Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Gigante Unilamelares vesículas (GUVs) são um sistema biomimético popular para estudar membrana fenômenos associados. No entanto, vulgarmente utilizados protocolos para crescer GUVs deve ser modificado de modo a formar GUVs contendo proteínas transmembranares funcionais. Este artigo descreve dois métodos de desidratação-reidratação - eletroformação e inchaço assistida-gel - para formar GUVs contendo o canal de potássio voltagem-dependentes, KvAP. Em ambos os métodos, a solução de pequenas vesículas unilamelares contendo proteína é parcialmente desidratado para formar uma pilha de membranas, o qual é, em seguida, deixadas inchar em um tampão de reidratação. Para o método da eletroformação, o filme é depositado sobre eléctrodos de platina, de modo que um campo CA pode ser aplicada durante a re-hidratação do filme. Em contraste, o método inchaço assistida-gel usa um substrato de gel de agarose para melhorar a hidratação do filme. Ambos os métodos podem produzir GUVs em (por exemplo, 100 mM), as concentrações baixas (por exemplo, 5 mM) e salinas fisiológicas. Os GUVs resultantes são caracterizados através de microscopia de fluorescência, e a função dos canais reconstituídos medida usando a configuração de patch-clamp de dentro para fora. Enquanto inchaço na presença de um campo eléctrico alternado (eletroformação) dá um rendimento elevado da GUVs livres de defeitos, o método inchaço assistida-gel produz uma distribuição de proteína mais homogénea e não requer nenhum equipamento especial.

Ao estudar os princípios físicos que regem os sistemas vivos, as abordagens bottom-up permitem um experimentalista para controlar composição do sistema e outros parâmetros que não são facilmente manipulados em sistemas baseados em células ^1. Para os processos baseados em membrana, gigante Vesículas Unilamelares (GUVs, diâmetro ~ 1-100 mm) têm provado ser um sistema muito útil biomiméticos ^2-7 como eles são adequados para estudos de microscopia e micromanipulação ^{de 8 - 10.} Embora existam muitos protocolos diferentes para produzir GUVs, a maioria se dividem em duas categorias - emulsão base aproxima ^11,12 e técnicas baseadas em reidratação um filme lipídico ^13-16. Em métodos baseados em emulsão, os folhetos interiores e exteriores das membranas de GUV são montados sequencialmente a partir de monocamadas de lípido nas interfaces água / óleo. Esta abordagem é ideal para a encapsulação de proteínas solúveis comnas GUVs, e para a formação de GUVs com composição lipídica folheto assimétrica. No entanto, GUVs formados a partir de emulsões podem reter vestígios de solvente que alterem as propriedades mecânicas da membrana ^17, e a abordagem não é especialmente bem adequado para a reconstituição da proteína trans-membrana.

Métodos de reidratação Filme contar com o facto de secagem (desidratação) faz com que muitas misturas de lipidos para formar uma pilha multi-lamelar de membranas. Se esta pilha é então colocado em contacto com um tampão aquoso, membranas na pilha vai mover fluxos separados como solvente e entre eles na superfície da pilha, as membranas individuais podem separar para formar GUVs ^13,18 (bem como um verdadeiro zoológico de outros objetos lipídicas). No entanto, mesmo para composições de tampão e ótimos de lipídios, este método clássico "inchaço espontânea" tem um rendimento relativamente baixo de GUVs livres de defeitos. Um método amplamente utilizado para aumentar o rendimento de GUVs sem defeitos é "eletroformação221 ;, em que um campo de corrente alternada (CA) é aplicada durante a re-hidratação do filme. Embora o mecanismo ainda pouco compreendida, "eletroformação" pode dar espetaculares rendimentos guv (> 90%, em circunstâncias favoráveis) para buffers de baixa concentração de sal (<5 mm) ^14,19, e pode até mesmo trabalhar em tampões fisiológicos (~ 100 mM), utilizando uma freqüência mais alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e eletrodos de platina ^15. Uma abordagem alternativa para aumentar o rendimento de GUVs livres de defeitos é "assistida-gel inchaço", em que a solução de lípidos é depositada sobre um substrato de gel polimérico, em vez de o passivo (por exemplo, vidro, PTFE) substratos utilizados em clássica "inchaço espontâneo ". Quando o filme lipídico / gel resultante é reidratado, GUVs pode formar rapidamente, mesmo para tampões fisiológicos ^16,20.

Todos estes métodos podem produzir GUVs apenas em lípidos que podem ser utilizados para estudar os fenómenos de membrana associada, tais como ointeracção entre proteínas e membranas solúveis. No entanto, a incorporação de uma proteína trans-membrana em GUVs, são necessárias modificações significativas para assegurar que a proteína permanece num estado funcional durante todo o processo de reconstituição. Embora as soluções de lípidos em solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio, ciclo-hexano) são ideais para a produção de filmes de lípidos, proteínas trans-membranares são tipicamente estáveis ​​apenas quando o seu domínio transmembranar hidrófobo é incorporado numa bicamada lipídica, ou rodeado por uma micela de detergente ( por exemplo, durante a purificação de proteínas). Assim, o material de partida para uma reconstituição é tipicamente membranas nativas, a proteína purificada em uma solução de detergente, ou de pequenas vesículas unilamelares contendo proteínas (Proteo-SUVs) e / ou vesículas multi-lamelares (MLVs-proteo) formados por remoção de detergente na presença de lipídios. A maioria dos métodos para incorporar estas proteínas de membrana em GUVs se dividem em três categorias.

Insertio Direton: proteína Trans-membrana suspensa em detergente é misturado com pré-formadas, lipídeos-somente, GUVs solubilizados levemente detergentes, e o detergente em seguida, removido usando BIOBEADS ^21. Embora conceptualmente simples, este método requer um controlo preciso da concentração de detergente, como uma concentração demasiado elevada de detergente possa dissolver os GUVs enquanto uma concentração demasiado baixa pode causar a proteína se desdobrar ou agregado.

GUV / Proteo-SUV Fusão: Proteína em PROTEO-SUVs é combinado com pré-formadas, lipídico-somente GUVs e fusão é facilitada com peptídeos fusogénicos especiais ²² ou detergente ^21. Normalmente a extensão da fusão é limitado levando a GUVs com baixa densidade de proteína.

Desidratação / A re-hidratação: Um filme de lípido contendo a proteína é formada por desidratação parcial de um proteo-SUV (ou proteo-MLV) e solução GUVs são então crescidas como para uma película de lípido puro. O desafio é óbvio para proteger a proteína durante o dehydrati parcialna etapa ^23, mas o método tem sido utilizado com sucesso para reconstituir as proteínas trans-membranas, tais como a bacteriorodopsina, Cálcio-ATPase, integrina e VDAC em GUVs ^{7,23 - 25.}

Este artigo descreve protocolos de desidratação / re-hidratação para fazer GUVs contendo o canal de potássio dependentes da voltagem, KvAP, de Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termofílica. KvAP tem um elevado grau de homologia com os canais de potássio dependentes da voltagem eucariótica ²⁶ e uma estrutura de cristal conhecida ²⁷ , tornando-se um bom modelo para estudar o mecanismo de gating tensão. Produção dos Proteo-SUVs foi descrito em pormenor anteriormente e não faz parte deste tutorial ^26,28,29. Importante, KvAP Proteo-SUVs não tem que ser produzido para cada preparação GUV, como elas podem ser armazenadas em pequenas (por exemplo, 10 ul) alíquotas a -80 ° C durante períodos de tempo prolongados (> 1 ano). Eletroformaçãoou inchaço assistida-gel pode então ser usado para cultivar as GUVs de Proteo-SUVs KvAP (ou proteo-MLV).

Os passos chave para o protocolo eletroformação estão ilustrados na Figura 1. As gotas de uma solução de SUVs que contêm a proteína é depositada em fios de platina (mostrado na Figura 2). Desidratação parcial da suspensão de SUV leva à formação de uma película de lípido, através da proteína de fusão de SUVs. Durante a hidratação, um campo de CA é aplicada aos eléctrodos, para auxiliar as camadas lipídicas para delaminar e formar GUVs. Um campo de 10 Hz funciona bem quando se usa "baixo teor de sal" (<5 mm) tampão de reidratação ²⁸ e GUVs levar várias horas para crescer. Em contraste, tampões fisiológicos (contendo ~ 100 mm sal) funcionam bem com uma tensão mais baixa, de 500 Hz campo AC, mas exigem uma prolongada (~ 12 horas) período ^{de 15} inchaço. Este método é baseado em um protocolo anterior usando ITO desliza ^24, mas usa uma câmara cont customaining dois fios de platina, como mostrado na Figura 2 (veja a discussão de detalhes do projeto e sugestões para o mais simples, câmaras improvisado).

A Figura 3 ilustra o método de inchaço assistida-gel. O protocolo funciona bem com tampões com concentrações fisiológicas de sal, é rápido, e produz GUVs com uma distribuição mais homogênea da proteína. No entanto, o rendimento de, GUVs aparentemente livres de defeitos isolados (ou seja, a membrana GUV é uniforme no comprimento escalas ópticos e não coloque nenhum objeto) é menor, embora ele fornece um número suficiente para patch-clamp e experimentos de manipulação de micro- . Este método foi baseado num protocolo utilizando gel de agarose para produzir GUVs apenas em lipidos ¹⁶ e requer menos equipamento especializado do que o método da eletroformação.

A caracterização de GUVs com microscopia de fluorescência é descrito, bem como procedimentos que utilizam um padrão de patch-clamp set-up paramedir a atividade KvAP no "inside-out" extirpado pedaços de membrana.

Cultivo GUVs contendo proteína pode ser mais difícil do que GUVs apenas em lípidos. Em particular, o rendimento final GUV pode dependem sensivelmente exactamente como a solução SUV é depositado e desidratada para formar a pilha de membrana. Para alguém sem experiência anterior com GUVs, pode ser útil para a primeira GUVs crescer apenas em lípidos, segundo um protocolo convencional de ^15,16 em que a folha de membrana é formada pela deposição de lípidos a partir de um solvente orgânico. Uma vez que o protocolo convencional funciona bem, deposição SUV e desidratação parcial pode, então, ser dominado usando SUVs apenas em lípidos, que são também muito útil quando se ajusta o protocolo para uma nova composição de lípido. Quando GUVs crescer de forma confiável a partir de SUVs apenas em lipídios, então é apenas um pequeno passo para produzir GUVs contendo proteínas de PROTEO-SUVs.

1. Preparação de Solução

1. Prepare 5 ml de "tampão de SUV contendo 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou TRIS (pH 7,5), e 2 mM de trealose. Filtra-se o tampão com um filtro de seringa de 0,2 um e dividir em alíquotas de 1 ml, que podem ser armazenadas a -20 ° C.
   NOTA: Detalhes adicionais para reagentes e instrumentos são indicados na lista de materiais.
2. Prepare 40 ml de GUV 'Crescimento Buffer' que vai encher o interior GUV durante a reidratação filme. Para um crescimento "baixo teor de sal", combinar KCl 5 mM, HEPES 1 mM (pH 7,4) ou 1 mM de TRIS (pH 7,5), e ~ 400 mM de sacarose. Para um crescimento 'de sal fisiológico, combinar KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de Tris (pH 7,5), e ~ 200 mM de sacarose.
3. Preparar 40 ml de "Tampão de Observação 'para a solução externa na câmara experimental através da combinação de KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de Tris (pH 7,5), e ~ 200 mM de glucose.
   NOTA: Estes buffers são apenas examples. Veja a discussão para adaptar os buffers para outras experiências.
4. Meça as osmolaridades do crescimento e da observação buffers com um osmômetro. Adicionar grânulos de sacarose ou glicose para combiná-los para dentro de 1%, de modo que não irá lisar GUVs ou entrar em colapso quando transferido a partir da câmara de crescimento para a câmara de observação.
   NOTA: Nesta gama de concentração, a adição de 1 mM de sacarose (13,7 mg por 40 ml) ou glucose (7,2 mg por 40 ml) aumenta a osmolaridade por ~ 1 mOsm.
5. Filtrar os tampões de crescimento e observação com um filtro de 0,2 um e armazená-las a 4 ° C para inibir o crescimento bacteriano.
6. Dissolve-se 50 mg de beta-caseína em 10 ml de TRIS 20 mM (pH 7,5) tampão para formar uma solução de beta-caseína de 5 mg / ml necessária para passivar as superfícies de câmaras experimentais de modo que não aderem GUVs, espalhou-e-rajada. Uma vez que a beta-caseína está completamente dissolvido (até várias horas a 4 ° C), filtra-se (0,2 um) em que alíquotas de 0,5 ml, que pode ser rapidamente congelados e armazenadosa -20 ° C para uso posterior (descongeladas aliquotas armazenadas a 4 ° C pode ser usada tipicamente para até 1 semana).

2. Preparação SUV

1. Prepare e congelar alíquotas de PROTEO-SUVs seguindo o protocolo detalhado previamente publicado ^28. Use KvAP marcado por fluorescência com Alexa-488 maleimida, reconstituída em DPhPC SUVs (10 mg / ml) a uma relação de proteína para lípido de 1:10 (em massa).
   NOTA: Tipo selvagem KvAP contém uma cisteína por monómero localizado perto do terminal C intra-celular (aminoácido 247).
2. Fluorescentes, só em lípides SUVs:
   NOTA: Manusear clorofórmio sob uma coifa vestindo luvas de borracha nitrílica e óculos de segurança. Evitar a utilização de qualquer plástico como o clorofórmio pode dissolvê-los. Soluções de clorofórmio pode ser armazenada em frascos de vidro âmbar com tampas de Teflon e transferido utilizando seringas de vidro. Tome cuidado para lavar todos os vidros pelo menos 5 a 10 vezes com clorofórmio, antes e após a pipetagem lipídios.
   1. Preparar 100 ul de10 SUVs mg / ml DPhPC contendo 0,5% molar do lípido fluorescente vermelho, vermelho do Texas DHPE, por mistura de 100 ul de solução DPhPC (10 mg / ml em clorofórmio) com 8,2 ml de solução de vermelho de Texas-DHPE (1 mg / ml em metanol) num frasco de vidro âmbar de 1,5 mL.
   2. Secam-se os lípidos para baixo sob uma corrente de azoto numa campânula química durante a rotação do frasco. Quando o filme parece ser seco, colocar os lípidos em vácuo durante 3 horas para remover qualquer solvente residual.
   3. Adicionar 100 mL de tampão de SUV para os lipídios, e vortex vigorosamente até não lipídica permanece preso às paredes do frasco e a solução é uniformemente leitoso.
   4. Sonicar a solução de lípido para formar SUVs. Ajuste a posição frasco até o ultra-som faz com que a maior parte do movimento e fluxo dentro do frasco, e tomar cuidado para não aquecer a solução desnecessariamente. Continue a sonicação até que a solução se tornar translúcido, ou, quando possível, transparente (2-5 min para a ponta ultra-sons, ~ 20 min para o banho de ultra-sons).
   5. AliquoSUVs t (por exemplo, 10 jul ou 20 l) e congelamento (-20 ° C) para uso posterior.
      NOTA: Os lipídios, principalmente lipídios insaturados, pode facilmente avaria. Soluções lipídicas loja a 20 ° C (ou 80 ° C), sob árgon e utilizar no prazo de 6 meses. Produtos de degradação de lipidos pode ser detectada com a cromatografia em camada delgada.

3. GUV Crescimento por eletroformação

1. Prepare a câmara eletroformação.
   1. Se a câmara não tenha sido limpo, retire as janelas, limpar tudo selante e graxa, extrair os fios, e lavar e esfregar a câmara com um lenço de papel, utilizando água e etanol (≥70%), alternadamente.
   2. Esfregar os fios bem, submergir os fios e câmara em acetona, e sonicar durante 5 minutos. Limpe tudo com um tecido novamente usando acetona. Coloque a câmara em etanol e sonicado durante 5 minutos.
   3. Monte a câmera, inserindo os fios através dos furos, e gire e limpe os fios para se certificar de que eles are limpo. Coloque a câmara em água destilada, sonicar durante 5 minutos e secar a câmara com uma corrente de azoto ou de ar.
2. Preparar 30 ul de 3 mg / ml de suspensão de SUVs em tampão de SUV. Para formar GUVs contendo proteínas, combinar 8 ul de SUVs (Proteo-DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 ul de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) e 20 ul de SUV tampão num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para um final de proteína lipídica (massa) proporção de 1 para: 12,5 e de 0,1% molar TexasRed-DHPE. Misture a solução vigorosamente.
   1. Alternativamente, para a prática do protocolo com apenas SUVs lípidos, simplesmente combinar 10 ul de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC e 0,5 mol% TexasRed-DHPE) com tampão de SUV 20 ul.
3. Depositar o Solution SUV.
   1. Usar uma pipeta 2 mL ou 5 mL de seringa de vidro para depositar pequenos (<0,2 ul) gotículas da solução SUV nos fios. Cerca de 1 ml de solução é necessário para formar uma série de gotas ao longo1 cm de fio. Certifique-se de que as gotas são pequenos o suficiente e separados o suficiente que eles não se tocam ou fusível.
   2. Deixe os SUVs depositados secar por ~ 30 min, ao ar livre. Quando todas as gotas se instalaram, girar o fio de modo que os depósitos lipídicos são mais fáceis de observar ao microscópio.
      NOTA: Se os SUVs não secar o suficiente, eles podem simplesmente lavar os fios quando o buffer de crescimento é adicionado, durante a secagem em excesso pode danificar a proteína. Por causa da humidade do ar influencia a taxa de secagem, o tempo de secagem e / ou humidade do ar pode ser ajustado para obter resultados óptimos ^30. A película lipídica sobre os fios devem ser visíveis ao microscópio.
4. Monte a câmara.
   1. Fecha-se o fundo da câmara: Use uma seringa para aplicar graxa de vácuo para o fundo da câmara em torno dos três poços e prima de 40 mm x 22 milímetros lamela suavemente contra ele para selar o fundo da câmara de modo que ela adere, sem uma lacuna. Selar os lados da câmara (onde a saída fios) comvedação colar. Aplicar graxa de vácuo na parte superior da câmara que define os três poços.
   2. Lentamente adicionar tampão de crescimento, até que cada poço é enchido até ao topo. Evitar qualquer movimento rápido da solução nos poços como este pode remover a película de lípido fora dos eléctrodos.
   3. Feche a câmara pressionando o cursor superior tampa com cuidado sobre a graxa, tendo o cuidado para não deslocar a lamela inferior. Use um tecido para remover quaisquer gotas de tampão nas bordas de topo da tampa deslizante.
      NOTA: Este é um bom momento para examinar a câmara sob o microscópio para confirmar que o filme lipídico manteve-se nos fios.
5. Ligue o gerador de sinais para os fios usando duas garras jacaré. Defina a frequência (onda senoidal de 10 Hz / 500 Hz para o buffer de sal baixo / alto) e usar um multímetro para medir e ajustar a tensão sobre os fios para 0,7 / 0,35 V raiz quadrada (Vrms) para o buffer de sal de baixa / média alta. Cubra a câmara com folha de alumínio para proteger os fluorophores da luz. Deixar tele GUVs a crescer durante 2 a 3 horas para o tampão de baixa salinidade, e 12 hr ou O / N para o tampão de alto teor salino.
6. Desligue a câmara do gerador e coloque-o cuidadosamente em um microscópio invertido para avaliar o crescimento GUV. Use, movimentos lentos ou estacionários fluxo de fluido nas cavidades prematuramente pode separar GUVs dos fios.
   NOTA: GUVs nas extremidades dos fios são normalmente visíveis no contraste de fase (objectiva 40X longa distância de trabalho), enquanto GUVs em qualquer lugar sobre a metade inferior dos fios pode ser visto com epifluorescência. Se não há GUVs são visíveis, tente rodar os fios de olhar para a superfície superior. GUVs pode ser armazenado a 4 ° C numa câmara de crescimento durante vários dias.

4. GUV Crescimento por inchaço Gel-assistida

1. Preparar 10 ml de uma solução de agarose a 1% através da mistura de 100 mg de agarose com 10 ml de água pura. Aqueça até ferver, colocando-o no microondas a 480 W para ~ 20 seg. Mexa para certificar-se da agarose esteja completamente dissolvido.
   NOTA: A soluçãopode ser armazenada a 4 ° C e reaquecido quando necessário.
2. Plasma-clean (plasma de ar) uma tampa-slide durante 1 minuto para que a solução de agarose vai se espalhar muito bem nele. Usar a tampa-slides no próximo 15 min como o efeito de limpeza plasma desaparece rapidamente.
3. Aplicar 200 ul de solução de agarose quente para cada um de 22 x 22 mm ² de modo deslizante a solução molha toda a superfície. Incline a deslizar verticalmente e tocar a borda inferior a um tecido para remover o excesso de líquido e deixar apenas uma camada lisa fina de agarose no slide.
4. Coloque o slide em uma chapa quente ou um forno a 60 ° C e deixe-o secar por pelo menos 30 min. O filme agarose é pouco visível a olho nu. Após as lâminas de arrefecer até à TA, utilizá-los imediatamente, ou armazenar para até uma semana num recipiente fechado a 4 ° C.
5. Coloque a lamela revestida de agarose em um padrão de 3,5 centímetros de Petri.
6. Preparar a solução de SUV tal como na Secção 3.2 e aplica ~ 15 ul da solução de SUV (3 mg / ml de lípido) em~ 30 muito pequenas gotas suavemente sobre a superfície de agarose. Tome cuidado para não distorcer a camada de agarose demais.
7. Colocar a lâmina sob uma ligeira corrente de azoto durante cerca de 10-15 min e a seguir a evaporação do tampão por olho como as gotículas de secar.
8. Assim que os SUVs terem secado, adicionar tampão de crescimento para cobrir a superfície da lâmina. Para uma pequena 3,5 centímetros prato Petri uso ~ 1 ml de tampão.
9. Permitir que o inchaço prosseguir durante ~ 30 min, e então analisar o crescimento de GUVs na câmara utilizando um microscópio invertido com contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial (DIC).
   NOTA: observação epifluorescência é difícil devido à forte fundo de fluoróforos em gel e a auto-fluorescência da agarose.

5. Colheita e Observing GUVs

1. Passivate a câmara de observação (por exemplo, pequena placa de Petri ou lamela de vidro) para que GUVs não furar, espalhar e explodiu na parte inferior da câmara. Cubra a chamber inferior com uma solução de beta-caseína, incubar durante 5 min, lavar-se a solução de caseína com água pura e seca com uma corrente de ar ou de azoto, e, finalmente, adicionar tampão de observação (por exemplo, ~ 5 mm de profundidade por uma pequena placa de Petri).
2. Colher as GUVs. Cortar a extremidade de uma pipeta de 100 uL dicas de modo que a abertura é maior (~ 2 mm de diâmetro), aspira-se lentamente e como a tensão de corte de pipetagem pode facilmente destruir GUVs.
   1. Para GUVs formado eletrointensivas, abra a câmara de crescimento, removendo suavemente a parte superior lamela. Coloque a ponta da pipeta diretamente acima de cada fio e aspirado ~ 50 ul enquanto se move a ponta da pipeta ao longo do fio de separar os GUVs.
      NOTA: Pode ajudar a girar a fio para coletar GUVs sobre o "outro lado" do fio.
   2. Para GUVs "inchaço" assistida-gel, primeiro toque no lado do prato de petri algumas vezes para ajudar os GUVs desprendimento da superfície da lamela. Posicione a ponta da pipeta logo acima da lamela e aspirado de 50 ul enquanto pulling a ponta para trás sobre a superfície. Transferir directamente GUVs colhidas para uma câmara de observação, ou armazenar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, a 4 ° C durante até 1 semana.
3. Coloque a câmara de observação em um microscópio invertido, adicione as GUVs à câmara de observação, e aguarde alguns minutos para que os GUVs para se depositam no fundo da câmara.
4. Levantamento da câmara com contraste de fase ou DIC para localizar rapidamente lisas, esféricas ('defeito livres) "candidatos guv". Examine cada "candidato GUV" em epifluorescência para excluir quaisquer que contêm lipossomas menores aninhados dentro. Finalmente, verificar que a intensidade de fluorescência de lípidos é uniforme e compatível com uma única membrana (ou seja, unilamelar).
   NOTA: Em alguns bilamellar (ou multi-lamelares) vesículas, as membranas são muito próximos de ser resolvidas para que eles apareçam unilamelar em contraste de fase ou imagens DIC. No entanto, estes objectos podem ser distinguidos dos unilame realGUVs Llar por sua fluorescência de lípidos, que é duas vezes (ou mais) brilhantes.

6. GUVs de fixação de Patch

1. Faça pipetas de patch com um diâmetro de ponta 1-2 mm de vidro de borosilicato capilar padrão usando o programa recomendado para o extrator pipeta.
   NOTA: tratamentos especiais, tais como polimento fogo não são necessários, e pipetas pode ser utilizado para vários dias depois de terem sido puxados se forem mantidos dentro de uma caixa fechada.
2. Passivar a câmara de incubação com uma solução de beta-caseína (5 mg / ml) para assegurar que não aderem GUVs, e espalhar sobre as superfícies da câmara de ruptura. Lavar a caseína fora após 5 min.
3. Insira o eletrodo de aterramento, encher a câmara com tampão de observação, transferir 10 mL da suspensão de GUV como descrito no passo 5.2 e 5.3, e aguarde alguns minutos para que os GUVs para assentar no fundo.
4. Encha uma pipeta remendo fresco com a solução (buffer de observação ou outra solução iso-osmótica) emontá-lo no amplificador headstage patch-clamp.
5. Pesquisa através da câmara para localizar um GUV "sem defeitos", como descrito na seção 5.4, e verifique se ele contém proteína fluorescente.
6. Aplicar uma pressão positiva constante (> 100 Pa, ou H ₂ O em um manômetro de cerca de 1 cm) para manter a pipeta remendo interior limpo, e inserir a pipeta de patch para a câmara. Traga a pipeta de patch para o campo de visão, aplicar pulsos de teste para medir / compensar o deslocamento e resistência à tensão pipeta, e examinar a pipeta sob iluminação fluorescente para confirmar que a dica é limpo.
7. Traga a pipeta de patch para o GUV e, se necessário, simultaneamente, reduzir a pressão positiva para que o fluxo de saída da pipeta patch não fazer a GUV "fugir". Quando a pipeta patch está perto do GUV, aplicam uma pressão negativa (até 5 cm de H ₂ O) para puxar o GUV contra a pipeta patch. Monitorar a resistência como o "; Língua "de membrana GUV entra na pipeta patch e as formas gigaseal.
8. Se um gigaseal não formaram, remova a pipeta patch da câmara e volte para o passo 6.4. Se o patch membrana formada uma gigaseal, mas a GUV permanecer ligado à pipeta, extirpar o patch puxando para longe do GUV, estourando a GUV contra o fundo da câmara, ou brevemente movendo a pipeta da solução.
9. Quando o remendo de membrana de dentro para fora foi excisada do GUV e o gigaseal é estável, desligar os pulsos de teste e aplicar um protocolo de tensão tal como o mostrado na Figura 13.
   NOTA: Figura 13 segue a convenção eletrofisiológico padrão para um patch de dentro para fora na qual a corrente que flui para o patch-eletrodo é "positivo", e V = V _banho - V _pipeta. Segurando o remendo a um potencial negativo (por exemplo, V = -100 mV) para ~ 30 segundos lugares KvAP em estado de repouso, enquanto etapas (100 ms a 5 segundos) para potenciais mais positivos (por exemplo, V = 100 mV) pode, então, dirigir-la em Regência (ie, abertos) estados ativos.
10. Após as medições em um patch membrana terminar, quebrar o patch com um pulso zap ou pressão e verifique se o deslocamento do eletrodo remendo tensão não se afastou. Retirar a pipeta patch da câmara, e volte para o passo 6.4.

O crescimento de GUVs pode ser rapidamente avaliada examinando a câmara de crescimento sob o microscópio. Para eletroformação, os GUVs tendem a crescer em grupos ao longo dos fios de platina, tal como mostrado na Figura 4. Durante inchaço assistida-gel, GUVs aparecem como estruturas esféricas que crescem rapidamente e fundem em conjunto (Figura 5).

GUVs sem defeitos são mais facilmente identificados e avaliados após a transferência para uma câmara de observação. Medidas de calibragem são necessários para avaliar rigorosamente qualidade GUV, e uma quantificação sistemática tenha sido publicado anteriormente ^28. No entanto, como um guia empírico, "boas" GUVs devem ser isolados (ou seja, não em um cluster), tem uma única membrana, lisa, esférica exterior, não contêm objetos (ou seja, tubos, vesículas aninhados, etc.) no interior, e ter o nível de fluorescência lipídico "standard" (objetos mais brilhantes são tipicamente bi ou multi-lamelar). A Figura 6 mostra imagens DIC e epifluorescência de um "sem defeitos" GUV após a transferência para uma solução de glucose iso-osmótica. O contraste em DIC é devido à diferença na densidade óptica entre a sacarose e a cheio GUV solução de banho que contém glicose. O índice de refracção de contraste contendo KvAP GUVs frequentemente diminui com o tempo, apesar de a própria KvAP não deve ser permeável a sacarose ou glicose. A fluorescência uniforme de proteína na membrana GUV KvAP confirma que está incorporada no GUV (isto é, que não permanecem na película de lípido) e não formou micro-escala (ou maiores) agregados.

Figuras 7, 8 e 9 mostram imagens confocal de lipídeos e proteína de fluorescência GUVs produzidos pelo protocolo inferior-sal eletroformação, protocolo eletroformação salina fisiológica, e protocolo inchaço assistida-gel. O lípido fluorescente (magenta) e proteínasSinais (verdes) foram escalados para a mesma intensidade média, de modo que GUVs com um baixo / elevado número de proteínas por unidade de área (densidade de proteína) tem um magenta / sombra verde nas imagens de sobreposição (coluna da direita), enquanto que com um GUVs densidade média de proteína são brancos. GUVs, livre de defeitos isolados foram identificados e a distribuição de tamanho de GUV é mostrado na Figura 10. Tipicamente eletroformação produz mais GUVs livres de defeitos do que inchaço assistida-gel, mas os GUVs produzidos por eletroformação são menores. A Figura 11 mostra a distribuição de densidade de proteína inferida da fluorescência das GUVs. Eletroformação com tampão de alto teor salino produz GUVs em que a densidade de proteína varia grandemente de GUV para GUV. A densidade de proteína de GUVs individuais varia muito menos para eletroformação com tampão de baixo teor de sal, enquanto a densidade de proteína de GUVs produzidos por inchaço assistida-gel é notavelmente uniforme.

A técnica de patch-clamp é uma utilização amplamented método para estudar a função de canais iônicos dependentes de voltagem, como KvAP. Em gravações de "dentro para fora", um vidro de "patch" de pipeta limpa é usada para extirpar um remendo de membrana de uma GUV. Um eléctrodo dentro dapatch pipette @ é então utilizada para aplicar tensão, e medir a corrente resultante que flui através do remendo de membrana. A composição do adesivo membrana pode ser muito diferente do resto da célula / GUV ^31, mas a configuração "inside-out" ainda é muito útil para medir a condutância de canal único, selectividade iónica, e gating e dependente da voltagem. Essas três propriedades são uma excelente maneira de estabelecer que as correntes não são devido a artefatos (por exemplo, questões gigaseal) ou contaminantes (por exemplo, porinas bacterianas da purificação), e há canais KvAP funcionais nos GUVs.

A condutância de canais é mais facilmente medido em manchas com apenas um ou dois canais activos. No example mostrado na Figura 12, sem aberturas de canal são observados quando a membrana é mantida a -100 mV, enquanto que a 100 mV, aberturas de canais individuais pode ser claramente resolvidas. O histograma mostra dois picos de corrente que correspondem ao fechado e os estados aberto, e equipando-os com uma função gaussiana dupla produz uma corrente de um único canal de 10,9 ± 0,85 pA, correspondendo a uma condutividade de 109,2 ± 8,5 pS (em KCl 100 mM). Note-se que a condutância de um canal depende da solução (especialmente a concentração de potássio) e composição da membrana ^32,33.

Como muitos outros K-canais, canais indivíduo KvAP exposição "tagarelar" rajadas de aberturas rápidas e fechamentos. Como demonstrado anteriormente, a selectividade de potássio pode ser testado utilizando uma solução diferente napatch pipette @ (por exemplo, solução de NaCl remendo pipeta 90 mM, KCl 10 mM) ^28.

Gating dependente de tensão é muitas vezes étudied nas manchas de múltiplos canais, de modo a obter mais facilmente uma média do conjunto. Embora não haja um mecanismo fisiológico óbvio favorecendo o (domínio intracelular no interior GUV) e inversa (domínio intra-celular no exterior GUV) inserção de KvAP em GUVs, em "inside-out" pedaços de membrana a maioria dos canais funcionais têm o " fisiológica "de inserção ^28. A Figura 13 mostra a resposta de um remendo de membrana contendo múltiplos (> 10) de canais para uma série de 5 segundos passos de despolarização. Entre cada passo, a correção será realizada a -100 mV durante 30 segundos para permitir que os canais com a inserção "fisiológico" para voltar ao seu estado de repouso. Quando o potencial é suficientemente negativo (por exemplo, V <-60 mV) a maior parte da corrente é devido ao vazamento gigaseal, e as aberturas ocasionais de um ou dois canais que são propensos a ter a inserção "inversa". Para passos para pote mais positivantials, um número crescente de canais são observados até há tantos que as aberturas e fechamentos individuais já não pode ser resolvido. Assim, a probabilidade de abertura do canal é claramente dependente da voltagem. A cinética de ativação e inativação KvAP diferem consideravelmente entre negros lipídicas membranas (MBL) e ²⁶ GUVs, mas isso é consistente com relatos anteriores de que canal de gating Kv pode ser sensível à composição da membrana e do estado ^34.

Figura 1. Esquema da eletroformação GUV.: Gotas contendo SUVs são depositadas sobre um eléctrodo de desidratação parcial da solução faz com que os SUVs para fundir para formar uma pilha de membranas. Tampão é então adicionado e um campo eléctrico de CA aplicada. Como as ondas de filmes, membranas individuais destacam-se da pilha para formar GUVs. (Este valor foi mod ified de Aimon et al ^28.)

Figura 2. GUV eletroformação Câmara. A câmara é moído para fora de um PTFE-bloco com três poços (10 mm de diâmetro, 5 mm de profundidade). Dois fios de platina 0,5 milímetros de diâmetro são separados por 3 mm (distância da borda a borda) e estão posicionadas perto do fundo da câmara para facilitar a imagiologia dos fios. Lamelas inferiores e superiores são mantidos no lugar com graxa de vácuo, e colar de vedação impede qualquer vazamento dos buracos fio na lateral. O gerador de corrente alternada está conectado com pinças para os fios. A câmara é baseado em um desenvolvido por Ernesto Ambroggio e Luis Bagatolli. (Este valor foi modificado a partir Aimon et al. ²⁸⁾

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Figura 3. Gel-espontânea assistida Inchaço esquemática: Gotas contendo uma suspensão de SUV são depositadas sobre um gel de agarose Como a gota desidrata, as SUVs fundir para formar um filme lipídico.. Quando o buffer de crescimento é adicionado, o filme re-hidrata e GUVs formar na superfície. GUVs crescer para um tamanho de ~ 10 um de inchaço e fundindo-se com GUVs vizinhos.

Figura 4. Imagem representativa de GUVs DPhPC contendo KvAP crescente sobre o fio de platina em um buffer de alta sal. Os GUVs assemelhar-se cachos de uvas ao longo do fio. Imagem contraste de fase utilizando objetiva de 40X LWD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Imagens de uma GUV sem defeitos. (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 em massa) contendo KvAP marcado com Alexa-488, à esquerda: DIC, à direita: Alexa-488 epifluorescência. Excitação: 470/50 nm, emissão: 545/75 nm. Note-se a fluorescência a partir de KvAP uniforme sem agregados visíveis. "Target =" _ 81fig6large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. As imagens confocal de lipídios (magenta) e proteína (verde) de fluorescência de GUVs electroformed cultivadas em um tampão de baixa salinidade (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 em massa) (A) A marca de setas brancas (provável). GUVs, enquanto a seta vermelha marca uma vesícula potencialmente bi-lamelar com maior fluorescência lipídico. Note-se que a intensidade de fluorescência é mais brilhante no centro da imagem, devido à extremamente grande campo de visão. (B) Zoom mostrando um pequeno grupo de GUVs. Esquerda (magenta): TexasRed-DHPE excitação: linha de laser 543 nm, emissão: 605/70 nm. Center (verde): KvAP marcado com Alexa-488 excitação: linha de laser 488 nm, emissão: 515/30 nm. Direita: sobreposição.oad / 52281 / "target =" _ 52281fig7large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. imagens confocais de lípido (magenta) e proteína (verde) a partir de fluorescência GUVs electroformed cultivadas na concentração de sal fisiológica (Egg-PC: PA-ovo 9: 1, em massa). (A) Os GUVs (setas brancas mostram provável unilamelar exemplos) são mais escassas em comparação com o protocolo de baixo teor de sal e pode ter extremamente diferentes concentrações de proteína (seta vermelha). (B) Zoom mostrando um pequeno grupo de GUVs. Esquerda (magenta): TexasRed-DHPE excitação: linha de laser 543 nm, emissão: 605/70 nm meio (verde): KvAP marcado com Alexa-488 excitação: linha de laser 488 nm, emissão: 515/30 nm. À direita:. Overlay favor clamber aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. imagem confocal de lipídios (magenta) e proteína (verde) de fluorescência de GUVs (DPhPC) formados por assistida-gel inchaço com um tampão de concentração salina fisiológica. GUVs mostram uma densidade de proteína mais homogênea que GUVs electroformed preparadas com tampão fisiológico. Esquerda (magenta): BPTR-Cer 0,1% de excitação: 543 linha de laser nm, emissão: 605/70 nm. Médio (verde): KvAP marcado com Alexa-488 excitação: linha de laser 488 nm, emissão: 515/30 nm. À direita:. Fusão dos dois canais Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. Distribuição de tamanho de PROTEO-GUVs sem defeitos (DPhPC) produzidas pela eletroformação em tampão de sal baixo (top, N = 94) ou assistido-gel de agarose inchaço (parte inferior, N = 68).

Figura 11. guv histogramas densidade proteína: A densidade de proteína (número de proteínas por unidade de área) de GUVs electroformed com tampão de baixo teor de sal (mM KCl 5, DPhPC) varia menos do que com concentração salina fisiológica (KCl 100 mM, Egg-PC: Egg -PA. 9: 1 em massa) A densidade de proteína de GUVs (DPhPC) cresceu assistida-gel inchaço em tampão salina fisiológica mostra a menor variação. Densidade de proteína é proporcional à intensidade de fluorescência KvAP-A488 para estas concentrações ^{de 28,} e em cada histograma as intensidades de fluorescência são normalizados pela média da distribuição. (O painel do meio foi modificadoa partir de ²⁸ Aimon et al.)

Figura 12. atividade de canal único de GUV Membrane Patches ('inside-out' convenção tensão DPhPC). O GUV foi cultivado em KCl 100 mM, 5 mM HEPES pH 7,4 em fios de platina. Canais únicos abertos após a aplicação de 100 mV potencial sobre o patch. Para a direita da margem interna é um histograma usado para calcular a condutância de canal único. A linha vermelha é um ajuste para uma função Gaussian duplo com maxima em 4,70 ± 0,27 e 15,62 ± pA 0,58 pA, correspondendo a uma condutância de 109,2 ± 8,5 pS. O rastreamento foi filtrada a 10 kHz com um 4 pólos filtro de Bessel e gravado a 50 kHz.

Figura 13. dependen-tensão canais de t gating no remendo de membrana de uma GUV formado em agarose em um buffer de alta sal (DPhPC, convenção tensão "dentro para fora"). (A) Resposta da atual membrana patch para uma etapa transitória da tensão. Pipeta e soluções banho ambas incluídas KCl 100 mM, e a membrana foi realizada durante 30 segundos a -100 mV entre os passos sucessivos de tensão. Em uma inspeção de perto pode-se ver que o rastreamento contém 1 ou 2 canais que parecem abrir com tensões negativas. Inserir a) mostra um zoom de abertura retardada e inserir b) o fecho atrasada do canal. Currents foram filtrados com um 4 pólos filtro de Bessel em 10 kHz e gravado no 51,3 kHz. Offline O rastreamento foi-amostrado até 513 Hz. A capacitância transitório negativo é cortado em -150 pA. (B) Corrente média (0,25 sec Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sistemas de modelos biomiméticos são uma ferramenta importante para o estudo das propriedades e interações de proteínas e membranas. Em comparação com outros sistemas reconstituídos como MBL ou membranas lipídicas suportados, GUV sistemas baseados apresentam várias possibilidades incluindo controlo considerável de composição da membrana, a tensão e a geometria, bem como sendo verdadeiramente livre de óleo. No entanto, a incorporação de proteínas transmembrana, como KvAP, em GUVs requer adaptações significativas de protocolos convencionais para GUVs apenas em lipídios. O protocolo eletroformação aqui apresentado foi previamente caracterizados e utilizados para o estudo dos princípios biofísicos de distribuição de proteína de membrana e dinâmica nas membranas curvas ^2,4,35. Este trabalho demonstra um novo protocolo inchaço assistida-gel, somando-se o conjunto de métodos para a reconstituição de proteína em GUVs. Ambos os protocolos podem produzir GUVs sem defeitos contendo altas densidades de KvAP e medições sobre patches dentro para fora confirmar que oGUVs si conter, canais de potássio funcionais seletivo dependentes de voltagem.

As duas abordagens têm diferentes pontos fortes e fracos. Quando pode ser usado condições de baixa sal, eletroformação oferece um bom compromisso entre rendimento GUV e densidade proteína uniforme. Eletroformação ainda dá rendimentos razoáveis ​​com concentrações fisiológicas de sal, mas a densidade de proteína pode variar muito entre GUVs (ver Figuras 8 e 11). As variações de densidade parecem estar ligados à duração de eletroformação, como o crescimento tampão de baixo teor de sal, também podem ter variações substanciais da densidade se o crescimento continua muito mais tempo do que 2 horas. Em contraste, GUVs produzidos por inchaço assistida-gel de proteína têm uma densidade extremamente uniforme, mesmo em tampões fisiológicos. No entanto, a fracção de vesículas multi-lamelares é maior, e de agarose auto-fluorescência baixa complica a quantificação de proteína de densidades ^16. Usando álcool polivinílico em place de agarose foi relatado para melhorar o rendimento GUV-assistida gel quando lipídios foram depositados a partir de clorofórmio ^20, mas não fomos capazes de produzir GUVs utilizando álcool polivinílico com soluções de SUV. Se um menor rendimento de GUVs livres de defeitos é aceitável, inchaço assistida-gel tem uma vantagem clara para experiências que requerem uma distribuição uniforme de proteína.

Eletroformação e inchaço assistida-gel também têm diferentes necessidades de equipamentos. O protocolo inchaço assistida-gel utiliza pouco equipamento especializado, excepto para o filtro de plasma, que não é essencial uma vez que existem muitos métodos alternativos para a produção limpo, hidrófilo vidro. Em contraste, eletroformação requer uma câmara de costume com eletrodos de fio. Wire Platinum é caro, mas para este protocolo GUVs cresceu mais rapidamente do que os fios de platina com titânio e GUVs não crescem em ITO desliza ao usar concentrações fisiológicas de sal. O diâmetro dos eléctrodos (0,5 mm) é um compromise entre a superfície do eletrodo e preço. A câmara mostra a Figura 2 é baseado em um projeto por Luis Bagatolli ¹⁵ e Ernesto Ambroggio, e foi usinado de politetrafluoretileno (PTFE) para permitir a limpeza com a maioria dos solventes. No entanto, poliacetal ou cloreto de polivinilo (PVC) também deve funcionar bem. A capacidade para remover os fios de platina para a limpeza agressiva é importante, e quando o primeiro protocolo de aprendizagem, é muito útil ser capaz de observar o crescimento GUV in situ através da tampa corrediça inferior. O menor, fechado poços evitar solução de chapinha para trás e para a frente e também permitir que os testes de várias composições de lípidos em paralelo. No entanto, uma câmara de costume especial não é essencial quando se inicia. Por exemplo, as câmaras simples, única poços pode ser improvisado por aderência dois fios para baixo para o fundo de uma pequena caixa de Petri, ou com lacre para sanduíche los entre duas lâminas de vidro, ou picando-os simplesmente através da tampa de um frasco pequeno.

Tanto o eletroformação e protocolos inchaço assistida-gel deve produzir um número suficiente de GUVs sem defeitos para micro-manipulação e experiências de patch-clamp. No entanto, o rendimento GUV depende sensivelmente a formação da pilha, quando a bicamada solução SUV é parcialmente desidratado. Se forem encontradas dificuldades em GUVs crescentes (ou seja, nenhuma ou poucas GUVs são visíveis na câmara de crescimento), que pode ser muito útil para crescer apenas GUVs-lipídicas utilizando uma solução de lípido / clorofórmio em lugar de SUVs ^15,16 (e um baixo tampão sal). Se GUVs não crescem bem a partir de um filme lipídico / clorofórmio, em seguida, algo fundamental está errado (por exemplo, soluções lipídicas incorretos ou tampões, graxa ou sujeira nos eletrodos, de frequência ou tensão incorreta, etc.). No entanto, se GUVs crescer a partir de filmes de lipídios / clorofórmio, mas não os filmes SUV, então o problema é provável que seja com a desidratação parcial.

O passo de desidratação parcial émais facilmente otimizado usando lipídicas apenas SUVs, porque não há risco de "desnaturação" lipídios por desidratação excessiva. Para eletroformação, ele pode ser útil para examinar os fios após as gotículas de SUV foram autorizados a secar para verificar há fluorescência lipídico brilhante em cada ponto onde uma gota foi depositado. Se a fluorescência lipídico desaparece após a câmara é cheia com uma solução de crescimento, em seguida, a solução de crescimento tem de ser adicionado mais cuidadosamente, ou os SUVs precisa desidratar por mais tempo, o filme dá mais firmemente ao fio. Durante o crescimento, certifique-se nem a fios nem solução movimento dentro da câmara (por exemplo, quando colocar a câmara no microscópio) para evitar descascar GUVs fora os fios. Quando GUVs crescer bem, eles são geralmente fáceis de ver em imagens de contraste de fase. No entanto, muitas vezes são menores GUVs mais clara usando fluorescência de lípidos, que também é útil para se ver como a pilha membrana foi alterado durante o crescimento. Examine todas as superfícies deos fios (dentro, fora, superior e inferior) em todos os poços, bem como o assoalho da câmara antes de descartar o crescimento, porque os rendimentos podem variar consideravelmente de um local para outro.

A movimentação e armazenagem de GUVs é simples em comparação com as células, mas GUVs são bastante sensíveis ao estresse osmótico, as forças de cisalhamento e aderência. Suaves, movimentos suaves são importantes quando da retirada ou transferência GUVs, e é importante para passivate superfícies para evitar GUVs de aderir e explodindo. No entanto, para experiências de fixação de remendo da câmara deve ser cuidadosamente lavados após passivation para que a solução passivation não pode revestir as pipetas de patch e prevenir a formação de gigaseal. Para passivação, o tratamento com beta-caseína é simples e eficaz, e em comparação com albumina de soro de bovino, que tem uma função de transporte de lípidos, a beta-caseína tem interacções mais limitadas com bicamadas lipídicas e devem ser preferidos quando se trabalha com GUVs ^36. Ao variar o tempo de incubação, épossível obter GUVs a aderir sem explodir. No entanto, os GUVs não irá aderir à lâmina de cobertura tão firmemente quanto células, e portanto, o cuidado ainda deve ser tomado durante qualquer procedimento que pode induzir o fluxo na câmara (por exemplo, tampão de perfusão, que se deslocam da câmara).

Gravação de patch-clamp é um método clássico para o estudo de canais iônicos dependentes de voltagem como KvAP e este protocolo é derivado de técnicas padrão para a obtenção de "dentro para fora" manchas de células aderentes. Um patch-clamp set-up padrão em que a pipeta remendo desce obliquamente (eg, 30-60 graus da horizontal) em uma pequena placa de Petri deve funcionar bem. No entanto, imagens mais nítidas da pipeta patch e região gigaseal pode ser obtido utilizando uma câmara na qual desliza formar coberturas de topo e da câmara inferior (~ separação de 1 mm), de modo que a pipeta patch pode introduzir horizontalmente a partir do lado. Devido à pressão de pipeta grande mancha não são necessários, a pressão pode ser convenientemente controlled com uma seringa e monitorado com qualquer medidor de pressão simples (por exemplo, manómetro de água improvisada). Pode ser útil para a prática de experimentos primeiro patch clamp com GUVs somente lipídicas produzidas usando uma solução de lípidos / clorofórmio e tampão de baixo teor de sal. Como o rendimento de GUVs sem defeitos é muito alto, haverá muita GUVs perfeitas para trabalhar com mesmo que muitos são destruídos durante a colheita e transferência para a câmara experimental.

Com um pouco de prática, pedaços de membrana excisadas com gigaseals estáveis ​​podem ser facilmente obtidos a partir DPhPC GUVs e KvAP-DPhPC GUVs. Para conseguir uma alta taxa de sucesso, que ajuda a selecionar cuidadosamente round, mas ligeiramente-flutuante, GUVs livres de defeitos e verifique se a pipeta patch é limpo (à procura de lipídios na fluorescência) antes de tentar formar o gigaseal. Quando uma membrana de "língua" entra na pipeta patch, o gigaseal forma, tipicamente, rapidamente (<1 seg) sem qualquer necessidade de uma forte aspiração ou especific tensão exploração. Enquanto um selo de ruim pode melhorar à medida que a membrana se arrasta mais para dentro da pipeta patch, muitas vezes o selo permanece pobre porque o interior da pipeta foi contaminado e é necessário começar de novo com uma pipeta de remendo fresco e GUV. Formas muito estáveis ​​pedaços de membrana (dezenas de minutos), com uma excelente resistência à vedação mesmo com tensões elevadas (por exemplo, ± 150 mV) DPhPC. SOPC: colesterol (3: 1 por mole) também podem formar manchas muito estáveis ​​mas podem requerer maior sucção para selar, enquanto os patches ovo PC-parecem quebrar mais facilmente.

Para as sessões de patch-clamp mais longos, pode ser necessário ajustar a osmolaridade da solução câmara. Se a osmolaridade é muito menor do que o tampão de crescimento GUV, GUVs ficar inchadas, tenso e esférica e pode não ser possível aspirar a membrana GUV longe o suficiente para a pipeta de emplastro, para formar uma gigaseal. Isso muitas vezes pode ser corrigido por simplesmente esperar 10 ou 20 min de evaporação a partir da câmara aumenta a extsolução Ernal osmolaridade até as GUVs esvaziar e começar a flutuar. Por outro lado, se a câmara for deixada aberta por muito tempo a osmolaridade da solução externa pode aumentar até GUVs desinflar, tubulate e broto. Isto pode ser evitado através do bloqueio da câmara de evaporação (por exemplo, com óleo mineral) ou periodicamente adicionando água destilada para substituir a água que se evaporou.

Porque as proteínas podem ser excluídas pedaços de membrana excisados ^​​31, o número de canais activos numa remendo excisado não está simplesmente relacionado com a densidade de proteína na membrana GUV. As medições de fluorescência sugerem a concentração de KvAP na membrana remendo é muito menor do que o GUV ²⁸ e que pode ser muito fácil de obter emplastros contendo apenas um pequeno número de canais. No entanto, se emplastros contêm muitos canais para a gravação de um único canal, os passos óbvios de remendo utilizando pipetas com pontas menores e / ou diminuindo o d-a proteína-lípidoensity no mix SUV são eficazes. Em contraste, a realização de medições do conjunto de emplastros contendo muitos canais, pode ser útil para começar com uma densidade relativamente elevada de proteína (por exemplo, 1:10, proteína e lípido em peso), utilizar a fluorescência de proteínas para seleccionar GUVs com uma alta densidade de proteína , utilizar pipetas remendo maiores (por exemplo, 2 a 3 micron de diâmetro de ponta) e aspirado rapidamente para tentar formar o selo rapidamente. Claramente, o "de célula inteira" configuração do tipo (ou seja, "todo-GUV ') seria ideal para caracterizar todos os canais em um GUV, mas, infelizmente, o" todo GUV-"configuração coloca vários problemas técnicos ^37.

As soluções, lipídios e concentrações de proteína neste tutorial são meramente fornecido como um ponto de partida, e pode ser alterado para se adequar às necessidades de uma experiência particular seguintes algumas considerações.

Todas as soluções devem incluir um tampão de pH, tais como HEPESou TRIS para assegurar proteínas não estão expostas a extremos de pH. O tampão deve ter como SUV baixo uma concentração de solutos como a proteína tolerará (por exemplo, sal de 5 mM ou inferior), como concentrações de soluto aumentado durante o passo de desidratação parcial e concentrações elevadas de sal podem desnaturar a proteína ou fazer com que o filme de lípidos para rapidamente delaminate durante a etapa de reidratação. Pequenas quantidades de açúcares tais como a trealose (por exemplo, 1 a 5 mm) são pensadas para proteger a proteína durante a desidratação ^23. Enquanto trealose tem sido implicada na dessecação e acredita-se proteger contra proteínas da membrana e dissecação ^38, sacarose ou glicose podem funcionar igualmente bem.

Para o buffer de crescimento, a concentração de sal é especialmente importante, pois isso vai influenciar os parâmetros para o crescimento GUV ideal (por exemplo, tensão eletroformação, frequência e duração). Em contraste, a principal restrição para o buffer de observação é tchapéu, devem ter a mesma osmolaridade que o tampão de crescimento. A inclusão de sacarose e / ou glucose no "tampão de crescimento" e "buffer de observação" pode ser útil para assegurar GUVs sedimentos para o fundo da câmara de observação, enquanto que uma diferença de índice de refracção entre GUV interior e exterior com ajuda de contraste de fase ou microscopia DIC. Electrophysiologists muitas vezes incluem cálcio ou magnésio íons para as soluções de banho e / ou correção de pipetas para aumentar a formação gigaseal com membranas celulares, mas estes não parecem ser essenciais para GUVs. Com efeito, os iões divalentes, tais como magnésio e cálcio pode induzir a separação de fases lipídica e facilitar a adesão, por isso, se surgem estes problemas, pode ser útil adicionar o EDTA a 1 mM.

Claramente, uma atracção chave de sistemas reconstituídos quando comparada com células é a capacidade para controlar a composição do lípido. DPhPC GUVs crescer bem e de forma estável pedaços de membrana extirpados, e esses protocolos também trabalharam efcazmente para as misturas lipídicas contendo fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilserina (PS) e colesterol. No entanto, o crescimento GUV é sensível a ambas composição lipídica e isola a ^15, e por isso os parâmetros do protocolo (por exemplo, quantidade de lípido depositado, eletroformação tensão / frequência) pode necessitar de ser ajustado para as misturas lipídicas contendo altas concentrações de PE, carregada lípidos (PG, PA, PS), ou colesterol. Ao iniciar-se, Egg-PC, DOPC ou DPhPC são uma boa primeira escolha, e também é muito útil para incluir um lipídio fluorescente para observar o crescimento GUV e distinguir GUVs de vesículas mui com duas ou mais camadas duplas. Misturas de lipidos podem ser preparadas por combinação de suspensões de SUV de soluções de reserva, como os lípidos misturar durante o passo de desidratação parcial (desde que a temperatura é mais elevada do que qualquer indivíduo temperatura de transição de fase). Usando maior concentração SUV (por exemplo,10 mg / ml) soluções de reserva permite uma flexibilidade considerável, e estes podem então ser diluída para 3 mg / ml antes da desidratação da suspensão.

Se a tentativa de adaptar estes protocolos para outras proteínas trans-membrana, que é muito importante para ser capaz de observar directamente tanto a incorporação de proteína para o ensaio de proteína GUVs e função. Embora não seja um problema com KvAP, há sempre a possibilidade de que durante o passo de re-hidratação da proteína trans-membrana permanecerá na pilha membrana levando à formação de GUVs apenas em lípidos. Marcação fluorescente da proteína é muito conveniente, uma vez que fornece uma maneira rápida e inequívoca para observar a incorporação de proteína em GUVs e também verificar se há agregação dentro GUVs. É também muito importante para testar a função da proteína nas GUVs para confirmar que a proteína não foi danificado durante o processo de reconstituição. Para os canais iônicos como KvAP, medições de patch-clamp pode estabelecer a presença de canais funcionais noGUVs. No entanto, um fluorescentemente marcado, o ligando de alta afinidade (por exemplo, toxina, substrato ou anti-corpo) também seria muito útil para testar o estado de proteínas em GUVs.

Em resumo, este artigo demonstra como produzir PROTEO-GUVs contendo o canal de potássio voltagem fechado KvAP e caracterizá-los usando microscopia de fluorescência e eletrofisiologia. Esperemos que estes métodos podem ser adaptados às novas classes de proteínas de membrana e fornecer uma base para sistemas mais complexos in-vitro para estudar e construir matéria viva de seus componentes fundamentais.

The authors have nothing to disclose.

We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).