Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 'da dupla e ADN de cadeia simples quebra ^12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. ^1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido ^7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios ^6,14,29 e cardiomiócitos ^43,44, morte celular neuronal excitotóxica ^30,31, e como biomarcador no tratamento da artrite ^39. Também tem sido utilizada como um factor de prognóstico e marcador de células tumorais em vários cancros humanos ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Existem métodos alternativos para a detecção de danos ao DNA e morte celular, mas eles têm desafios técnicos e advertências. Southern blotting pode ser usado para quantifdanos no DNA y em tecido lisados ​​inteiras ^7,9-11, mas este método não fornece resolução de nível celular e é difícil de quantificar. O ensaio do cometa é um método baseado em células alternativa que requer a extração de núcleos preservados a partir de células ^4,20,28,36. Embora o ensaio do cometa funciona bem em células de cultura isoladas, é muito mais difícil de preparar os núcleos intactos a partir de tecido muscular esquelético ^8,21. Tal como acontece com Southern blot, o ensaio do cometa não fornece informações específicas do tipo de células a partir de um homogeneizado de tecido músculo inteiro. Uma outra alternativa para o método de TÚNEL é imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o ADN de cadeia simples ^25,33,41 ou contra proteínas que participam em vias de resposta ao dano de ADN e morte celular (por exemplo, p53, H2AX, e caspases) ^13,17,22,40. Tais métodos com base em anticorpos requerem caracterização exaustiva de anticorpos e excelente especificidade do anticorpo para se obter uma elevada relação de sinal-para-fundo. Mesmo quando especificaçãoexistem anticorpos ific, podem exigir a desnaturação da proteína-alvo através de procedimentos de recuperação antigênica ^34,35. Enquanto discutimos aqui, recuperação antigênica em resultados de tecido muscular em inaceitavelmente elevado autofluorescência. Ao contrário dos métodos alternativos, TUNEL atinge a detecção de danos do ADN com um sinal alto e baixo fundo, excelente especificidade que pode ser testado com os controlos positivos e negativos simples, boa penetração nos tecidos que não necessitam de recuperação de antigénios, e resolução de nível celular. Além disso, o método de TÚNEL demora cerca de 4 horas para se completar, enquanto que os métodos alternativos tipicamente requerem incubações durante a noite.

Estudamos a morte de células do músculo esquelético em um modelo de rato de atrofia muscular espinhal (AME) ¹⁰ que foi gerado por Hsieh-Li e seus colegas ^16. Para quantificar as células apoptóticas no músculo, temos desenvolvido um método de preparação do tecido, de coloração e quantificação que funciona de forma robusta através skele diferenteTal grupos musculares em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento em ratinhos. Nós usamos um kit TUNEL-rotulagem comercialmente disponíveis e software de análise de imagem disponível no mercado. Temos também utilizado com sucesso o ensaio TUNEL em combinação com coloração de imunofluorescência na medula espinal ^10.

Os métodos descritos aqui são úteis para investigadores que desejam apreciar a patologia do tecido, os mecanismos de doença, os mecanismos de envelhecimento, e desenvolvimento (pré- e pós-natal) morte celular no músculo esquelético. A técnica de TUNEL é especialmente útil para estudos de lesão e reparação do ADN e morte celular em sistemas-modelo em que apenas um subconjunto de células é afectado e resolução a nível celular é necessária.

Este vídeo descreve a dissecção, processamento de tecidos, corte, e com base em fluorescência TUNEL rotulagem de rato músculo esquelético. Ele também descreve um método de semi-automatizado de TUNEL sinal de quantificação.

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde ^26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins.

1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação

1. Sacrifique um rato neonatal por inalação de _CO2.
2. Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina afiada e posteriormente seção em um criostato.
3. Inserir o membro posterior em 10 mL de gelo frio paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de 15 ml.
4. Imersão fixar o membro posterior em paraformaldeído durante 4-24 h a 4 ° C. Tecido embrionário requer apenas algumas horass de fixação.
   1. Evite fixação mais de 24 horas, pois isso pode reduzir a eficiência TUNEL ensaio.
5. Cryoprotect o membro posterior por imersão em solução de sacarose.
   1. Mudar de paraformaldeído a 10% de sacarose em PBS no mesmo tubo de 15 ml, incubar durante a noite a 4 ° C.
   2. Alterar a 30% de sacarose em PBS, incubar durante a noite a 4 ° C ou até que as pias dos membros posteriores para o fundo do tubo. Tecido podem ser deixadas em sacarose a 30% durante um período mais longo, desde que a sacarose tenha sido esterilizada por filtração.

2. Inclusão do Tecido

1. Encher um meio caminho marcado molde a incorporação com a incorporação de média.
2. Coloque membro posterior no topo do meio de fixação, com o lado do corte tão perto quanto possível a uma parede do molde. Marque a orientação do membro posterior do lado de fora do molde.
   1. Incorporar vários membros posteriores e cortar no mesmo bloco. No entanto, é importante para assegurar que todas as hindlimbs do bloco são orientados paralelamente uns aos outros para obter secções em níveis correspondentes ao longo do eixo do membro.
3. Cubra hindlimbs com a incorporação de média. Se hindlimbs deslocar ao derramar o meio, re-orientá-los com pinças atraumáticas ou um palito.
4. Permitir a incorporação de forma a infiltrar-se o tecido à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min.
5. Coloque moldes diretamente em gelo seco ou em isopentano em gelo seco para congelar a incorporação médio. Certifique-se de manter o nível de moldes em todos os momentos e evitar o deslocamento do tecido incorporado.
6. Mantenha moldes congelados a -80 ° C até que esteja pronto para cortar, por até vários meses.

3. cryosectioning incorporado Limbs

1. Ajuste temperatura da câmara de criostato para -20 ° C, temperatura do objecto a -18 ° C; ajustar a temperatura do objeto para baixo, conforme necessário.
2. Equilibrar o bloco de tecido no interior da câmara de criostato para, pelo menos, 30 min. Temp bloco corretoratura é crucial para a qualidade do corte.
3. Os cortes transversais a uma espessura de 10 pm ou menos. Seções mais espessos não será totalmente penetrado por reagentes TUNEL. Use a placa anti-roll, lâminas, e ângulo de lâmina (geralmente 5 °) recomendado para o criostato.
4. Recolhe secções em lâminas de vidro ou gelatin- vectabond-revestidos à temperatura ambiente. Coloque imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Mantenha a caixa de slides em um recipiente separado com gelo seco colocado perto do cryostat ao alcance do braço.
   1. Os cortes transversais de série através do longo eixo do membro, pulando 100-200 mm. Coletar pelo menos três seções adjacentes em cada nível de série.

4. TUNEL Ensaio sobre Seções hindlimb usando um kit comercialmente disponível (todos os passos à temperatura ambiente, salvo indicação)

1. Descongele lâminas com cortes à temperatura ambiente e secar durante a noite ou no fim de semana.
2. Reidratar seções por immersing lâminas em PBS para 2 x 10 min em uma jarra de Coplin. Seque com um laboratório de limpar, removendo o máximo de líquido ao redor da seção possível.
3. Seções permeabilizar
   1. Utilizar um não proteolítico, reagente à base de saponina comercial ou 0,5% de Tween 20 e 0,05% de Triton X100 em PBS.
   2. Coloque o slide em uma câmara de umidade. Uma câmara de humidade é uma simples caixa vazia ponta da pipeta com uma tampa estanque, com água apenas suficiente adicionado para cobrir o fundo da caixa.
   3. Pipeta reagente suficiente para o slide para cobrir a seção (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Não pipete diretamente na seção, como agitação repetida pode causar a seção para retirar a slide.
   4. Utilizando uma pinça de ponta romba, coloque um pequeno retângulo de parafilm no topo da seção para se espalhar a gota de reagente e cobrir completamente a seção. Se as bolhas de formar sob a parafilm, levante suavemente-lo fora, seca, e reaplicar.
   5. Incubar as lâminas com permeabilireagente zação durante 1 hora em câmara úmida coberta. Se as secções começam a levantar a partir do slide, tempo de permeabilização pode ser reduzido para 30 min.
   6. Lavar as lâminas em PBS em uma jarra de Coplin 2 x 5 min. Os rectângulos parafilme deve flutuar para o topo e pode então ser removido e descartados.
   7. Usando um laboratório de limpeza, seque o máximo de líquido ao redor das seções quanto possível.
4. Rotulagem pausa DNA TdT mediada
   1. Siga as instruções do kit para fazer tampão de marcação 1x TdT, tampão de marcação suficiente pipeta para o slide para cobrir a secção de tecido (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. Como alternativa, mergulhe o slide no tampão de marcação TdT em um frasco coplin.
   2. Siga as instruções do kit para fazer TdT mix rotulagem. O kit inclui cobalto, magnésio, e catiões de manganês; o catião manganês funciona bem em uma variedade de tecidos, incluindo músculo esquelético, sistema nervoso tissues, fígado, pele e osso.
   3. Para um controlo positivo, adicionar DNase (rotulado "nuclease" no kit) para a mistura de marcação de TdT. Alternativamente, pré-tratamento de uma secção de controlo positivo com ADNase em tampão de nuclease durante 1 hora a 37 ° C, de acordo com as instruções do kit. Mantenha solução DNase e seções tratado com DNase longe de outras seções experimentais para evitar a contaminação cruzada.
   4. Para um controlo negativo, omitir enzima TdT da mistura de marcação.
   5. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto tampão de marcação a partir do slide TdT quanto possível. Pipeta TdT mistura de marcação sobre a lâmina (50 ul por ponto), cobrir com uma nova rectângulo de parafilme, e incuba-se a câmara de humidade a 37 ° C durante 1 h.
   6. Siga as instruções do kit para fazer tampão de paragem 1x. Usar um laboratório de limpar para remover TdT mistura de marcação a partir do slide, e adicionar ul de tampão de paragem 200-300 para cobrir a secção de tecido, e incuba-se a câmara de humidade durante 5 min. Al ternatively, mergulhe o slide em tampão de parada em uma jarra de Coplin.
   7. Lava-se a corrediça 2 x 2 min em PBS. Usar um toalhete de laboratório para remover o máximo de PBS a partir do slide quanto possível.
5. Marcação fluorescente
   1. Siga as instruções do kit para preparar solução de etiquetagem fluoresceína para rotular dNTPs em quebras de DNA. Pipeta solução para o slide (50 ul por seção), cubra com um novo retângulo de parafilm, e incubar na câmara úmida por 20 min.
   2. Wash slides para 2 min em PBS em uma jarra de Coplin. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto quanto possível PBS a partir do slide.
   3. Diluir a Hoechst 33258 corante nuclear de 1 ug / ml em PBS e pipeta sobre a lâmina (100-200 uL é suficiente para cobrir a secção). Incubar na câmara de humidade durante 5 min.
   4. Lavar 3x durante 5 min em PBS.
   5. Lamela com Antifade meios de montagem de fluorescência e selar as bordas com unha polonês.

1. Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência convencional com DAPI, FITC, e filtros de Texas Red (ou equivalente). Use um objetivo maior ampliação (20x ou 40x) para verificar se a rotulagem foi bem sucedida e núcleos (inteiros ou fragmentados) foram marcadas. Uma objectiva 10X é suficiente para a quantificação de pontos lacrimais TUNEL positivo.
2. Coletar imagens da coloração Hoechst, TUNEL, e sinal autofluorescent como três canais de cores falsas separadas combinadas em uma única imagem. Se a etiqueta de TUNEL fluoróforo é verde, do sinal de imagem autofluorescente no filtro vermelho, e vice-versa.
   1. Mantenha todas as configurações de imagem equivalente entre os slides para thresholding e quantificação subsequente. Para cada filtro, horários predefinidos e exposição registro, ganho e binning (sem binning é melhor); não usar as configurações de exposição ou de ganho automático.
   2. Use tentativa e erro para encontrar as configurações de exposição e ganho que melhor capturam a gama de intensidades em todas as lâminas coradas. Certifique-se de que não existem pixels saturadas nas imagens adquiridas, já que esta quantificação viés vontade.
3. Tome imagens de todo o grupo muscular de interesse. Isso pode exigir várias imagens para ser "costurado" juntos.

Análise 6. Imagem

1. Use programas de análise de imagem disponíveis no mercado para analisar imagens digitais de coloração TUNEL. Análise utilizando software comercial é mostrado aqui. Em alternativa, o software ImageJ livre de NIH pode ser usado para analisar a coloração TUNEL.
2. Manchar uma seção ao lado da seção manchada de TUNEL com HE (H & E) e dar uma imagem digital de seção plena com um microscópio de campo claro convencional. Use esta imagem H & E em combinação com um atlas de anatomia ^5,18,19 traçar as estruturas anatômicas a serem quantificados.
3. Com o canal de TUNEL desligado, rastrear manualmente o contorno da área a ser quantificado, utilizandoHoechst e canais autofluorescência de orientação. Converter a área rastreada em uma máscara (um conjunto de pixels selecionados coordena a ser analisado).
4. Ligue o canal de TUNEL. Usando a intensidade função limiarizar no programa de análise de imagem, definir o limite inferior a excluir qualquer sinal autofluorescência.
5. Aplicar as mesmas configurações de limite para todas as imagens no set estudo. Converso seleções limiarizadas em máscaras.
6. Para cada imagem, combinar a máscara da área do músculo ea máscara TUNEL. A nova máscara combinação irá representar sinal TUNEL dentro apenas a área do músculo rastreado.
7. Realizar a quantificação da máscara na máscara de combinação para determinar o número de objectos e da área do sinal de TUNEL dentro da área muscular rastreada objeto. Realize esta usando a função de analisador de partículas em ImageJ.

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O controlo positivo (ADNase adicionada) deve apresentar o sinal de TUNEL positivo abundante, distribuído uniformemente em todos os tecidos na secção (Figura 1C). O controle negativo (enzima TdT omitido da reação) deve render fundo de baixa intensidade e sinal autofluorescent apenas (Figura 1D). Pele, proporciona um controlo positivo interno em secções de perna inteiros, como esse tecido tem uma alta taxa de apoptose normal (Figura 1A).

Sangue vermelhocélulas do osso, células endoteliais, e pode contribuir sinal autofluorescente significativa (Figura 2). Aconselha-se a imagem de cada seção em um canal separado sem marcação fluorescente para garantir que autofluorescência não é confundido com sinalização TUNEL positivo. Sinal de TUNEL positivo verdadeiro deve ter muito maior intensidade do que a autofluorescência, de modo que possa ser isolado por meio de estabelecimento de limiares de intensidade de imagem (Figura 2A, linha média). Alternativamente, o canal pode ser autofluorescente digitalmente subtraído do canal de TUNEL para produzir o sinal de TUNEL positivo (Figura 2A, linha inferior).

O método de marcação TUNEL aqui descrito foi usado para quantificar a morte de células do músculo esquelético, em um modelo de rato de SMA ^10. Rotulagem TUNEL mostra um aumento no número de perfis apoptóticos em músculos da perna, de 5 dias de idade os ratos SMA, em comparação com controlos da mesma ninhada (Figura 3A). O aumento em apoptose équantificável pelo método descrito acima, indicando diferenças estatisticamente significativas em vários grupos musculares (Figura 3B).

Figura 1: rotulagem TUNEL Representante dos músculos dos membros posteriores do mouse. (A) TUNEL marcado secção transversal do membro posterior do rato mostrando músculo tibial anterior, tíbia, e pele. TA - tibial anterior, Fdl - flexor longo dos dedos, Edl - extensor longo dos dedos. Green - TUNEL, azuis - núcleos, vermelho - sinal autofluorescent. As linhas pontilhadas delinear áreas musculares para quantificação. Pele adjacente músculos dos membros posteriores fornece um controle interno positivo para a rotulagem TUNEL. Barra de escala = 200 mm. (B) representativos imagens de alta ampliação identificando TUNEL-positivo estruturas (verde) em embrionário dia 13 de rato músculo esquelético como núcleos apoptóticos. Escala da barra = 10 m. A e B modificada a partir Fayzullina e Martin 2014 ^10. (C) de secção transversal do membro posterior do rato TUNEL marcado após o tratamento de DNase para servir como um controlo positivo. A maioria dos núcleos têm rotulagem TUNEL brilhante. Escala da barra = 50 m. (D) Secção transversal do mesmo membro posterior do rato como se mostra em C (semi-adjacente a secção em C) TUNEL marcado com enzima TdT omitido para servir como um controlo negativo. Não há sinal de TUNEL-positivo brilhante; o único sinal verde é autofluorescência como detectado por co-localização com sinal no canal vermelho. Barra de escala = 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: A autofluorescência do tecido deve ser considerado e excluídos da quantificação na análise de rotulagem TUNEL. (A) seção transversal hindlimb Rato com rotulagem TUNEL e autofluorescência: imagem original (topo de linha), a mesma imagem com os limites ajustados (linha do meio), e mesma imagem com autofluorescência canal (vermelho) subtraído (linha de fundo). Thresholding elimina celular mais vermelha do sangue e autofluorescência de células endoteliais, mas não o artefato coloração (ponta de seta, linha do meio). Subtração Canal também elimina o artefato coloração (ponta de seta, linha inferior). Green - TUNEL, vermelho - autofluorescência, azuis - núcleos. Barra de escala = 100 pm. Imagem Maior ampliação do painel autofluorescência vermelho retângulo cinza delineia área ampliada em B. (B) em A. Glóbulos vermelhos e algumas células endoteliais (setas), e uma TISSue coloração artefato (seta) autofluoresce em ambos os filtros de fluorescência vermelha e verde. Barra de escala = 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: rotulagem TUNEL mostra a morte de células no músculo esquelético de ratos SMA neonatais músculos da parte inferior dos membros posteriores de ratos SMA em dia pós-natal 5 foram marcadas pelo método TUNEL (A) rotulagem TUNEL mostra vários perfis apoptóticos em vários grupos musculares em SMA mouse.. músculo (direito) em comparação com o controlo da mesma ninhada (esquerda). Green - TUNEL, azul - Hoechst (núcleos), vermelho - autofluorescência. As linhas pontilhadas delinear as áreas musculares quantificados. TA - tibial anterior, Fdl - dig flexoritorum longus, Edl - extensor longo dos dedos. Barras de escala = 200 pm rotulagem. (B) TUNEL foi quantificada como a área total de pixels de sinal de TUNEL normalizada para a área total de pixels de músculo. Médias ± erros padrão são ilustrados, n = 4 - 5 ratinhos. A significância estatística entre SMA e de controlo para cada grupo muscular (unicaudal t-teste): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Este valor foi modificado a partir Fayzullina e Martin 2014 ^10. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um sistema de computador para análise de imagens.

O pesquisador deve estar ciente dos perigos potenciais. Autofluorescência do tecido é uma grande preocupação em imagens de fluorescência. Em animais não perfundidada, mantendo-se os glóbulos vermelhos contribuirá sinal bastante elevado autofluorescent. As células endoteliais também podem ser significativamente autofluorescente. Portanto, é importante para confirmar que a autofluorescência não é confundido com o sinal de TUNEL positivo. Esta avaliação é realizada facilmente, tendo uma imagem em um canal sem fluorophore, a ser utilizado para comparação e possível subtracção do canal de TUNEL positivo. Desta forma, o método de TÚNEL à base de fluorescência é superior aos métodos de microscopia de campo claro colorimétricos que não proporcionem um controlo interno para a coloração de fundo.

Fixação do tecido terá um impacto significativo no sucesso da rotulagem TUNEL. É melhor para minimizar o tempo de fixação em paraformaldeído, para não exceder 24 horas. Tecido embrionário e neonatal, serão necessários tempos de fixação significativamente menores do que 24 horas.

Quando marcação TUNEL é bem sucedido, o sinal de TUNEL positivo deve ser muito maior do que o fundo da autofluorescência, de modo que o sinal pode ser facilmente isolado por intensidade de limiar de propagação usando software de análise de imagem. Recuperação de antigénios utilizando o protocolo padrão de aquecimento em tampão citrato ^27,35 pode melhorar ligeiramente sinal de baixa TUNEL se o tempo de aquecimento é mantido a um mínimo (5 min), mas este pré-tratamento de dezds para reduzir o sinal de TUNEL, se o aquecimento for prolongado por períodos mais longos (por exemplo, 20 minutos a 95 ° C). Recuperação antigênica aumentará autofluorescência de fundo e falsos positivos, e, portanto, pode anular quaisquer ganhos na relação sinal-ruído de sinal aumentado TUNEL.

As medições de sinal TUNEL deve ser normalizada quer para a área total do músculo ou quantificada com o número de núcleos por área quantificada. Porque TUNEL mede núcleos apoptóticos, a normalização ideal seria núcleos totais. No entanto, mesmo em 10 (um) seções musculares relativamente finas, as fibras musculares e núcleos são tão numerosas e embalado tão de perto, que é impossível contar automaticamente núcleos Hoechst-manchadas por thresholding e de separação de partículas algoritmos. Contagem manual também é muito trabalhoso e impreciso. A alternativa viável é a normalizar a área total do músculo.

O ensaio de TUNEL, utilizado com o processamento do tecido apropriadotécnicas e os controlos positivos e negativos, é um método relativamente rápido, reprodutível, quantitativo para a detecção de danos no ADN e morte celular em tecidos. Ele pode ser usado para confirmar a apoptose como um mecanismo patológico, para identificar os tipos de células afectadas, e para avaliar a eficácia dos tratamentos terapêuticos. Este procedimento será de valor para pesquisadores nas áreas de doença do músculo esquelético e lesões, incluindo SMA, ALS, distrofia muscular, miopatia induzida pela toxina, e fisiologia do exercício.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02.

We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.