina de cortar cabelo e limpe a área três vezes cada com uma solução detergente providone-iodo a 10% e 70% de etanol.
      2. Prepara-se o tubo. Corte um comprimento de 40 centímetros de tubo de polietileno (PE 10) esterilizado em etanol a 70%. Lave a tubagem com solução salina e ligá-lo a uma seringa de 1 ml, contendo uma solução pré-medido de 2% de corante eritrosina B (1 ul / mg, obtendo-se uma dose de 20 mg / kg de peso corporal). Montar a seringa numa bomba de infusão de pé-interruptor controlado definido como uma taxa de 600 ul / min.
      3. Usando uma lâmina n º 15, fazer uma pequena incisão horizontal naa base da coxa direita. Corte e espalhar a membrana dentro e limpar a área com cotonetes estéreis.
      4. Separe o músculo com uma pinça até que o ramo da veia femoral é visível. Uma bainha rodeia a artéria, veia e nervo. Beliscar e puxar esta bainha para cima com uma pinça (pinças de ponta fina Dumont), e cortou uma pequena incisão (2-4 mm é geralmente adequada) perto da base da cunha de forma triangular com uma tesoura primavera Vannas. Expandir o corte como necessário.
      5. Separa-se a veia e a artéria com uma micro-cirúrgica romba gancho paralela à direcção da veia. Tenha cuidado para não danificar a membrana e veia ramos delicados. Em seguida, levante gentilmente a veia e separá-lo do tecido conjuntivo subjacente.
      6. Obter um fio de náilon sem agulha e coloque-a ao lado da veia femoral. Usando o gancho micro-cirúrgica, elevar a veia e passar a pinça de ponta fina sob a região distal. Agarrar uma extremidade do fio de sutura e puxá-la debaixo daveia. Ligadura da veia distal com força. Passe uma segunda sutura de um modo semelhante ao abrigo da veia proximal e fazer um nó frouxo.
      7. Faça um pequeno corte na veia perto da ligadura distal com tesoura primavera Vannas. Expandir o buraco, se necessário com a pinça de ponta fina. Um pouco de sangue pode vazar através do corte. Limpe a área cirúrgica com frio, BSS estéril e compressas de algodão estéreis.
      8. Segurando a parede da veia para a borda do corte, o vaso de cateterização com a tubagem lavada com solução salina preparada usando um suporte de agulha. Apertar o nó proximal em torno da veia e tubos. Em seguida, ancorar a tubulação, amarrando-a a sutura distal.
      9. Verifique a qualidade do cateterismo pressionando o pedal para injetar soro fisiológico, <1 ml é adequado. Verifique se o tubo está desobstruída e não tem vazamentos. Temporariamente fechar a incisão com suturas para proteger a cateterismo e tecido.
   2. A exposição do nervo óptico
      1. Prepare o local da cirurgia, limpando a área pré-raspado acima do olho esquerdo três vezes cada com uma solução detergente providone-iodo a 10% e 70% de etanol.
      2. Realizar uma incisão na pele ao longo de 2-3 mm atrás do olho com uma lâmina n ° 15. Aperte e levante o tecido conjuntivo com uma pinça serrilhada, e fazer uma pequena incisão com tesoura primavera Vannas. Esta pequena incisão é geralmente de cerca de 5 mm de comprimento, mas pode ser mais longo para proporcionar uma maior exposição para um cirurgião em formação. Continuar sem rodeios para dissecar através do tecido conjuntivo ao longo da borda superior do osso orbital, tendo o cuidado de não perturbar os vasos sanguíneos. Limpe a área cirúrgica com cotonetes.
      3. Dissecar para baixo através da conjuntiva até que o músculo reto superior é visível. Comprima e dissecar através do músculo; o músculo será liberado de dentro da órbita. Agora, os tecidos circundantes podem ser utilizados para ajudar na elevação da retracção e o olho, para facilidade de visualização.
      4. Rétrato o retalho de pele e tecido conjuntivo lateralmente e para baixo, e mantenha no lugar com uma sutura e hemostática. Isto irá rodar a ocular frente e para fora, a fim de revelar a bainha que contém gordura que circunda o nervo óptico.
      5. Cuidadosamente inserir um par de pinças cortantes e expandir paralelo ao nervo óptico para separar o tecido conjuntivo em torno da bainha. Não toque o nervo óptico com as pontas afiadas das fórceps.
      6. Um comprimento de 5 mm do nervo óptico e a bainha envolvente devem agora ser visível. Uma rede de microvasos na superfície da bainha circunda o nervo óptico. Estes serão o alvo durante a irradiação laser.
   3. A injecção intravenosa de Eritrosina B e irradiação com laser
      1. Usar óculos de protecção de cor laranja em todos os momentos durante a operação do aparelho de irradiação com laser para proteger-se da luz laser verde. Ligue o laser, abrir o obturador e ajustar o pico e média poweRS do laser como necessário. Feche o obturador.
      2. Posicione o rato no aparelho de irradiação laser. Para garantir o posicionamento correcto do feixe, um feixe de mira fraco é produzido por espacialmente filtrando o laser através de um orifício de 100 um de diâmetro perfurados na lâmina do obturador fechado. Re-expor o nervo óptico com um par de pinças de ponta fina, e posicionar o feixe de mira para o nervo óptico intraorbital entre 3 mm e 4 mm por detrás da cabeça do nervo óptico.
      3. Injectar a solução de 2% de eritrosina B através da activação da bomba de infusão. Pode circular durante alguns segundos, enquanto o cirurgião adiciona uma pequena gota de BSS para humedecer a superfície do nervo óptico.
      4. Verifique a posição do feixe de mira e, em seguida, clique na chave de pé para iniciar a irradiação. Um filtro de segurança de cor laranja, que é adicionado para o caminho óptico do microscópio, será desencadeado imediatamente seguido pela abertura do obturador depois de um atraso de 1 segundo.
      5. Irradiar o nervo óptico para 90 segundos com uma potência de pico de 135mW e potência média de 18MW produzida por um corte de feixe rotativo a 250 Hz, com um ciclo de trabalho de 15% (isto minimiza os efeitos térmicos). Fluorescência amarela, laranja brilhante como visualizado através do filtro de segurança, será emitida a partir da superfície superior do nervo óptico e é suficiente para assegurar que o feixe de irradia o nervo simetricamente.
      6. Após a irradiação, o filtro de segurança de cor laranja irá abrir automaticamente. Microhemorragia pode ser observada em alguns casos.
      7. Aliviar a tração sobre os músculos extra oculares e voltar os olhos para uma posição neutra. Feche a incisão com suturas interrompidas. Em seguida, retirar o cateter e amarrar a veia femoral firmemente para evitar fugas; fechar com suturas interrompidas. Aplicar pomada antibiótica para ambas as incisões. Verificar o fundo para verificar a integridade vascular da veia central da retina e na artéria.
2. Labeling retrógradaAs células ganglionares da retina de RGCs (.) NOTA: Para avaliar RGC sobrevivência, marcação retrógrada com Fluorogold (FG) deve ser concluída uma semana antes PION. O método é descrito em detalhe no protocolo JoVE 819 ^13.
   1. Em resumo: anestesiar os animais com cetamina (60 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg) e a cabeça de barbear.
   2. Cirurgicamente esfregar o local da incisão e fazer uma incisão na linha média em toda a cabeça para expor o crânio.
   3. Faça furos bilaterais através do crânio (o 2x2 mm) 0.5 mm de ambas as suturas sagital e transversal.
   4. Aspirar cuidadosamente o conteúdo cerebral que se encontra sobre a superfície dorsal do colículo superior (SC) utilizando uma bomba de vácuo. Em seguida, colocar uma pequena peça de Gelfoam embebido com 4% FG sobre a superfície do SC.
   5. Feche a incisão com suturas e cuidar do animal usando cuidado pós-operatório padrão.
3. Cuidados pós-operatórios e Eutanásia
   1. Após a cirurgia, coloca animal numa gaiola limpa separada no topo de um colchão de água em recirculação aquecida até que o animal é recuperado.
   2. Analgésicos pós-cirúrgicos (HCl buprenorfina, de 0,01 mg / kg) deve ser administrada duas vezes por dia durante três dias consecutivos, para minimizar o desconforto.
   3. Rat devem ser mantidos separadamente e observou até que eles são capazes de manter decúbito esternal e recuperar a consciência suficiente.
   4. Os sinais de recuperação e de boa saúde são monitorados diariamente por pelo menos 5 dias após a cirurgia, ou até a remoção da sutura e cura adequada do local da cirurgia, o que ocorrer mais recente.
   5. Eutanásia os animais por perfusão com PFA 4% em pontos de tempo cientificamente apropriadas após a cirurgia de acordo com o interesse investigativo.

A lesão isquêmica resultante induzida por esta técnica produz uma morte gradual mas pronunciado de células ganglionares da retina após a lesão axonal isquêmico. Este é um resultado clinicamente relevante semelhante à observada na doença humana. Rotulagem retrógrada FG é utilizada para quantificar RGC sobrevivência após PION. O mesmo método é utilizado para validar uma criação modelo bem sucedido, bem como para avaliar os efeitos de diferentes regimes terapêuticos. A Figura 1 mostra imagens confocais representativos de células FG-positivos em montagens planas de retina de controlo (Figura 1A), tratado com sham (laser somente / não eritrosina B, Figura 1B), e 2 semanas pós-PION-tratados (Figura 1C) animais. Em comparação com animais de controlo, menos células FG-positivos estão presentes em animais 2 semanas após a indução PION. Não houve diferença significativa entre o número de CGR no controle e tratamento simulado (laser única / não eritrosina B) animais é observado. This indica que a perda de CGR induzida por PION é induzida pela combinação de eritrosina B e a irradiação com laser, em vez de energia térmica a partir do laser isolado.

Figura 1. células ganglionares da retina (RGC) sobrevivência após posterior neuropatia óptica isquémica (PION). Retrogradamente células ganglionares da retina marcadas com Fluorogold foram fotografadas em montagens planas de retina (AC). Duas semanas após PION, um número semelhante de CGR é observado no controlo (A) e tratado com sham (B, laser somente / não eritrosina B) os olhos. No entanto, o número de CGR marcadas com 'FluoroGold' é marcadamente reduzida na definição de PION (C). Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.

Here we describe in detail a method for inducing PION in a rat model. The most critical part of the protocol is the exposure and irradiation of the optic nerve – to expose the nerve as long as possible while avoiding damage caused by the sharp fine tip forceps or from stretching. In rats, the ophthalmic artery enters the optic nerve ≤1 mm from the optic nerve head. Therefore, irradiation of the optic nerve 3-4 mm away from the optic nerve head should only result in ischemia of the capillaries feeding the nerve, rather than the artery supplying the inner retina. Fundoscopic examination is necessary to ensure the vascular integrity of central retinal artery and vein. With practice, the full surgical procedure can be accomplished in half an hour. And with set parameters for laser irradiation, this model has a reproducible time course of cell death.

As peak intensity and irradiation duration are two determinants of ischemic damage severity, modification of these parameters can be made to adjust the degree of damage for different study aims.

As the first and currently only available animal model for PION, this technique provides a novel platform for research on pathogenesis and molecular changes of PION, and can be used to screen treatment drugs for this and other CNS ischemic diseases.

The authors have nothing to disclose.

Somos gratos a Eleut Hernandez para pecuária, Gabe Gaidosh para perícia microscopia, e Tran Khue e Zhenyang Zhao para edição de vídeo. Este estudo foi financiado pelo National Eye Institute concede R01-EY022129 a JLG e subvenções P30 EY022589 para UCSD e EY014801 a UM; a American Heart Association, a Fundação James e Esther King, o fundo do programa de intercâmbio de estudantes de doutorado da Universidade Fudan Graduate School (No. 2.010.033), e um donativo incondicional da Investigação para Prevenir Cegueira, Inc.