الفئران نموذج الضوئية التي يسببها الخلفي الإقفارية العصبي البصري

والهدف من هذا البروتوكول هو للحث الضوئية الإصابة الدماغية إلى العصب البصري الخلفي في الفئران. هذا النموذج هو حاسم لدراسات الفيزيولوجيا المرضية لالخلفي الاعتلال العصبي البصرية الدماغية، والنهج العلاجية لهذا واعتلال الأعصاب البصرية الأخرى، وكذلك الأمراض الدماغية أخرى الجهاز العصبي المركزي.

الخلفي الدماغية الاعتلال العصبي البصري (PION) هو مرض مدمر البصر في الممارسة السريرية. ومع ذلك، ظلت المرضية والتاريخ الطبيعي مفهومة. في الآونة الأخيرة، وضعنا، نموذج حيواني استنساخه موثوق للPION واختبار تأثير علاج بعض عوامل عصبية في هذا النموذج ^1. والغرض من هذا الفيديو هو إظهار نموذجنا يسببها ضوئية من الخلفي الاعتلال العصبي البصري الإقفاري، وتقييم آثاره مع وضع العلامات الوراء في خلايا الشبكية. بعد التعرض الجراحية العصب البصري الخلفي، صبغة ضيائيا، إريثروزين B، يتم حقن عن طريق الوريد، وتركز شعاع الليزر على سطح العصب البصري. التفاعل الكيميائي الضوئي لإريثروزين B والليزر خلال أضرار أشعة البطانة الوعائية، مما دفع الاوعية الدموية الدقيقة انسداد بوساطة تخثر الصفائح الدموية وضغط ذمي. الإصابة الدماغية الناتجة تؤدي إلى زيادة تدريجية ولكن pronouncإد الشبكية السقم الخلايا العقدية، نظرا لفقدان مدخلات المحاور - جهاز تحكم عن بعد، الناجم عن الإصابة والنتائج ذات الصلة سريريا. وهكذا، وهذا النموذج يوفر منصة جديدة لدراسة دورة الفسيولوجية المرضية من PION، ويمكن أن يكون الأمثل أيضا لاختبار النهج العلاجية لاعتلال الأعصاب البصرية وكذلك الأمراض الدماغية أخرى الجهاز العصبي المركزي.

في المرضى الذين يعانون أكثر من 50 عاما، الاعتلال العصبي البصري الإقفاري (ION) هو النوع الأكثر انتشارا من الاعتلال العصبي الحاد البصرية ^2. الشرط يمكن أن تشكل واحدة من نوعين وفقا لمصدر معين العرض المتضررين الدم والأعراض السريرية: الأمامي (AION) أو الخلفي (PION) ^3. في حين تم دراستها المرضية وبالطبع من AION على نطاق واسع ^4-7، PION وقد ظلت غير مفهومة بسبب الانتشار المنخفض، وعرض متغير، معاييره التشخيصية غير محددة وعدم وجود نموذج حيواني. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت أي علاجات لمنع بشكل فعال أو عكس فقدان البصر من AION أو PION. ولذلك، فإن نموذج حيواني استنساخه وموثوق بها من PION هي ذات قيمة كبيرة لدراسة عملية المرض في الجسم الحي واختبار نظم علاجية جديدة لالعصبية ومحور عصبي تجديد.

الناجم الضوئية الإصابة الدماغية إلى الأوعية الدموية الدقيقة مما يؤدي إلى vasogشبكة naric ذمة وتخثر يخلق فعال الأنسجة الإقليمية نقص التروية ^12/08. بعد الحقن في الدورة الدموية في الأوعية الدموية، وحساس صبغ إريثروزين B ينتج رد الفعل الأكسجين الجزيئي القميص على تنشيط بواسطة أشعة ليزر الأوعية الهدف. الأكسجين القميص peroxidizes مباشرة على بطانة الأوعية الدموية، وتنشيط الصفائح الدموية التقيد / التجميع ويؤدي إلى انسداد تشكيل خثرة. وينتشر الضرر الدماغية إلى المناطق المجاورة وتفاقمت بسبب ضغط الاوعية الدموية الدقيقة بسبب وذمة وعائية المنشأ. الهدف العام من هذا البروتوكول هو للحث الضوئية نقص التروية في العصب خلف المقلة البصرية لتعكس الأضرار الناجمة عن PION.

على حد علمنا، هذا هو النموذج الأول من الإصابة الدماغية في الخلفية العصب البصري ^1. كما ينتج هذا النموذج نقص التروية مع تجنب الصدمات الجسدية، والعمليات الفيزيولوجية للالخلفي اعتلال الأعصاب البصرية الدماغية هي أفضل تحاكي ودرس. أيضا، وهذا النموذج يوفر منصة جديدة للكشف عن العلاجات مرشح لاعتلال الأعصاب البصرية وأمراض نقص تروية CNS الآخرين. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة لالفخذ قسطرة الوريد، تعرض العصب البصري، الحقن في الوريد من إريثروزين B وأشعة الليزر في نموذج PION الفئران.

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من جامعة كاليفورنيا في سان دييغو وجامعة ميامي رعاية الحيوان المؤسسية واللجان الاستخدام (IACUC) وتنفيذ وفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث المرئي. جميع الكواشف والأدوات المستخدمة في العمليات الجراحية ومعقمة.

1. تخدير وإعداد الجرذ لجراحة

1. قبل الإجراء، يتم تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (8 ملغ / كلغ) وفقا لوزن الجسم. وينبغي تحديد عمق كاف من التخدير بواسطة استجابة سلبية لقرصة أخمص قدميه التحفيز.
2. مرة واحدة تخدير، وسحب اللسان إلى الأمام لمنع الاختناق وتطبيق مرهم التشحيم لكلتا العينين لمنع جفاف قرنية العين أثناء الجراحة.
3. حلق المواقع الجراحية باستخدام المقص الشعر ومسح المنطقة ثلاث مرات مع 10٪-providone اليود محلول منظف و 70٪ من الإيثانول.
4. ثنى رانه حيوان داخل حقل العقيمة. يتم استخدام قفازات معقمة والأدوات الجراحية أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة. إعادة تعقيم نصائح من الأدوات باستخدام حبة تعقيم الساخن بين الحيوانات.

2. نهج الجراحية

1. PION التعريفي
   1. الفخذ قسطرة الوريد
      1. إعداد وتنظيف الموقع الجراحي. حلق الفخذ الداخلية اليمنى باستخدام المقص الشعر ومسح المنطقة كل ثلاث مرات مع 10٪-providone اليود محلول منظف و 70٪ من الإيثانول.
      2. إعداد الأنبوب. قطع طول 40CM من أنابيب البولي ايثيلين (PE 10) تعقيمها في 70٪ من الإيثانول. تدفق أنابيب بمحلول ملحي وتوصيله إلى حقنة 1 مل تحتوي على حل قياسها مسبقا من 2٪ إريثروزين B صبغ (1 ميكرولتر / ملغ، مما أسفر عن جرعة من 20 ملغ / كغ من وزن الجسم). جبل الحقنة في القدم التبديل التحكم مضخة التسريب تعيين إلى معدل 600 ميكرولتر / دقيقة.
      3. باستخدام شفرة رقم 15، وجعل شق أفقي صغير فيقاعدة الفخذ الأيمن. قص ونشر الغشاء داخل وتنظيف المنطقة مع قطعة قطن معقمة.
      4. فصل العضلات مع ملقط حتى فرع من الوريد الفخذي مرئيا. A غمد يحيط الشريان، الوريد والعصب. قرصة وسحب هذا غمد التصاعدي مع ملقط (ملقط غرامة غيض دومون)، وقطع شق صغير (2-4 ملم عادة كافية) بالقرب من قاعدة إسفين الثلاثي على شكل مع مقص الربيع Vannas. توسيع خفض حسب الضرورة.
      5. فصل الوريد والشريان مع الجراحية الصغرى حادة ربط مواز لاتجاه الوريد. يجب الحرص على عدم تلف الغشاء والوريد فروع الحساسة. ثم، ورفع بلطف الوريد وفصلها عن النسيج الضام الكامنة.
      6. الحصول على النايلون خياطة needleless ووضعه بجانب الوريد الفخذي. باستخدام ربط العمليات الجراحية الصغرى ورفع الوريد وتمرير ملقط غرامة طرف تحت المنطقة البعيدة. انتزاع واحدة من نهاية الخيط وتسحبه تحتالوريد. Ligate الوريد البعيدة بإحكام. تمرير الخيط الثاني بطريقة مماثلة تحت الوريد القريب وجعل عقدة فضفاضة.
      7. جعل قطع صغير في الوريد بالقرب من ربط القاصي مع مقص الربيع Vannas. توسيع ثقب الضروري كما هو الحال مع ملقط غرامة طرف. بعض الدم قد تسرب من خلال خفض الانتاج. تنظيف المنطقة الجراحية مع الباردة، BSS معقمة وقطعة قطن معقمة.
      8. عقد في جدار الوريد على حافة القطع، يقثطر السفينة مع استعداد أنابيب-مسح المالحة باستخدام حامل الإبرة. تشديد عقدة الداني حول الوريد والأنابيب. ثم، مرساة الأنابيب من خلال ربطه للخياطة البعيدة.
      9. تحقق من نوعية القسطرة عن طريق الضغط على القدم التبديل لحقن المياه المالحة، <1 مل كافية. تأكد من الأنبوب هو دون عائق وليس له أي تسرب. مؤقتا إغلاق شق مع خيوط لحماية القسطرة والأنسجة.
   2. تعرض العصب البصري
      1. Preparالبريد موقع الجراحية عن طريق محو المنطقة قبل حلق فوق العين اليسرى كل ثلاث مرات مع 10٪-providone اليود محلول منظف و 70٪ من الإيثانول.
      2. إجراء شق على طول الجلد 2-3 ملم وراء العين بشفرة رقم 15. قرصة ورفع النسيج الضام مع ملقط مسنن، وجعل شق صغير مع مقص الربيع Vannas. هذا شق صغير هو عادة حوالي 5 ملم في الطول، ولكن يمكن أن يكون وقتا أطول لتوفير قدر أكبر من التعرض للجراح في التدريب. يواصل تشريح بصراحة من خلال النسيج الضام على طول الحافة العليا للعظم المداري، مع الحرص على تجنب تعطيل الأوعية الدموية. تنظيف المنطقة الجراحية مع مسحات القطن.
      3. تشريح أسفل من خلال الملتحمة حتى العضلة المستقيمة متفوقة مرئيا. قرصة وتشريح من خلال العضلات. سيتحرر العضلات من أعماق الفضاء. الآن، الأنسجة المحيطة بها يمكن استخدامها للمساعدة في التراجع والارتفاع من العين لسهولة التصور.
      4. إعادةالمسالك رفرف من الجلد والنسيج الضام أفقيا وهبوطا، وعقد في مكان مع خياطة ومرقئ. وهذا تدوير العين إلى الأمام وإلى الخارج من أجل الكشف عن غمد التي تحتوي على الدهون التي تحيط العصب البصري.
      5. إدراج بعناية زوج من الملقط حادة وتوسيع بالتوازي مع العصب البصري لفصل الأنسجة الضامة المحيطة غمد. لا تلمس العصب البصري مع نصائح حادة من الملقط.
      6. وينبغي أن يكون طولها 5 ملم من العصب البصري وغمد المحيطة الآن مرئية. وهناك شبكة من microvessels على سطح غمد يطوق العصب البصري. وسوف تستهدف هذه خلال أشعة الليزر.
   3. الحقن في الوريد من إريثروزين B وأشعة الليزر
      1. ارتداء النظارات الملونة البرتقالي السلامة في جميع الأوقات أثناء تشغيل جهاز أشعة الليزر لحماية نفسك من ضوء الليزر الأخضر. بدوره على الليزر، وفتح مصراع وضبط الذروة ومتوسط ​​بويالتمرير من الليزر عند الضرورة. إغلاق مصراع.
      2. وضع الفئران في جهاز أشعة الليزر. لضمان وضع شعاع السليم، وينتج ضعف شعاع تهدف من خلال تصفية مكانيا الليزر من خلال ثقب قطره 100 ميكرون حفر في شفرة مصراع مغلقة. إعادة فضح العصب البصري مع زوج من ملقط غيض غرامة، ووضع شعاع تهدف إلى العصب البصري داخل الحجاج بين 3 ملم و 4 ملم وراء رأس العصب البصري.
      3. حقن محلول 2٪ إريثروزين B عن طريق تفعيل مضخة التسريب. قد تعمم لبضع ثوان في حين يضيف الجراح قطرة صغيرة من BSS لترطيب سطح العصب البصري.
      4. التحقق من موقف شعاع تهدف ثم انقر فوق سفح التبديل لبدء التشعيع. عامل تصفية السلامة برتقالية اللون، والذي يضاف إلى مسار بصري المجهر، سيتم على الفور مما أثار يليه افتتاح مصراع بعد تأخير 1 ثانية.
      5. أشرق العصب البصري لمدة 90 ثانية مع قوة ذروة 135mW ومتوسط ​​القوة من 18mW التي تنتجها المروحية شعاع الدورية في 250 هرتز مع دورة عمل بنسبة 15٪ (وهذا يقلل من التأثيرات الحرارية). مضان الأصفر، كما تصور برتقالية زاهية من خلال تصفية سلامة، سوف تنبعث من سطح متفوقة على العصب البصري ويكفي للتأكد من أن شعاع يضيء العصبية بشكل متناظر.
      6. بعد التشعيع، فإن مرشح السلامة برتقالية اللون تفتح تلقائيا. Microhemorrhage يمكن ملاحظتها في بعض الحالات.
      7. تخفيف الجر على عضلات العين اضافية وعودة العين إلى موقف محايد. إغلاق شق مع خيوط متقطعة. ثم سحب القسطرة وربطة عنق من الوريد الفخذي بإحكام لمنع التسرب؛ إغلاق مع خيوط متقطعة. تطبيق مرهم مضاد حيوي لكلا الشقوق. تحقق من قاع للتحقق من سلامة الأوعية الدموية في الوريد الشبكي المركزي والشرايين.
2. وصفها الوراءفي خلايا الشبكية (RGCs) ملاحظة: من أجل تقييم بقاء RGC، وضع العلامات الوراء مع fluorogold (FG) يجب أن تكتمل قبل أسبوع واحد PION. ووصف طريقة بالتفصيل في إن الرب بروتوكول 819 ^13.
   1. في سطور: تخدير الحيوان مع الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (8 ملغ / كلغ) ويحلق رأسه.
   2. فرك جراحيا موقع شق وجعل شق خط الوسط عبر رئيس لفضح الجمجمة.
   3. حفر ثقوب الثنائية من خلال الجمجمة (2X2 ø مم) 0.5 ملم من كل من الغرز السهمي والعرضي.
   4. نضح بعناية المحتوى الدماغي التي تقع على السطح الظهري للأكيمة متفوقة (SC) باستخدام مضخة فراغ. ثم، ضع قطعة صغيرة من جلفوم غارقة مع 4٪ FG على سطح SC.
   5. إغلاق شق مع الغرز ورعاية الحيوان باستخدام الرعاية بعد العملية الجراحية القياسية.
3. الرعاية والقتل الرحيم بعد العمليات الجراحية
   1. بعد الجراحة، ووضع الحيوان في قفص نظيفة منفصل على رأس إعادة تدوير تسخين المياه وسادة حتى يتم استرداد الحيوان.
   2. المسكنات ما بعد العمليات الجراحية (البوبرينورفين حمض الهيدروكلوريك، 0.01 ملغ / كلغ) وينبغي أن تدار مرتين يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية للحد من عدم الراحة.
   3. يجب أن تبقى الفئران على حدة، ولاحظ حتى تكون قادرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية ويستعيد وعيه كافية.
   4. ويتم رصد علامات على الانتعاش والصحة الجيدة يوميا لمدة 5 أيام على الأقل بعد الجراحة، أو حتى إزالة خياطة والشفاء الكافي للموقع الجراحية، أيهما يحدث أبعد تقدير.
   5. الموت ببطء الحيوانات عن طريق نضح مع 4٪ PFA في نقاط زمنية مناسبة علميا بعد الجراحة وفقا للمصلحة التحقيق.

الإصابة الدماغية الناتجة الناجمة عن هذا الأسلوب ينتج موتا تدريجيا ولكن وضوحا في خلايا الشبكية بعد إصابة محور عصبي الدماغية. هذا هو النتائج ذات الصلة سريريا مماثلة لتلك التي لوحظت في الأمراض التي تصيب البشر. يستخدم FG وضع العلامات الوراء لتحديد بقاء RGC بعد PION. واستخدمت نفس الأسلوب للتحقق من صحة خلق نموذج ناجح وكذلك لتقييم آثار أنظمة علاجية مختلفة الشكل 1 يوضح الصور متحد البؤر التمثيلية للخلايا FG إيجابية في يتصاعد مسطحة الشبكية من سيطرة (الشكل 1A)، المعالجة الصورية (ليزر فقط / لا إريثروزين B، الشكل 1B)، و2 أسابيع (الشكل 1C) الحيوانات بعد PION المعاملة. بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة، خلايا-FG إيجابي أقل موجودة في الحيوانات بعد 2 أسابيع PION الاستقراء. ويلاحظ وجود اختلاف كبير بين عدد من RGCs في السيطرة والمعالجة الصورية (ليزر فقط / لا إريثروزين B) الحيوانات. ثيالصورة يشير إلى أن يسببها PION فقدان RGC وأثارت من قبل مجموعة من إريثروزين B وأشعة الليزر، بدلا من الطاقة الحرارية من الليزر وحده.

الشكل 1. الخلايا العقدية الشبكية (RGC) البقاء على قيد الحياة بعد أن تم تصويرها الاعتلال العصبي الخلفي البصرية الدماغية (PION). خلايا العقدة الشبكية المسمى retrogradely مع Fluorogold في يتصاعد مسطحة الشبكية (AC). بعد أسبوعين PION، لوحظ عدد مماثل من RGCs في السيطرة (A) والمعالجة الصورية (B، الليزر فقط / لا إريثروزين B) عيون. ومع ذلك، يتم تقليل عدد RGCs المسمى fluorogold ملحوظ في وضع PION (C). على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصداراتن من هذا الرقم.

Here we describe in detail a method for inducing PION in a rat model. The most critical part of the protocol is the exposure and irradiation of the optic nerve – to expose the nerve as long as possible while avoiding damage caused by the sharp fine tip forceps or from stretching. In rats, the ophthalmic artery enters the optic nerve ≤1 mm from the optic nerve head. Therefore, irradiation of the optic nerve 3-4 mm away from the optic nerve head should only result in ischemia of the capillaries feeding the nerve, rather than the artery supplying the inner retina. Fundoscopic examination is necessary to ensure the vascular integrity of central retinal artery and vein. With practice, the full surgical procedure can be accomplished in half an hour. And with set parameters for laser irradiation, this model has a reproducible time course of cell death.

As peak intensity and irradiation duration are two determinants of ischemic damage severity, modification of these parameters can be made to adjust the degree of damage for different study aims.

As the first and currently only available animal model for PION, this technique provides a novel platform for research on pathogenesis and molecular changes of PION, and can be used to screen treatment drugs for this and other CNS ischemic diseases.

The authors have nothing to disclose.

ونحن مدينون لEleut هرنانديز لتربية الحيوانات، غابي Gaidosh للخبرة المجهر، وKhue تران وZhenyang تشاو لتحرير الفيديو. هذه الدراسة تم تمويلها من قبل المعهد الوطني للعيون تمنح R01-EY022129 لفريق الاتصال المشترك والمنح P30 EY022589 لجامعة كاليفورنيا سان دييغو وEY014801 إلى UM. جمعية القلب الأمريكية، ومؤسسة جيمس واستير الملك، وصندوق برنامج التبادل طالب الدكتوراه من كلية الدراسات العليا في جامعة فودان (رقم 2010033)، ومنحة غير المقيد من البحوث للوقاية من العمى، وشركة